İki Kurbağa Sperm Chemoattraction saptamak için Tahliller Türleri

Summary

Yumurta ve yumurta etrafında ekstrasellüler kaplamaları sık sık böylece döllenme teşvik yumurta sperm ile iletişim kurmak için onlara rehberlik etmek, peptidler, proteinler ve küçük moleküllerin bırakın. Kurbağa sperm sperm birikimi testleri ve sperm izleme testleri - sperm chemoattraction algılamak için kullanılan iki sınıf testleri tanımlamak ve karşılaştırmak.

Abstract

Sperm chemoattraction omurgasızlarda bir sperm süspansiyonu içine çekici peptid içeren bir pipet yerleştirmek ve mikroskobik pipet yaklaşık ¹ sperm birikimi imgeleyebileceğiniz kadar güçlü olabilir. Kurbağa, kemirgenler ve insanlar gibi omurgalıların Sperm chemoattraction tespit etmek daha zordur ve kantitatif testleri gerektirir. - Bu tür testlerin başlıca iki tip bir kemoatraktan kaynağı, sözde sperm birikimi deneyleri, aslında bireysel sperm yüzme yörüngeleri takip deneyleri, spermin hareket Asitli deneyleri.

Sperm birikimi deneyleri böylece doz yanıt eğrileri ve zaman içerisinde nispeten hızlı bir şekilde yapılmasını sağlayan, nispeten hızlı bir şekilde sağlayan onlarca veya yüzlerce tek bir gün içinde yapılması gereken testleri. Bu tür testlerin çok iyi kurulmuş chemoattraction sistemleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bac örneğin, nötrofil kemotaksisiniterial peptitler ve foliküler sıvı sperm kemotaksis. Sperm izleme testleri yoğun emek, ancak chemoattractancts aslında sperm almasını yüzme yolları nasıl değiştirdiğini ek veri sunabilir. Bu tip testin chemoattrractant degrade eksenine göre sperm hareket yönünü göstermek ve karakteristik açar veya yumurta yakın sperm getirmek yönde değişiklikler görselleştirmek için gereklidir.

Burada bu iki tip testlerinin her biri için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. Yararlanılan sperm birikimi testi "iki odacıklı" tahlil denir. Amfibi sperm polikarbonat bir filtre zemin ile 12 mikron çapında gözenekleri olan bir doku kültürü tabak eklemek yerleştirilir. Sperm ile ekler içeren doku kültürü, zemin, duvar (bkz. Şekil 1). Karşılar dibine dikkatlice pipetle bir chemoatttractant tampon ve plaka kuyu içine yerleştirilir. Inkübasyondan sonra, sperm rezervuar içeren üst eklemek dikkatle removed ve sperm zarından geçti alt odasında kaldırıldı pelet ve sonra hemasitometre veya akış sitometresinin sayılır.

Sperm izleme testi aslında nötrofil kemotaksisini gözlemlemek için ^2,3 Giojalas ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve sperm gözlem için modifiye bir Zigmond odası kullanır. Haznesi iki dikey olukları işlenmiş içine kalın bir cam slayt oluşur. Bu bir 1 mm genişliğinde bir gözlem platformu tarafından ayrılır. Bir çukur içine bir kapak cam, sperm uygulama yüklendikten sonra, diğer bireysel sperm ve hareket içine kemoatraktan ajan video mikroskobu ile görüntülendi. Video görüntüleri daha sonra yazılımı kullanarak her sperm yörünge süresi (xyt veri setleri) bir fonksiyonu olarak xy düzleminde iki boyutlu hücre hareketlerini belirlemek için analiz edilir.

Protocol

1. Gereç ve kullanılan tamponlar

1. Oosit Ringer Buffer (1,5 x OR2) içeren 124 mM NaCl, 3.75 mM KCl, 1.5 mM CaCl _2, 1.5 mM MgCl _2, 1.5 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM HEPES, pH 7.8. Gübreleme Tampon (F-1) 41.25 mM NaCl, 1,25 mM KCl, 0,25 mM CaCl _2, 0.06 mM MgCl _2, 0.5 mM Na ₂ HPO _4, 2.5 mM HEPES, pH 7.8 içerir.
2. Xenopus laevis yumurta su Sugiyama ve ark göre hazırlanmıştır. ^4. Kısaca tarif jöleli kurbağa yumurta, taze spawned 30 dakika ve mikropipet tarafından kaldırıldı klimalı ortamda küçük bir hacim için F-1 tampon belirdi. "Yumurta su" olarak adlandırılan bu ortam, aynı zamanda, bu jöle özü birincil kemoatraktan saflaştırılmış allurin hazırlamak için kullanılabilir. Sperm ticari olarak yetiştirilen Xenopus laevis veya Xenopus tropicalis elde edilir.
3. T gereken belirli öğeler için malzemeler Tabloo tahlil.

2. Kurbağa sperm kemotaksis için iki odacıklı bir tahlil

1. Ötenazi sağlamak için carborundum kenarlı makas çifti, çift ilik kullanarak başını kesmek, 0.07% Benzocaine içeren suya daldırma kurbağa anestezisi. Uzakta kas maruz karın cilt kesin. Orta hat ve lateral karın kas kesimler yapın ve geri çekin. Bağırsak ve yağ beyaz, fasulye biçimli testis ortaya çıkarmak için hafifçe geri çekin. Uzakta bağ dokusu, kan damarları önlemek için dikkatli olmak ince bir makas kullanarak kesin. Aşırı tampon ve yapışık küçük kan damarlarının kaldırmak için, testis çıkarın 1,5 x OR2 tampon kullanarak herhangi bir kan yıkayacak, sonra filtre kağıdı üzerinde testis rulo, ve sonra, 1.5 x OR2 tampon 0.2 ml plastik Pitre çanak testis. 1,5 x OR2 tampon 2 ml ile 5 ml şırınga doldurun, yavaşça, bir ucunda yüzey üzerinde testis 10-20 delik karıştırmak diğer ucunda iğne yerleştirin ve yavaşça enjekte spermin dışarı atılması için tampon. Alternatif olarak, birspermin dışarı atılması için çıkış delikleri alay ederken tampon enjekte edebilir. Buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüp kesme ucu (sperm kesme kaçınarak) ve yeri bir mikropipet kullanarak sperm süspansiyon aktarın.
2. 1,5 x OR-2 sperm 1:100 seyreltilmesi ve karışık sperm süspansiyonu 20 ul numune alma ve bir hemasitometre ve büyük 1 mm ² alanda kullanarak hücrelerin sayısını sayma ile elde edilen kurbağa sperm sayısını tahmin edin. Hemasitometre sayım ve örnekleme oranını kullanarak, sperm yoğunluğu ve toplam sperm hasat sayısı hesaplar. Bu toplam genellikle 2 - yaklaşık 2 ml hacminde 6 x 10 ⁷ sperm Her iki testis kullanılır . 2 x 10 ⁷ / ml sperm yoğunluğu elde etmek için 1,5 x OR2 tamponu ile stok sperm süspansiyon sulandırınız. 2 ila 3 saat içinde hazırlık testi için sperm kullanın. F-1, faz kontrast optikler kullanılarak tampon ve görselleştirme hareketi ile sperm 1:10 5 ul seyreltilmesi ile sperm motilitesi değerlendirin. Spermin en az 40% 50%hareketli olması gerekir. Uygun hazırlıkları bile olgunlaşmamış çoğu hangi immotil sperm çok sayıda içerecektir.
3. Her kuyuya F1 tampon 700 ul micropipetting yeni bir 24-iyi plastik doku kültürü tabak hazırlayın. Her bir sıra altta çapı yaklaşık 15 mm olmalıdır.
4. Ozmotik şok sperm motilitesi etkinleştirmek için oda sıcaklığında (23 ila 21 ° C) bir mikrosantrifüj tüp içinde sperm süspansiyonu F1 tampon 900 ul 100 ul seyreltilmesi testlerinin bir dizi başlayın. Her zaman taze sperm bu şekilde aktif, sperm 1-2 dakika içinde kullanılması gerekir.
5. Bir 12 mikron porozite takın (12 mm od) yerleştirin bir arabellek dolu iyi, insert yerleştirme, bir tarafına bir boşluk bırakarak merkez dışı olduğundan emin olun. Motilite aktif sperm 400 ul hemen mikropipet kesme ucu olan bir kuyunun içine aktarın. Sperm süspansiyonu filtre takın duvara uygulayın ve inci alt kısmında filtre üzerine çalıştırmak için izine eklemek; sperm süspansiyonu filtre üzerine doğrudan pipetlenir olmamalıdır.
6. Iyi ve merkez dışı filtre takın arasındaki boşluk kuyuya kemoatraktan ajan dikkatlice mikropipet 50 ul. Bir iyi tarafı ve alt sistem için hiçbir rahatsızlık pipet karşılamak ve geri çekme açılan yatırmak için dikkatli olmak gerekir. Özellikle, mikropipet piston sadece örnek ama hiçbir hava kabarcıkları tamamen çıkarmak için ilk durak itti olmalıdır.
7. Başlatan ilk testinin 50 dakika inkübe kadar gerektiği kadar testleri başlatmak için 2.5 ve 2.6 yukarıda adımları yineleyin, sonra plaka kuluçkaya yatmaktadır. Tipik olarak, her 45 ila 60 saniye bir test başlayabilirsiniz. Tahlil deneyimli bir kişi tarafından ya da birlikte çalışan iki kişi tarafından akıcı olabileceğini unutmayın. Bu durumda, testlerin bir veya iki sıra daha büyük bir hareketli sperm stok ve bu sperm sağlayan hızlı pipetleme ile başlanmalıdır 1 ile 2 dakika içinde her zaman kullanılıraktivasyonu.
8. Dizisi her tahlil başladı Dur. İlk olarak, dikkatli bir şekilde istikrarlı bir yandan ve diğer filtre takın dikkatlice en kaldırmak veya mikropipet veya emme pasteur pipet ile üst odasında sperm süspansiyonu. Derhal, ince bir cımbız kullanarak, filtre çekin ve atın. Bakım bu aşamada kullanılması gerekir, en azından kalan sperm sperm geçişi için artifactually değerleri yükselterek filtre ile süpürülerek.
9. Yanı sıra, her plaka, bir mikrosantrifüj tüp tüm sperm süspansiyonu transfer. Sperm yana çekilme dibe çökmemesi için önce iyi sperm süspansiyonu karıştırmak için önemlidir. 0.5% v / v nihai konsantrasyonu% 25 formaldehit 15 ul ekleyin ve sperm sayımı, aynı gün yapılan değilse buzdolabına.
10. Pelet, 2000 maksimum hıza sahip bir kişisel mikrosantrifüj 10 saniye basma düğmesi dönüş kullanarak her bir tüp içerisinde sperm x g. Ama supernat 100 ul çıkarınher tüpten karınca, o hacmi pelet tekrar süspansiyon haline getirin. , Sperm süspansiyonu 20 ul alın, distile su ile seyreltilmiş 01:10 ve dik bir mikroskop 40x objektif kullanarak hemasitometre sperm sayısı. Sayıları ve seyreltme faktörlerinin her tayininde filtre geçti toplam sperm sayısını hesaplamak için kullanın.

3. Kurbağa sperm izleme tahlil Zigmond odası kullanılarak

1. Inverted mikroskop iş istasyonu videoya için hazırlayın. Biz Sony DXC-390 3-çip renkli analog video kamera veya Hamamatsu ORCA-03G monokrom dijital kamera ya sahip Nikon Elipse TE300 inverted mikroskop kullanıyoruz. Zigmond odası slayt 22x40 mm kapak cam karşılamak için yeterli açılışı ile sahne plaka tarafı aşağı sahne dayanmalıdır. Bu düzenleme, kurbağa sperm yerçekimine karşı yüzmek mümkün olduğu gerçeği ile gerektirmiştir. Ikisi arasında çalışan gözlem platformu üzerinde Odak ya 4x ve 10x objektif lensolukları.
2. Kamera odaklı ve gözlem platformu üzerinde ortalanmış olduğundan emin olmak için test edin. Sony kamera kullanılması durumunda, çıkış bir video izlemek ve video sinyali saniyede 7 kare sayısallaştırma yeteneğine sahip bir A / D dönüştürücüsü (frame grabber) gönderilir. Dijital akarsu tercihen 4 Gb veya daha fazla RAM ile 3 GHz veya daha fazla çalışan bir bilgisayar kullanılarak işlenir. Filiz filiz CG-7 frame grabber kontrol Image Software (NIH Image özel bir Windows sürümü) kullanmasına rağmen, bu ürünler artık mevcut değildir. Resim J analog video kamera çekimi için VirtualDub Plug-in yazılımı kullanmak için geçerli çözüm. Hamamatsu kamera kullanılması durumunda, dijital çıkış Olympus cellSens yazılım tarafından işlenen ve bilgisayar monitöründe görüntülenen. Her iki durumda da bir 8-bit tiff yığını olarak bir dahili veya harici sabit disk, veri kaydedilir. Scion Image yazılımı kullanın Resim J. kullanarak bir yığın Tiff görüntü sırası dönüşüm gerektirir
3. F1 tamponu uygun bir konsantrasyonda kemoatraktan hazırlayın. Xenopus laevis sperm, daha önce açıklandığı gibi hazırlayın ve kullanana kadar buz üzerinde 1,5 x OR2 tampon saklayın .
4. Zigmond odası birleştirin. Kuru, temiz bir oda ile başlayın. 5 mm ve her çukur dış kenarına paralel silikon yağı (4 ul) bir hat kullanarak ilgili bir mikropipet yer. 22x40 mm kapak cam silikon yağı her teknenin dış kenarına eşit yaymak için izin odasının üzerine yerleştirin. Fabro ve ark önerdiği gibi, bir ön deneyler bu sperm yapışmasını bir sorun olduğunu göstermek nitroselüloz ile cam kapak kat gerekebilir ^3. AlternŞimdiye kadar çok kullanılır (örneğin 1% BSA) arabellekleri protein dahil, aynı zamanda sperm yapışmasını azaltır.
5. Mikroskop sahne sahne cam kapak ile temas etmediği dikkatli olmak dairesel kesme üzerinde yer odası ve tersine çevirin. Bu ters yapılandırma platform üzerine çukur Xenopus sperm getirmek için gerekli. Memeli sperm aksine, Xenopus sperm platforma ulaşmak için yerçekimine karşı yüzmeye yeterince güçlü değil.
6. Xenopus sperm karıştırma 01:10 F1 tamponu ile oda sıcaklığında 1,5 x OR2 tampon 20 ul etkinleştirin. Bir kesim ucu ile bir mikropipet kullanarak hemen 70 motilite-aktive sperm ul çukur içine aktarın. Bu, düşük bir açıyla mikropipet tutarak ve çukur yan açılışında ucu yerleştirerek elde edilir. Çıkarılır hücre süspansiyonu kapiller eylem tarafından çukur ve köprü doldurur. Sonra, aynı şekilde bir chemoatttractant çözüm kullanarak ters çukur doldurun.
7. 3 dakika içinde videoya başlayın (Xenopus sperm sınırlı bir motilite ömrü var) ve 5 dakika boyunca devam edin . Videoya, sonunda, oda tarafından sökülmesi ve sonra basınçlı su akışı ve püskürtme şişesi etanol ile olukları ve gözlem platformu yıkayın. Gözlem platformu ve dipler kontamine etmemeye dikkat ederek kağıt mendil ile üst yüzeyleri silikon yağı çıkartın.
8. Gerekirse, Resim J yazılım kullanarak bir Tiff görüntü sırası veya yığın yakalanan video veri dönüştürün. Sonra Resim J ve ilk 21 kare (3 saniye) dosyasını açmak izlenebilir sperm 50 kadar tercih. Yanlılığı önlemek için, gözlem alanında tüm bölgelerinden ve onların yörünge veri bilgisi olmadan sperm seçti. Nokta, her spermi için zaman (xyt veri setleri) bir fonksiyonu olarak xy düzleminde iki boyutlu hücre yörüngeleri Yakalama ve Resim J. görselleştirin yörüngeleri MtrackJ eklenti modülünü kullanarak fare tıklayın ve yörünge hesaplamakmesafeleri, aks bileşenleri ve MtrackJ içinde hızları. Alternatif olarak, xyt veri ithal ederek bu işlemleri yürütmek ve diğer sayısal analizi (örneğin yönlülük, kemotaksis parametreleri ve parametre histogramlar) Microsoft Excel'e ayarlar.
9. Doğrusal, eğrisel ve dairesel desenler yanı sıra bu tür döner gibi özellikler de dahil olmak üzere genel hareket kalıplarını tespit etmek için her Excel sperm Arsa yörüngeleri. Ve Y ekseni ve seyahat degrade eksenine göre ortalama açı gibi yönlendirme parametreleri - xyt veri yararlanın, ortalama eğrisel hız, X boyunca net turizm (gradient) hesaplamak için ayarlar.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Iki odalı tayininde önemli teknik parametreleri büyüklüğü ve odanın şekli, membran porozite ve inkübasyon süresi vardır. Sperm büyük bir hacim (ön gerektirecek kadar sperm tutan üst odanın boyutu çapı çok geniş olmamalıdır.ferably 0.5 ml veya daha az), ne de üst kamara hücre süspansiyonu (<1 cm) yüksek bir sütun oluşturacak kadar derin olmalıdır. Alt kamara üst kamara eklemek çevreleyen tampon hacmi tam olarak artifactually zarından sperm zorlayacaktır bir transmembran hidrostatik basınç oluşturmak için ekleme hücre süspansiyonu ile eşleşmesi gerekir. Yerleştirme, yükleme sırasında zarından spermi engelleyen bir başlangıç ​​yukarı hidrostatik basınç sperm yükleme sonuçları takip altına iyi ilk boş insert,. Membran gözenek boyutu seçimi sperm boyutu ve gözenekli membran ekler ticari durumu tespit edilir. Biz 12 mikron gözenek daha doğru sayma sağlayan yüksek sayılar sperm geçişini sağlamak rağmen kurbağa sperm ile deneyleri ya 8 ya da 12 mikron çapında gözenekleri yararlanabilirler bulabilirsiniz. Gözenek büyüklüğü 12 mm daha fazla piyasaya sürülmesi görünmüyor. Ti kullanarak bir alternatifssue kültür 96-kuyucuğu kemotaksis deneyleri için tasarlanmıştır Neuroprobe membranların kullanımı ekler. Bu potansiyel olarak büyük bir hacmi ve gözenek çapları daha geniş bir yelpazesi sunuyoruz. Büyük memeli sperm, daha büyük bir gözenek çapı gerektirecek gibi görünüyor olsa da, biz, 12 mikron gözenekleri (Burnett, yayınlanmamış gözlemler) ekler kullanarak fare sperm kemotaksis başarıyla test var. Buna karşın, henüz bu olasılığı test edilmemiş olmasına rağmen daha küçük gözenek boyutları küçük sperm (örneğin, deniz kestanesi) için yeterli olabilir.

Açıklanan iki odacıklı testinin Tek dezavantajı bu sperm sinyal böylece arka plandaki oranı azalan, dolayısıyla kaçınılmaz olarak bazı ağırlık sperm geçişini sonuçlanan üst odasında yerleştirilir. Bu Xenopus sperm hareketliliğini memeli sperm gibi yerçekimine karşı yüzmek için yeterince dinç olmadığı gerçeği ile gerektirmiştir. Xenopus sperm assaying bir başka zorluk, gerçek şudur ki hareketliliğini life zaman kısa - 5 - 15 dakika sonra aktivasyon. Bu kısıtlama, sperm birden fazla deneyleri yürüten her 2 ya da 3 dakikada bir yeni bir toplu aktif hale getirmek için gerek için temelidir. Sonuç olarak, zaman ders çoğu sperm geçişini ⁵ testinin ilk 20 dakika içinde meydana göstermiştir. 50 dakikalık bir inkübasyon dönemi kullanmasına rağmen, bu süre olasılıkla 20 ya da 30 dakika kısa olabilir. Buna karşılık, saat boyunca hareketli kalır fare sperm testinin iyi sonuçlar (Burnett, yayınlanmamış gözlemler) ile 2 saatlik bir süre kullandık.

Kurbağa sperm kullanarak iki odacıklı tayininde, gözenekli zarından sperm geçen toplam sayısı, tipik olarak 1-20 veya üst kamara eklemek yerleştirilir sperm yaklaşık% 1-2. Alt odasında bir kemoatraktan degrade varlığı sperm geçişini 4 ila 10 kat kadar artırabilir. Şekil 2'de bu testte yapılan tipik bir doz yanıt eğrisi göstermektedir. Bir extrXenopus yumurta, marmelat ("yumurta su") bilinen kemoatraktan protein allurin (kırmızı daireler) içeren hareket dilüsyonları bir dizi alt odasına yerleştirildi . Her deney bulunan toplam yumurta su protein mikrogram / tahlil verilen orijinal 50 ul hacmi teslim edilen miktar. Teslim protein difüzyon gradyan oluşturacak protein, sperm için yanıt verdiğini gerçek konsantrasyon aralığı olarak bilinmemektedir, ancak teslim damla protein konsantrasyonu 5 ila 10 kat daha düşük olduğu tahmin edilebilir. Bu nedenle, biz tanıttı protein miktarı değil, konsantrasyon göstermektedir. Genellikle, her doz ve ortalama sonucu çift veya üç deneyleri gerçekleştirmek, sonra her bir deney farklı erkeklerden sperm kullanarak tüm deney 3 veya 4 kez çoğaltmak. Ortalama ortalama ve standart hata standart hata ile her doz için hesaplanan tipik olarak ortalama% 5 ila 10 olması anlamına gelir. Kno olmadan proteinler Notsığır serum albumin (açık daireler, Şekil 2) gibi wn kemoatraktan faaliyet zarından sperm geçişini düşük seviyesi, non-spesifik bir artışa neden olabilir. Yükselen bir faz ve ilginç bir gözlem yumurta su için doz yanıt eğrisi azalan bir faz - multifazik olduğunu. Bu multifazik ilişki türü, sperm chemoattractants için ortak; foliküler sıvı insan sperm yanıt kemoatraktan bir yumurta çevresinde bulunan bu yüksek konsantrasyonlarda yararlı düşünülmektedir daha fazla arama tepkileri azaltmak için hizmet edebilir, benzer ^bir bifazik ilişkinin 6 gösterir sperm parçası.

Bazen biz, böylece bir kemoatraktan tarafından üretilen kat artış azaltarak Bu testte kontrol değerleri normalden daha yüksek olduğunu bulmak. Genellikle, bu tahlil sırasında filtre takın mekanik bozulma takip edilebilir. Bu nedenle, sperm veya che yüklenirken ekler rahatsız olmadığı önemlidir.moattractant, tahlil inkübasyon sırasında veya ekleme kaldırılır. Özellikle önemlidir ekleme sperm deposu mikropipet veya emme iyi ekleme kaldırmadan önce kaldırılmış olmasıdır. Bu ekleme kaldırılır alt odasına gözenekli zarından süpürüldü olmadığı sperm sağlar.

Zigmond odası tayininde önemli teknik parametreleri coverglass ve gözlem platformu arasındaki mesafe, video gözlem büyütme, kullanılan optik türü ve kare hızını içerir. - Daha fazla petrol, daha fazla mesafe Bu mesafe, kapak cam ve oda slayt arasındaki arayüz için kullanılır silikon yağı miktarına göre çeşitli olabilir, ancak gözlem platformu arasındaki mesafe genellikle 10 ila 15 mm. Sıvı ince bir düzlem, bir degrade oluşturmak için bir kez oluşan degrade yanı sıra uzun ömürlü için gereken süreyi artırır. Sıvı kalın bir uçağın daha hızlı g sağlarRadyen oluşumu ancak degrade, kısa bir ömrü ve daha az kararlılık vardır. Degrade oluşum dinamikleri iyi kemoatraktan bir floresan boya ve floresan dekstran ve dinamiklerini görmek için floresan mikroskobu kullanarak görüntülenebilir. Test reaktif kullanılan kemoatraktan ve dinamikleri, kaç dakika, sperm hareketlerinin degrade oluşumu ve kayıt için izin verilmelidir karar vermek için kullanılan tespit molekül ağırlığı uyumlu olmalıdır.

Tüm gözlem platformu biz açıklanan test koşullarında olarak görüntülenebilmekte ise kullanılan büyütme düşük toplam (4x ve 10x objektif) olmalıdır. Flagellar hareketleri çözmek için, göreceli olarak kısa yörünge segmentler veya isteklerine izlemek niyetinde Öte yandan, yüksek büyütme (40x veya 63x objektif) yararlı olabilir. Bu kağıt veya otomatik takip ederek açıklandığı gibi daha sop uygulanan Takibi ya yarı manuel yöntemlerle yürütülmektedir.MetaMorph veya Imaris Parça histicated yazılım paketleri. Her iki durumda da, izleme kolaylığı operatör tarafından ya da yazılım destekli nesne tanıma olsun görüntü kontrastı çok bağlıdır. Parlak bir alan optik, bazı durumlarda kullanılmış olabilir olmasına rağmen, faz kontrast optik veya karanlık alan optik genellikle gereklidir. Son olarak, kare hızını izleme istenilen zaman çözünürlüğü bağlıdır. Saniyede 4-8 kare - yarı manuel yöntemler yordamı olarak kullanılması durumunda, bir olasılıkla nispeten düşük kare hızı sınırlıdır kayıt veri emek yoğun doğası nedeniyle. Öte yandan, video oranı gözlemler, bu flagellar dalga formları gibi hızlı yanıt için gerekli olabilir. Sık sık, deneysel amaçlar iyi bir de büyütme, optik ve dijital görüntü işleme gibi diğer parametreleri değiştirmek için istediği yavaş kare hızıyla deneyler ve daha hızlı çerçeve hızı deneyleri yapıyor ayrı ayrı sunulmaktadır.

Zigm için tipik sonuçlarikinci odasına izleme testi Movie 1 video klip elli kurbağa sperm görülenler gibi bir takım yörüngeler oluşur. Gözlem platformu bir görüntü karşısında, bireysel sperm yörüngeleri bir kontrol deneyi (hiçbir kemoatraktan degrade mevcut) kırmızı izlenmektedir. Her sperm için zamanın bir fonksiyonu olarak xy düzleminde iki boyutlu hücre yörüngeleri MtrackJ tarafından çizilen ve Microsoft Excel'e Giriş ve ithal edilebilir. Yörünge analizi için, biz aslında Fabro ve arkadaşları tarafından geliştirilen kongre ile tutarlı kemoatraktan degrade ekseni X ekseni ve Y ekseni dik eksen olarak belirler. ^3. Şekil 3 şemada görüldüğü gibi, alınan gerçek yörüngesini adım oluşur, yörünge (mavi / altın okları) seyahat eğrisel mesafe eşittir uzunluğu toplamı. Her bir sperm tarafından seyahat net mesafe ve yön yörüngesini ilk ve son noktası (kırmızı çapraz ok) birbirine bağlayan bir vektör.net turizm, X ekseni bileşeni ve Y ekseni bileşeni içine ayrılmış olabilir (kırmızı kesik oklar da net delta X ve sırasıyla net delta Y olarak adlandırılır).

Omurgalı sperm kemotaksis seyahat yönü nispeten ince vardiya içerebilir, çünkü sperm çok sayıda (100-300), rastgele seçilmiş, genellikle genellikle 4 ila 6 bağımsız deneyler toplanmış veri gerektiren her durum için analiz edilir. Ancak, illüstrasyon amaçları için, biz sadece elli kurbağa sperm veri kullanacak. Tablo 1, sperm seyahat değişiklikleri tespit etmek için kullanılan yaygın parametreleri göstermektedir. Bir kemoatraktan varlığı, bir bütün olarak sperm nüfusu daha yakından degrade ile aynı hizaya gelecek yörüngeleri, X-ekseni boyunca ortalama net turizm önemli ölçüde artacaktır. Bizim örneğimizde, ortalama net X ekseni seyahat yumurta su varlığı üzerinde üç kat arttı. Bir de net X ekseni seyahat avantajı sperm nüfus için bir histogram çizebilirsiniz millere duyarlı sperm küçük alt popülasyonlar tespit edilebilir. Fabro ve ark. ³ tarafından geliştirilen iki parametre de bu tür popülasyonları algılanmasına yardımcı olabilir. Net pozitif X ekseni seyahat (% koyup Dx> 0) gösteren sperm yüzdesi ve net doğrusal hareket gösteren sperm oranı her ikisi de degrade ekseni (% koyup Dx / | Dy |> 1) 45 derece daha fazla dramatik bir artış. sperm alt popülasyonlar duyarlı tüm sperm nüfusunun kemoatraktan veya daha küçük ama yine de önemli miktarlarda duyarlıdır. Tablo 1'de örnek bir yumurta su degrade maruz elli kurbağa sperm için her iki parametre artış gösterir. Rastgele odaklı olmayan hareketi bu parametreler% 50 ve% 25 sırasıyla sıfır olmayan değerler verecektir unutmayın; bu (Tablo 1 gibi) daha yüksek kontrol değerleri düşük bir örnek numarası ya nedeniyle bir arka plan temsil deneysel tasarım özellikle sperm yönde bir önyargı.

içerik "> kemoatraktan ajanlar yanıt sperm seyahat Directionality doğrudan teta, her bir sperm ve degrade (X) ekseni için net turizm vektör arasındaki açı tarafından değerlendirilmelidir. Tablo 1'de görüldüğü anlamına teta azaldığı Bizim örneğimizde thetas sperm nüfus için bir popülasyon olarak sperm yörüngeleri daha iyi degrade ile uyumlu olduğunu gösteren net X ekseni seyahat (yukarıya bakınız) benzer bir yumurta su degrade sperm yüzme, aynı zamanda hassas bir yaklaşım, bir dağıtım olarak ifade edilebilir. duyarlı sperm ve son zamanlarda Gakamsky ve ^ark 7 tarafından incelenmiştir alt popülasyonlar .

Son olarak, bireysel sperm için eğrisel ve anlık hızları da zamanın bir fonksiyonu olarak xy düzleminde iki boyutlu hücre yörüngeleri açıklayan veri çıkartılacaktır. Böylece bir chemokinetic yanıt yanı sıra, düşündüren, hızında bir artışın yanı sıra seyahat yönde bir değişim olduğunu bulabilirsinizkemotaktik bir yanıt.

Bu veriler, sperm yörüngeleri analizi için bir başlangıç ​​noktasını temsil eder. Daha fazla analiz Böhmer ve ark tarafından yürütülen an bazda bir an yörünge doğrusallık ve eğrilik ölçümleri ⁸ ve Shiba ve ark. ^9, Burnett ve ark tarafından yürütülen döner otomatik algılama ^10, ve doğrusal olarak içerebilir. fraktal analiz ^11,12 ile ölçülür. Bu yörüngeleri yüzme sperm yüksek büyütmede izlenir kaydıyla, bir flagellar hareketleri ve pek çok laboratuar ^{8,9,13,14,15,16} tarafından taşınan gerçek zamanlı kalsiyum sinyalleri için aynı zamanda görüntü olabilir . Bu tür çalışmalar, omurgasız ve memeli sperm sperm kemoatraktan kaynağı doğru degrade kadar keskin dönüşler chemoattractants yanıt verdiğini göstermiştir. Bu dönüşler kadar bir dümen olarak sperm yönünü değiştiren flagellar virajlı eşlik ediyor, tanımlı, dalga li tarafından başlatılan olarak görünen virajlıke kalsiyum sinyalleri kamçı ile yayılmakta. Böylece, sperm izleme nihai hedefi, bir kemotaktik degrade sperm yönelimin temel olarak hizmet flagellar tahrik değişiklikleri ile sistem dinamikleri sinyalizasyon ilişkilendirmek için. Bu hedefler, sarmal bir ^hareket 17 seyahat Xenopus sperm ulaşılacak henüz onların ^{yörüngeleri} 10 düşük eğrilik sergi, kalsiyum sinyalleri izlenebilir henüz .

Xenopus laevis sperm için kullandığımız tahlil yöntemleri ayrıntılı, iki kamara sperm birikimi tahlil ve belirli değişiklikler yapılırsa Zigmond odası izleme testi memeli sperm için kullanılabilir hem de buraya odaklı olmasına rağmen. Her iki Testler Zigmond odası tahlil, mikroskop sahne sıcak, sıcak bir slayt kullanımı ile istenilen ° C eğer 37 yürütülen ve olabilir. Tipik olarak, memeli sperm, izole kapasiteli ve uygun bir memeli Tampon kullanan inkübe olacakd chemoattractants, ancak veri analizi, amfibi türlerinin burada açıklanan benzer olacaktır. Bir diğer fark Zigmond odası, Xenopus sperm memeli sperm yılından bu yana, aksine, gözlem platformu üzerine kadar yüzebilir, genellikle dik bir mikroskop sahnede dik yerleştirilmiş olduğunu. Henüz denenmemiş gibi, bu iki testleri gelecekteki çalışmalar türlerin çok sayıda sperm uygulama görebilirsiniz.

Şekil 1 şematik iki odacıklı testinin. Sperm 12 mikron gözeneklere sahip polikarbonat bir filtre altındaki bir ekleme yerleştirilir. Kemoatraktan çözüm dikkatli bir konsantrasyon gradyanı oluşumu başlatmak için iyi pipetlenir.

Şekil 2 iki odacıklı sperm chemotaxi kullanarak kurbağa sperm Temsilcisi veris tahlil. Yumurta su X hazırlanan laevis yumurta sperm chemoattractants karakteristik Çok fazlı bir doz-aktivite eğrisi sergiliyor . Sadece biraz sığır serum albümin artar sperm geçişini protein nonspesifik bir etkisi. Şekil Al-Anzi ve Chandler ⁵ değiştirilmiş.

Movie 1 kurbağa sperm yörüngelerini gösteren bir video klip Zigmond odasının gözlem platformu kırmızı çizilir. Platform genişliği 1 mm 'dir. video klibi izlemek için tıklayınız.

Şekil 3 Eksen sözleşmeler, net doğrusal hareket için bir sperm eğrisel yörünge ve bir vektör Zigmond odasında gözlem platformu üzerinde çizilir. Elde edilen veriler, üç tiptir. İlk olarak, sperm yörüngeleri kendilerini (mavi / altın okları) özel desenler su ortaya çıkarabilirch daireler ve döner (yıldız) olarak. Eğrisel mesafe ve eğrisel hızları yörünge yolu için ölçülebilir. İkincisi, tüm yörünge seyahat net X (gradient) ekseni bileşeni dolaştı, net doğrusal mesafe seyahat net Y ekseni bileşeni ve X ekseni ve net turizm vektör arasındaki açı teta her yörünge için hesaplanan izlenen tüm sperm üzerinde bir dağıtım olarak karşılaştırıldı. Bireysel yörüngeleri içinde segmentleri için seyahat hızı ve yönü, Üçüncü, ani değişiklikler, bireysel ya da bir popülasyon olarak incelenebilir. Yukarıda, odanın bir tarafında görünümünde bir diyagram sunulmuştur.

Tablo 1: Parametreler sık kullanılan Zigmond odasından veri analiz .

Discussion

Amoeboid hareketi veya kamçı ile çalışan yüzme ya da hareket eden hücreler Kemotaksis birçok biyolojik bağlamlarda bulundu ve bu fenomenin çalışma, pratik ve güvenilir testlerin kullanılmasını gerektirir. Fenomen, bir deniz kestanesi yumurta veya bir meyve gövdesini oluşturan balçık kalıp hücreleri toplama sperm cazibe gibi bazı örnekler, derhal görsel etkisi var. Bu fenomenin kantitasyonu Eisenbach ¹⁸ tarafından açıklandığı gibi çeşitli şekillerde yapılmış. Bu testlerin, kılcal damarlar, kılcal damarların bir Makler odası sperm ve kemoatraktan için kuyu sahip bir degrade oluşturmak için rezervuarlar katılmadan kullanımı sperm çekmek için dolu kemoatraktan kullanımını içerir. Bu yazıda, artık daha sık kullanılan iki "ikinci nesil" deneyleri açıklar. Bu testlerin hala birkaç yeni özellik dahil bir degrade oluşturmak için ihtiyaç dayanmasına rağmen. İlk olarak, iki odalı tahlil, sayısız membran samp gözenekleri avantajı vardırle sperm geçişini degrade boyunca bir kılcal açılması yerine, tek bir tahlil degrade test etmek için daha fazla sperm izin.

Yönettiği hücre hareketi Desenler kemotaksis önemli bir özelliği ve izleme hücreler için yeni formatlar geliştirilmiştir doğaldır. Bir yumurta bir yaklaşım olarak yeni bir biçim, üç boyutlu tarama sperm yörüngeleri. Hareketli bir düzlemde sperm pozisyonları tespit etmek için kızıl-ötesi ışık kullanarak, Zimmer ve arkadaşları, yumurta merkezli bir odasında sperm yörünge verileri var, doğal kemoatraktan kaynağı kullanır ve aksi takdirde doğal sperm hareketi bozabilecek nispeten uzak duvarlara sahiptir bir cihaz ^19. Alternatif olarak, Corkidi ve ark. yüksek kare hızları ile üç boyutlu yörüngeleri ²⁰ yakalamak için uzun bir çalışma mesafesi amacı hızlı hareketleri birleştiren bir sistem geliştirdi. Bu tür cihazların sperm hareketlerinin analizi, son zamanlarda kutup koordinasyon kullanımı kolaylaştırılmıştır.tes ²¹ ve Guerrero ve ark. yakın gelecekteki çalışmalarda ¹³ sperm kemotaksis üç boyutlu gözlemler için gerektiği vurgulanmıştır.

Buna karşılık, kartezyen koordinatların kullanımı Zigmond odası, nötrofil oryantasyon ve kemotaksis çalışma ve Giojalas ve arkadaşları ^2,3 sperm kemotaksis çalışma yararlı olduğu gösterilen ilk Sally Zigmond tarafından geliştirilen bir cihaz tarafından kolaylaştırılır. Kemoatraktan doğrusal bir çukur yerine kemoatraktan bir nokta kaynak kullanımı, kimyasal bir gradiyent yerine radyal koordinat sistemine göre bir XY koordinat sistemi kurulacak sağlar. Giojalas Bu testte, insan, fare, tavşan ve dönüslüler sperm kemotaksis çalışma için uygulanan ve yumurtalık folikülleri sıvı ^kemoatraktan 2,3,22 içerdiğini bulma onaylamıştır . Daha yakın zamanlarda, Giojalas ve Eisenbach da yumurtayı çevreleyen cumulus hücreleri tarafından verilen progesteron göstermiştirsperm kemoatraktan ^23-26 olarak hizmet vermektedir. Gerçekten de, son zamanlarda progesteron, kalsiyum sinyalleri başlatmak için, sperm Catsper kanallarının açılması tetiklemek için gösterilen olmuştur sperm bükme flagellar ve böylece ^sperm yüzme 27,28 yönünü değiştirmek için düşündüm.

Zigmond odası hem avantajları ve dezavantajları vardır. Bir avantajı bir dizi odak düzlemli optik o sperm basitlik korunur ve Z boyutu hiç tarama gerekli. Diğer bir avantajı, çoğu araştırmacı için daha tanıdık ve nispeten yaygın matematik ile geliştirilen yeni parametreleri test teşvik kartezyen koordinat kullanılmasıdır. Öte yandan, Zigmond odası, doğada bulunan bu farklı bir durum oluşturur. Sperm, muhtemelen flagellar dalga formlarının repertuar sonucu çıkan güçlerin yanı sıra etkileyen, yakın mesafeden iki duvar arasında yüzmek için yapılır. Aynı şekilde, kullanılan kemoatraktan, genellikle kimyasalve bir yumurta oluşacak daha farklı dağıldılar. Son olarak, duvarlara yapışan sperm potansiyel bir sorun üç boyutlu bir odasında mevcut olmayacaktı.

Bazı araştırmacılar, bu sperm izleme sperm kemotaksis çalışma için tek güvenilir yolu olduğunu gösteriyor olsa da, bu testlerin,, yarı-manuel yerine otomatik yöntemler kullanılmaktadır deneysel ve veri analizi aşamalarında hem de emek yoğun olabilir. Bu nedenle, burada açıklanan iki odacıklı tahlil gibi testlerin kemotaksis için kanıt sağlayabilir nicel ve tekrarlanabilir veri vermek için kullanılır olmuştur. Bu tip testin bir nötrofil süspansiyon, gözenekli bir filtre ^bariyer 29 yüzeyi ile temas halinde yerleştirilmiş olduğu Boyden odası, ile birlikte ortaya çıkmıştır . Kemoatraktan çözüm filtre içinde kendini oluşturmak için kimyasal bir gradiyent sağlayan filtre ters tarafı ile temas halinde yerleştirilmiştir. Filtre matrisi giren hücreler ya da lekeli olabilir ve m sayılıricroscopically veya radyoaktif etiketli bir sintilasyon sayacı sayılır. Bu yaklaşım chemotaxing hücreleri aslında iki oda tayininde geçebileceği daha büyük gözenek polikarbonat filtreleri tarafından geliştirilen Burada ⁵ tarif edilmiştir.

Daha önce biz kurbağa sperm kemotaksis bir önlem olarak iki odacıklı testinin geçerliliği vardır. Birincisi, cezbedici olarak yumurta su kullanarak, sperm geçiş filtresi aracılığıyla uyarılması bir konsantrasyon gradiyenti alt odasında kemoatraktan tek bir damla birikimi ile oluşturulmuş olması gerektirdiğini göstermiştir. Kemoatraktan karıştırılarak alt kamara tampon boyunca dağınık ise, sperm hareketi ⁵ uyarılmış değildir. Odasına kemoatraktan ek bir "ters degrade" İkincisi, oluşturma, sperm geçişini teşvik etmez. Son olarak, Zigmond odasında sperm izleme deneyleri, sperm hareketliliği ve hızı olduğunuazalmış ya da degrade göre sperm seyahat (Burnett, yayınlanmamış gözlemler) yönü ne olursa olsun değişmez. Bu son gözlem, sperm inhibitörleri aslında böylece ^{kemotaksis 18} olarak yanlış olabilir sperm artefakt birikimi sunan kimyasal kaynağına yakın sperm yavaşlatmak ya da durdurmak olabileceğini işaret olduğundan önemlidir .

Bu uyarılar rağmen, böyle iki odacıklı tahlil sperm birikimi testlerinin, son derece yararlı foliküler sıvı ve progesteron memeli sperm chemoattraction ilk keşif, bakteriyel ^peptidler 29,30 nötrofil kemotaksisini karakterize edilmiştir işçilikten tasarruf araçları olduğu kanıtlandı ^6,31,32, ve kurbağa sperm kemoatraktan allurin ^4,5,33 saflaştırılması ve karakterizasyonu.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	BD Biosciences	35/1147
12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane	EMD Millipore	PIXP01250	We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued
Zigmond chamber	Neuroprobe	Z02
Silicone oil	GE Healthcare	SF1154	Equivalent to Dow Corning 550 Fluid
Image J software	Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health	Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
MtrackJ software	Biomedical Imaging Group	Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
Virtual Dub software	GNU General Public Licensed	Free download via http://www.virtualdub.org/index.html	Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only
cellSens software	Olympus Corporation	See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070	Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability