Två typer av analyser för att upptäcka Frog spermier Chemoattraction

Summary

Ägg och den extracellulära beläggningar runt ägg släpper ofta peptider, proteiner och små molekyler som kommunicerar med sperma för att vägleda dem till ägget och därigenom främja befruktningen. Använda groda spermier vi beskriva och jämföra två klasser av test som används för att upptäcka sperma chemoattraction - spermier ackumulering analyser och spermier analyser spårning.

Abstract

Spermier chemoattraction i ryggradslösa djur kan vara tillräckligt robusta för att man kan placera en pipett som innehåller attraktiva peptid till en spermie fjädring och mikroskopiskt visualisera spermier ansamling runt pipetten ^1. Spermier chemoattraction hos ryggradsdjur som grodor, gnagare och människa är svårare att upptäcka och kräver kvantitativa analyser. Sådana analyser är av två huvudtyper - analyser att kvantifiera spermiernas rörelse till en källa chemoattractant, sk spermier analyser ackumulering och analyser som faktiskt spåra simning banor av enskilda spermier.

Spermier ackumulering analyser är relativt snabb så att tiotals eller hundratals analyser göras på en enda dag, vilket möjliggör dos respons kurvor och kurser tid för att genomföras relativt snabbt. Dessa typer av analyser har använts i stor utsträckning att karaktärisera många väletablerade chemoattraction system - till exempel neutrofila chemotaxis till BACrial peptider och kemotaxi spermier att follikelvätskan. Spermier spårning analyser kan vara mer arbetskrävande men ger ytterligare uppgifter om hur chemoattractancts faktiskt förändra simning vägar att spermier tar. Denna typ av analys behövs för att visa riktningen för spermiernas rörelse i förhållande till chemoattrractant lutning axeln och att visualisera karakteristiska svängar eller förändrade inriktning som för spermierna närmare ägget.

Här beskriver vi metoder som används för var och en av dessa två typer av analyser. Spermierna ackumulering analysen används kallas för en "två-kammare"-analysen. Amfibie spermier placeras i en vävnadsodling platta insatsen med en polykarbonatfilter golvet ha 12 porer ìm diameter. Skär med spermier placeras i plattan vävnadsodling brunnar som innehåller buffert och en chemoatttractant försiktigt pipetteras i botten och där golvet möter väggen (se bild. 1). Efter inkubation, är den översta sätter innehåller spermier behållaren försiktigt removed och spermier i botten kammaren som har passerat genom membranet tas bort, pelleterad och sedan räknas av hemocytometer eller flödescytometer.

Spermierna spårning analysen utnyttjas en Zigmond kammare som ursprungligen utvecklades för att observera neutrofila kemotaxi och modifierats för observation av sperma genom Giojalas och medarbetare ^2,3. Kammaren består av en tjock glasskiva där två vertikala dalar har bearbetas. Dessa skiljs åt av en 1 mm bred observation plattform. Efter tillämpning av ett skyddsglas, spermier laddas in ett tråg, visualiseras de chemoattractant agenten i den andra och förflyttning av enskilda spermier via video mikroskopi. Videofilmer analyseras sedan med hjälp av programvara för att identifiera tvådimensionella cell rörelser i XY-planet som funktion av tiden (xyt datamängder) som utgör banan för varje spermier.

Protocol

1. Material och används buffertar

1. Äggcellen Ringer Buffer (1,5 x OR2) innehåller 124 mM NaCl, 3,75 mM KCl, 1,5 mM CaCl _2, 1,5 mM MgCl _2, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, 10 mm Hepes, pH 7,8. Befruktning Buffer (F-1) innehåller 41,25 mM NaCl, 1,25 mM KCl, 0,25 mM CaCl _2, 0,06 mM MgCl _2, 0,5 mM Na ₂ HPO _4, 2,5 mm Hepes, pH 7,8.
2. Xenopus laevis ägg vatten är upprättad enligt Sugiyama et al. ^4. Beskrivs kortfattat, är nyligen gett upphov till gelé groda ägg snurras i en liten volym av F-1 buffert i 30 minuter och det betingade medelstora bort av mikropipetten. Detta medium, kallas "ägget vatten", kan också användas för att förbereda renade allurin, det primära chemoattractant i jelly extrakt. Spermier erhålls från kommersiellt uppfödda Xenopus laevis eller Xenopus tropicalis.
3. Se tabell av material för specifika objekt som behövs i tHan analys.

2. En två-kammare assay för chemotaxis groda spermier

1. Bedöva grodan genom nedsänkning i vatten innehållande 0,07% bensokain, halshugga med ett par karborundum kantade sax och dubbelklicka märg för att eutanasi. Klipp bort bukhuden att exponera muskler. Gör mittlinjen och laterala snitt i buken muskler och tillbaka. Försiktigt dra tarmarna och fett för att avslöja vita, bönformade testiklarna. Klippa bort bindväv med en fin sax Var noga med att undvika blodkärl. Ta bort en testikeln, tvätta bort allt blod med hjälp 1,5 x OR2 buffert, sedan rulla testiklarna på filterpapper för att avlägsna överflödig buffert och små tillhörande blodkärl och sedan placera i testiklarna hos en plast Pitre skålen i 0,2 ml av 1,5 x OR2 buffert. Fyll en 5 ml spruta med 2 ml 1,5 x OR2 buffert, försiktigt peta 10-20 hål i testiklarna över större delen av ytan i ena änden, stick in nålen i den motsatta änden och försiktigt spruta buffert för att spola ut spermier. Alternativt kan enkan injicera buffert samtidigt peta avfarten hålen att spola ut spermier. Överför sperma suspensionen med hjälp av en mikropipett med en cut-off spets (för att undvika klippning av spermier) till ett mikrocentrifugrör och placera på is.
2. Uppskatta antalet grodan spermier erhålls genom spädning av sperma 1:100 i 1,5 x OR-2 och med en 20 l urval av de blandade spermier fjädring och räkna antalet celler genom att använda en hemocytometer och de stora 1 mm ^2-område. Använda hemocytometer räkna och provtagning förhållandet beräkna sperma densitet och det totala antalet skördade spermier. Denna totala är vanligtvis 2 - 6 x 10 ⁷ spermier i en volym på ca 2 ml när båda testiklarna används. Späd suspensionen beståndet spermier med 1,5 x OR2 buffert för att få en spermie täthet av 2 x 10 ⁷ / ml. Använd spermier för analys inom 2 till 3 timmar efter beredning. Bedöma spermiernas rörlighet genom att späda 5 ìl av spermier 1:10 med F-1 buffert och visualisera rörelse med hjälp av optik faskontrast. Minst 40% till 50% av spermierska vara rörliga. Även lämpliga förberedelser kommer att innehålla ett stort antal immotile spermier varav de flesta är omogna.
3. Förbered en ny 24-väl plastplatta vävnadsodling av micropipetting 700 ìl F1 buffert i varje brunn. Varje brunn bör vara ca 15 mm i diameter i botten.
4. Starta en rad analyser genom att späda 100 ìl av spermier fjädring med 900 l av F1 buffert vid rumstemperatur (ca 21 till 23 ° C) i ett mikrocentrifugrör för att aktivera spermierörlighet av osmotiska chock. Varje gång färska spermier aktiveras på detta sätt, måste sperman användas inom 1-2 minuter.
5. Placera en 12 ìm porositet in (12 mm OD) till en buffert som fylls väl, se till att sätta in placeringen är off-center lämnar ett utrymme åt sidan. Överför omedelbart 400 ìl motilitet aktiveras spermier i brunnen av en mikropipett som har en cut-off spets. Applicera spermier upphängning på väggen av filtret in och låt den gå ner på filtret längst ner the in, spermierna avstängning bör inte pipetteras direkt på filtret.
6. Noggrant mikropipett 50 ìl chemoattractant agent i brunnen i utrymmet mellan brunnen och off-center filterinsats. Man måste vara noga med att deponera släppa där sidan och botten väl träffas och dra tillbaka pipetten utan störningar i systemet. Särskilt bör kolven på mikropipett skjutas bara för att det första stoppet så fullständigt att mata provet men inga luftbubblor.
7. Upprepa steg 2,5 och 2,6 ovan för att starta så många analyser som behövs, sedan Inkubera plattan tills den första analysen startade har inkuberas 50 minuter. Vanligtvis kan man starta ett test var 45 till 60 sekunder. Observera att analysen kan effektiviseras genom att en erfaren person eller av två personer som arbetar tillsammans. I detta fall kan en eller två rader av analyser inledas med ett större lager av rörliga spermier och snabbare pipettering förutsatt att spermier används alltid inom 1 till 2 minuteraktivering.
8. Stoppa varje analys i sekvensen startas. Först försiktigt fast filtret in med ena handen och med den andra avlägsna noggrant de flesta eller alla av de spermier fjädring i den övre kammaren genom mikropipett eller genom sug med en pasteurpipett. Omedelbart, med en fin pincett, dra ut filtret in och kasta. Försiktighet måste användas i detta steg, åtminstone de kvarvarande spermier sopas genom filtret artifactually höja värdena för spermier passage.
9. Från varje platta väl, överföra hela spermier suspensionen till ett mikrocentrifugrör. Det är viktigt att blanda spermierna fjädringen i brunnen innan uttag eftersom spermierna har en tendens att lösa till botten. Tillsätt 15 l på 25% formaldehyd till en slutlig koncentration av 0,5% v / v och kylskåp om spermier inte är klar samma dag.
10. Pellets spermier i varje rör med en 10 sekunders spin tryckknapp på en personlig mikrocentrifug med en högsta hastighet på 2000 x g. Ta bort alla utom 100 ìl supernatmyra från varje rör, sedan Återsuspendera pelleten i den volymen. Ta 20 l av spermier fjädring, späd 1:10 med destillerat vatten och räkna sperma på en hemocytometer med en 40x objektiv på en upprätt mikroskop. Använd räknas och utspädningsfaktorer för att beräkna det totala antalet spermier som passerat filtret i varje analys.

3. Frog spermier spårning analysen med en Zigmond kammare

1. Förbered inverterat mikroskop arbetsstation för videofilmning. Vi använder en Nikon Elipse TE300 inverterat mikroskop utrustat med antingen en Sony DXC-390 3-chip färg analog videokamera eller en Hamamatsu ORCA-03G svartvit digitalkamera. Den Zigmond kammaren bilden måste vila på scenen upp-och-ner med en tillräcklig öppning i scenen plattan för att rymma en 22x40 glas mm lock. Detta arrangemang är nödvändiga på grund av det faktum att grodan spermierna inte kan simma mot tyngdkraften. Fokus antingen en 4x eller 10x objektiv på observation plattformen kör mellan de tvåtråg.
2. Testa att se till att kameran är fokuserad och inriktad på observation plattformen. Om Sony kameran används, är utdata skickas till en bildskärm och till en A / D-omvandlare (frame grabber) som kan digitalisera 7 bilder per sekund från videosignalen. Den digitala strömmen har bearbetats med hjälp av en dator som kör på 3 GHz eller högre helst med 4 GB eller mer RAM-minne. Även om vi använder Scion Image programvara (en egen Windows-version av NIH Image) styra en Scion CG-7 frame grabber, dessa produkter är inte längre tillgänglig. En aktuell lösning är att använda Image J med en VirtualDub Plug-in för analog videokamera fånga. Om Hamamatsu kameran används, är dess digital utgång behandlas av Olympus cellSens programvara och visas på datorskärmen. I båda fallen är de data som sparats på antingen en intern eller extern hårddisk som en 8-bitars TIFF-stack. Användning av Scion Image programvara kräver konvertering av TIFF-bild sekvens till en bunt med Image J.
3. Förbered chemoattractant vid en lämplig koncentration i F1 buffert. Förbered Xenopus laevis spermier som beskrivits tidigare och förvara i 1,5 x OR2 buffert på is tills det ska användas.
4. Montera Zigmond kammaren. Börja med en torr, ren kammare. Använd en mikropipett placera en rad av silikonolja (4 l) ca 5 mm från och parallellt med den yttre kanten av varje tråg. Placera en 22x40 glas mm locket på kammaren låta silikonolja att jämnt sprida sig till den yttre kanten av varje tråg. Om preliminära experiment visar att spermier hålla sig är ett problem, kan man behöva belägga täcka glaset med nitrocellulosa som föreslagits av Fabro et al. ^3. Alterntivt, kan införandet av protein i buffertar används (t.ex. 1% BSA) minskar också spermierna fastnar.
5. Vänd kammaren och placera över den runda urtaget i mikroskop scenen var försiktig så att täckglaset inte får kontakt med scenen. Denna omvända konfiguration är nödvändig för att Xenopus spermier från tråget på plattformen. Till skillnad från däggdjur spermier, Xenopus spermier inte är starka nog att simma mot tyngdkraften för att nå plattformen.
6. Aktivera 20 ìl Xenopus spermier i 1,5 x OR2 buffert genom att blanda 1:10 med F1 buffert vid rumstemperatur. Med hjälp av en mikropipett med ett snitt spets, omgående överlåta 70 ìl motilitet-aktiverade spermier i vattenhon. Detta uppnås genom att hålla mikropipett på en låg vinkel och placera spetsen vid sidan öppnandet av tråg. Cellsuspensionen utkastade fyller tråg och bron genom kapillärkraft. Därefter fyller den motsatta botten på samma sätt med hjälp av en chemoatttractant lösning.
7. Börja videofilmade inom 3 minuter (Xenopus spermier har en begränsad rörlighet livstid) och fortsätt i 5 minuter. I slutet av videofilmade, demontera kammaren och tvätta tråg och observation plattform med en trycksatt ström av vatten och sedan etanol från en sprutflaska. Ta bort silikon olja från övre ytor med papper servetter försiktigt så att inte förorena observation plattform och tråg.
8. Om det behövs konvertera video data tagna till en TIFF-bild sekvens eller stapla använda Image J. Öppna sedan filen i bild J och under de första 21 bildrutor (3 sekunder) välja upp till 50 spermier som ska spåras. För att undvika en partisk valde spermier från alla regioner i observation fältet och utan kunskap om deras bana uppgifter. Fånga tvådimensionella cell banor i XY-planet som funktion av tiden (xyt datamängder) för varje spermier av peka och klicka med musen använder MtrackJ plugin-modul för Image J. Visualisera banor och beräkna bananavstånd, axel komponenter och hastigheter inom MtrackJ. Alternativt utför dessa operationer och vidare numerisk analys (t.ex. riktverkan, chemotaxis parametrar och histogram parameter) genom att importera xyt datamängder till Microsoft Excel.
9. Rita banor för varje spermier i Excel för att upptäcka övergripande rörelsemönster inklusive linjär, krökt och cirkulära mönster, samt funktioner som varv. Utnyttja xyt datamängder för att beräkna genomsnittet krökt hastighet, netto resa längs X (gradient) - och Y-axeln, och parametrar orientering såsom den genomsnittliga vinkel på resa i förhållande till lutningen axeln.

4. Representativa resultat:

Viktiga tekniska parametrar i två kammare analysen är storleken och formen på kammaren, porositet av membranet, och längden av inkubationstiden. Storleken på den övre kammaren håller spermier får inte vara så stor diameter att det kräver en stor volym av sperma (preferably 0,5 ml eller mindre) och inte heller bör den övre kammaren vara så djupt som att skapa en hög kolumn med cellsuspension (<1 cm). Volymen lägre kammare buffert som omger övre kammaren in bör överensstämma exakt samma nivå som cellsuspensionen i insatsen för att inte skapa ett tryck transmembrant hydrostatisk att artifactually skulle tvinga spermier genom membranet. Placering av de tomma in i botten väl först, följt av resultat spermier lastning i ett inledande uppåt hydrostatiska trycket som hindrar spermier från att gå genom membranet vid lastning. Val av membranet porstorlek bestäms av storleken på spermier, och den kommersiella tillgängligheten av porösa membran skär. Vi finner att försök med grodan spermier kan använda antingen 8 eller 12 porer ìm diameter men 12 ìm por ger för passage med högre antal spermier så att mer exakt räkna. Porstorlek större än 12 ìm verkar inte vara kommersiellt tillgängliga. Ett alternativ till att använda TIssue kulturen insatser är användningen av Neuroprobe membran avsett för kemotaxi analyser i 96-hålsplattor. Dessa erbjuder en potentiellt ökad genomströmning och ett bredare utbud av por diameter. Även större däggdjur spermier verkar kräva en större pordiameter har vi analyserade framgångsrikt chemotaxis musen spermier med skär med 12 ìm porer (Burnett, opublicerade observationer). Däremot kan mindre porstorlek vara tillräcklig för mindre spermier (t.ex. sjöborre), även om vi ännu inte har testat denna möjlighet.

En nackdel med den beskrivna två kammare analysen är att spermierna placeras i den övre kammaren vilket oundvikligen resulterar i några spermier passage av tyngdkraften, vilket minskar signalen att bakgrunden förhållandet. Detta är nödvändigt på grund av det faktum att Xenopus spermier är inte tillräckligt kraftfull i sina motilitet att simma mot tyngdkraften liksom däggdjur spermier. En annan svårighet testmetoder Xenopus spermier är det faktum att deras motilitet lIFE är kort - 5 till 15 minuter efter aktivering. Denna begränsning är grunden för att behöva aktivera en ny sats av sperma var 2 till 3 minuter när de utför flera analyser. Som ett resultat har tid-studier visat att de flesta spermier passagen sker inom de första 20 minuterna av test ^5. Även om vi använder en 50 minuters inkubationstid, kan denna period sannolikt kortsluten till 20 eller 30 minuter. Däremot för mus spermier som förblir rörliga i flera timmar, har vi använt upp till en 2 timmars period av test med goda resultat (Burnett, opublicerade observationer).

I de två kammare analysen med groda sperma, är det totala antalet spermier som passerar genom den porösa membranet normalt 10 till 20 tusen eller ca 1 till 2% av spermierna placeras i den övre kammaren insatsen. Förekomst av en chemoattractant gradient i den nedre kammaren kan öka spermier passage så mycket som 4 till 10 gånger. Figur 2 visar en typisk kurva dos respons utförts med denna analys. En Extrhandling av Xenopus ägg gelé ("ägget vatten") som innehåller kända allurin chemoattractant protein (röda cirklar), var placerad i den nedre kammaren i en serie spädningar. Den totala ägget vatten protein som finns i varje analys anges i mikrogram / analys - den levererade volymen i den ursprungliga 50 l volym. Eftersom proteinet levereras kommer att utgöra en spridning lutning, är den faktiska koncentrationen utbud av protein som spermier svara inte känd men kan uppskattas till 5 till 10 gånger lägre än Proteinhalten i den levererade droppe. Av denna anledning, betecknar vi mängden protein infördes, inte koncentrationen. Vanligtvis utför vi dubbel eller tredubbel analyser för varje dos och genomsnittliga resultatet, vi sedan replikera hela experimentet 3 eller 4 gånger med spermier från olika hanar i varje försök. Medelvärdet och standard error av medelvärdet beräknas för varje dos med standardfel medelvärdet typiskt är 5 till 10% av medelvärdet. Observera att proteiner utan knoWN chemoattractant aktivitet såsom bovint serumalbumin (öppna cirklar, bild. 2) kan ge en låg nivå, icke-specifik ökning av spermier passage genom membranet. En intressant iakttagelse är att dosresponskurvan för ägg vatten är multiphasic - en stigande fas och en avtagande fas. Denna typ av multiphasic relation är gemensam för spermier chemoattractants, svaret mänskliga spermierna att follikelvätskan visar en liknande bifasisk relation ^sex som är tänkt vara till nytta i att höga koncentrationer av chemoattractant finns i närheten av ett ägg kan användas för att minska ytterligare söker svar på den del av spermier.

Ibland finner vi att kontrollera värden för denna analys är högre än normalt, vilket minskar faldig ökning som produceras av en chemoattractant. Vanligtvis kan detta spåras till mekaniska störningar av den filterinsatsen under analysen. Därför är det viktigt att skären inte störs under inläsningen av spermier eller Chemoattractant under analysen inkubation eller när insatsen tas bort. Särskilt viktigt är att spermierna reservoaren i insatsen avlägsnas genom mikropipett eller sug innan du lyfter in ur brunnen. Detta gör att spermierna inte svepte genom den porösa membranet i botten kammaren som insatsen tas bort.

Viktiga tekniska parametrar i Zigmond kammaren analysen omfattar avståndet mellan coverglass och observation plattform, förstoringen av video observation, vilken typ av begagnade optik och bildhastighet. Avstånd mellan observation plattformen är vanligen 10 till 15 ìm trots detta avstånd kan varieras med den mängd av silikon olja som används som gränssnitt mellan skyddsglas och kammaren skjut - ju mer olja, desto större avstånd. En tunn plan av vätska ökar mängden tid som behövs för en lutning för att bilda liksom livslängd lutning en gång bildades. En tjockare plan av vätska ger ett snabbare gradient formation men lutningen har en kortare livslängd och mindre stabilitet. Dynamiken i gradienten bildas kan visualiseras med hjälp av en fluorescerande färgämne eller ett fluorescerande dextran i chemoattractant väl och med fluorescensmikroskopi för att se dynamiken. Testet reagens bör matchas i molekylvikt till chemoattractant som används och dynamiken bestäms används för att bedöma hur många minuter bör tillåtas för lutning bildande och registrering av spermier rörelser.

Den förstoring som används bör vara låg total (4x eller 10x mål) om hela observation plattformen ska visualiseras som i analysen förutsättningar vi har beskrivit. Å andra sidan kan högre förstoring (40x eller 63x objektiv) vara användbart om man avser att övervaka relativt kort bana segment eller vill lösa flagellar rörelser. Spårning kan utföras antingen genom semi-manuella metoder som beskrivs i detta dokument eller genom automatisk spårning som praktiseras i mer SOPhisticated mjukvarupaket som metamorfa eller Imaris spår. I båda fallen är lätta att spåra mycket beroende av bildens kontrast vare sig det är av verksamhetsutövaren eller program-assisterad objekt erkännande. Även ljusa fält optik kan användas i vissa fall användandet av optik faskontrast eller mörkfält optik är ofta krävs. Slutligen beror bildhastighet på tiden upplösning önskas i spårning. Om semi-manuella metoder används som i vårt förfarande, är en förmodligen begränsad till relativt låg bildhastighet - 4 till 8 bilder per sekund - på grund av den arbetsintensiva natur registrera data. Å andra sidan kan video-kurs observationer krävas för snabba svar, såsom flagellar våg former. Ofta är experimentella mål bäst genom att göra långsammare experiment bildhastighet och snabbare frame experiment takt separat eftersom man också vill ändra andra parametrar såsom förstoring, optik, eller digital bildbehandling.

Typiska resultat för ZigmOND kammare spårning analys består av ett antal banor som de sett i femtio groda spermier i videoklippet i Movie 1. Mot en bild av observation plattformen, är banor av enskilda spermier spåras i rött för en kontroll experiment (ingen chemoattractant gradient närvarande). Den tvådimensionella cell banor i XY-planet som funktion av tid för varje spermier kan ritas och loggas av MtrackJ och importeras till Microsoft Excel. För bana analys, utse vi chemoattractant lutning axel som X-axeln och Y-axel som den ortogonala axeln, i överensstämmelse med konventionen som ursprungligen utvecklades av Fabro et al. ^3. Som framgår av diagrammet i figur 3, är den faktiska bana tagit består av steg, summan av vars längd är lika med krökt sträcka på bana (blå / guld pilar). Nätet avstånd och riktning av resor varje spermie är en vektor ansluta den första och sista punkten i banan (röd diagonal pil). Dennet resa kan delas upp i sin X-axel komponent-och Y-axeln komponent (röda streckade pilar, även kallad nettodeltat X och nettodeltat Y, respektive).

Eftersom chemotaxis i ryggradsdjurens spermier kan innebära relativt subtila förskjutningar i färdriktningen,, ett stort antal spermier (100 till 300) slumpmässigt utvalda, brukar analyseras för varje tillstånd som ofta kräver poolade data från 4 till 6 oberoende försök. I illustrativt syfte, dock kommer vi använda data från bara femtio groda spermier. Tabell 1 visar gemensamma parametrar som används för att upptäcka förändringar i spermier resor. Den genomsnittliga netto resa längs X-axeln kommer att öka betydligt om, i närvaro av en chemoattractant följer spermier befolkningen som helhet banor som närmare ansluter med lutning. I vårt exempel, ökade genomsnittligt netto X-axelns förflyttning över tre gånger i närvaro av ägg vatten. Man kan också rita ett histogram av netto X-axelns förflyttning för spermierna befolkningen som har fördelar Tage att mindre delpopulationer av en lyhörd spermier kan upptäckas. Två parametrar som utvecklats av Fabro et al. ³ kan också hjälpa till att upptäcka sådana populationer. Både andelen spermier visar positivt X-axelns förflyttning (% ΔX> 0) och andelen spermier som visar netto linjär resa inte är större än 45 grader från lutning axeln (% ΔX / | ΔY |> 1) kan öka dramatiskt om hela spermier befolkningen är känslig för chemoattractant eller mindre men ändå betydande belopp om subpopulationer av spermier är känsliga. Vårt exempel i tabell 1 visar ökningar i både parametrarna i femtio groda spermierna utsätts för ett ägg vatten lutning. Notera att slumpmässigt icke-orienterade rörelsen kommer att ge noll värden för båda av dessa parametrar på 50% respektive 25%, kontroll högre värden än den här (som de i tabell 1) utgör en bakgrund på grund av antingen en låg prov nummer eller till en bias i spermier orientering särskilt till experimentell design.

innehåll "kan> riktverkan spermier resa som svar på chemoattractant agenter direkt bedömas av theta vinkeln mellan vektorn av årets resor för varje spermier och lutning (X)-axeln. Vårt exempel i tabell 1 visar att den genomsnittliga theta minskade för spermier simmar i ett ägg vatten lutning indikerar att spermier banor som en population var bättre i linje med lutning. Liknar netto X-axelns förflyttning (se ovan) kan thetas för spermierna befolkningen uttryckas som en distribution, ett tillvägagångssätt också känsliga att subpopulationer av en lyhörd spermier och en som nyligen har studerats av Gakamsky et al ^7.

Slutligen kan kroklinjiga och momentana hastigheter för enskilda spermier också hämtats från de uppgifter som beskriver tvådimensionella cell banor i XY-planet som funktion av tid. Man kan finna att det är en ökning i hastighet samt ett skifte i inriktning av resor, vilket tyder på en kemokinetiska svar samten kemotaxi svar.

Dessa data utgör en utgångspunkt för analys av spermier banor. Ytterligare analyser kan omfatta mätningar av banan linjäritet och krökning på ett ögonblick för ögonblick grunder som utförs av Böhmer et al. ⁸ och Shiba et al. ^9, den automatiserade upptäckt av vändningar som utförs av Burnett et al. ^10, och olinjäritet som mätas mot bakgrund av fractal analys ^11,12. Förutsatt att spermierna simmar dessa banor följs upp vid högre förstoring, man kunde också bild flagellar motioner och realtid signaler kalcium som utförs av flera laboratorier ^{8,9,13,14,15,16.} Sådana studier har visat att både ryggradslösa djur och däggdjur spermier svara på chemoattractants med skarpa svängar av spermier upp lutning mot chemoattractant källa. Dessa vänder åtföljs av flagellar böjar som förändrar spermier orienteringen mycket som ett roder skulle böjar som tycks initierats av definierade, våg-like kalcium signaler förökningsmaterial genom flagellum. Således är det yttersta målet för spermier spårning korrelera signalsystem dynamik med förändringar i flagellar framdrivning som ligger till grund för spermier orientering i en kemotaxi lutning. Dessa mål har ännu inte nåtts i Xenopus spermier som färdas i en spiralformad rörelse ^17, låg krökning i sina banor ^10, och vars kalcium signaler har ännu inte övervakas.

Även om vi har fokuserat här på detaljer analysens metoder vi använder för Xenopus laevis spermier, både de två kammare analysen spermier ackumuleringen och Zigmond kammaren spårning analysen kan användas för däggdjur spermier om vissa ändringar görs. Båda analyserna kan utföras vid 37 ° C om så önskas, med hjälp av en bild varmare och i Zigmond kammaren analysen, ett mikroskop skede varmare. Vanligtvis kommer däggdjur spermier isoleras, capacitated och inkuberas med lämpliga däggdjur buffertar end chemoattractants, men analys av data kommer att likna det som beskrivs här för amfibiearter. En ytterligare skillnad är att Zigmond kammaren vanligtvis placeras stående på scenen av en upprätt mikroskop sedan däggdjur spermier, till skillnad från Xenopus spermier kan simma upp på observation plattformen. Som ännu oprövade, kan dessa två analyser se ansökan till spermier i ett antal arter i det fortsatta arbetet.

Figur 1. Schematisk beskrivning av två kammare analys. Spermier placeras i en sätter i botten som en polykarbonat filter med 12 ìm porer. En chemoattractant lösning är noga pipetteras till brunnen att initiera bildandet av en koncentrationsgradient.

Figur 2. Representativa uppgifter för groda spermier med två kammare spermier chemotaxis analys. Ägg vatten beretts av X. laevis ägg uppvisar en flerfasiga dos-aktivitet kurva som är karakteristisk för spermier chemoattractants. Bovint serumalbumin ökar spermiernas passage endast något - en ospecifik effekt av protein. Figur modifierad från Al-Anzi & Chandler ^5.

Film 1. Ett videoklipp som visar banor groda spermier ritas i rött på observation plattform av en Zigmond kammare. Bredden på plattformen är 1 mm. Klicka här för att se videoklippet.

Figur 3. Axis konventioner, en spermie krökt bana och en vektor för netto linjära resa plottas på Zigmond kammaren observation plattform. Uppgifter som erhålls är av tre typer. Första kan spermier banor själva (blå / guld pilar) avslöjar ett specifikt mönster such som cirklar och vänder (asterisker). Krökt avstånd och krökt hastigheter kan mätas för bana väg. För det andra, reste nätet linjära avståndet över hela banan, netto X (gradient) axel del av resor, kan nätet Y-axeln del av rese-och vinkeln theta mellan X-axeln och vektorn av årets resor beräknas för varje bana och jämfört med en fördelning över alla spårade spermier. Tredje momentana förändringar i hastighet och färdriktning för segment inom individuella banor kan studeras antingen individuellt eller som en population. Ovan är en från sidan av kammaren som presenteras i ett diagram.

Tabell 1. Parametrar som används ofta i att analysera data från Zigmond kammaren.

Discussion

Chemotaxis av celler rör sig antingen amöboid rörelse eller flageller-drivna simning finns i många biologiska sammanhang och undersöka detta fenomen kräver tillgång till praktiska och tillförlitliga analyser. Några exempel på fenomen, såsom dragning av spermier för att en sjöborre ägg eller insamling av cellerna slime mögel att bilda en fruktkropp kropp, få omedelbar visuell påverkan. Kvantifiering av detta fenomen har gjorts i en mängd olika sätt som beskrivs av Eisenbach ^18. Dessa analyser inkluderar användning av chemoattractant fylld kapillärer att locka spermier, användning av kapillärer gå reservoarer för att skapa en gradient och användning av en Makler kammare som har brunnar för spermier och chemoattractant. Detta dokument beskriver två "andra generationens" analyser som nu används mer frekvent. Även om dessa tester fortfarande är beroende av behovet av att skapa en gradient de innehåller flera nya funktioner. Första har två kammare analysen fördelen att många membran porer provtagning och analyserle spermier passage över gradienten snarare än en kapillär öppning som mer sperma för att testa lutningen i en enda analys.

Mönster av riktade cell rörelse är ett viktigt inslag i kemotaxi och det är naturligt att nya format för att spåra celler har utvecklats. Ett nytt format är tredimensionell skanning av spermier banor då de närmar sig ett ägg. Använda ett rörligt plan av infrarött ljus för att upptäcka spermier positioner, har Zimmer och kollegor som spermier bollbana data i en kammare med ägget centrerad - en enhet som använder naturliga chemoattractant källa och har en relativt avlägsen väggar som annars kan störa naturliga spermier rörelse ^19. Alternativt Corkidi et al. utvecklat ett system som kombinerar snabba rörelser av en lång arbetsdag avstånd objektiv med hög bildhastighet för att fånga tredimensionella banor ^20. Analys av spermier motioner i sådana enheter har nyligen underlättats genom användning av polära samordningTES ²¹ och Guerrero et al. har nyligen betonat behovet av tredimensionella observationer av spermier chemotaxis i framtida studier ^13.

Däremot är användningen av kartesiska koordinater underlättas av Zigmond kammare, en enhet som har utvecklats av Sally Zigmond för studier av neutrofil orientering och kemotaxi och först visat sig vara användbar i studiet av spermier chemotaxis av Giojalas och medarbetare ^2,3. Användning av en linjär tråg av chemoattractant snarare än en punkt källa chemoattractant gör en kemisk gradient som skall inrättas i ett XY-koordinatsystem snarare än en radiell koordinatsystem. Giojalas har tillämpat denna analys för att studera chemotaxis i sperma hos människor, möss, kaniner och styr och bekräftade bedömningen att vätskan från folliklar innehåller ett chemoattractant ^2,3,22. På senare tid har Giojalas och Eisenbach visat att progesteron avges från cumulus celler som omger ägget ocksåfungerar som en spermie chemoattractant ^23-26. Faktum är progesteron nyligen visats att utlösa öppnandet av Catsper kanaler i spermier att inleda kalcium signaler tanken att ändra spermier flagellar böjning och därmed ledning av spermier simmar ^27,28.

Den Zigmond kammaren har både fördelar och nackdelar. En fördel är optisk enkelhet i att spermierna hålls i en uppsättning fokalplanet och ingen scanning av Z-dimensionen är nödvändig. En annan fördel är att använda kartesiska koordinater som är mer bekant för de flesta utredare och uppmuntra testning av nya parametrar utarbetats med relativt vanlig matematik. Å andra sidan skapar Zigmond kammaren en situation som liknar den man ser i naturen. Spermierna är gjorda för att simma mellan två väggar på nära håll som kan påverka deras repertoar av flagellar vågformer såväl som resultatet av krafter som uppstår. Likaså är chemoattractant används vanligtvis kemiskaoch utspridda annorlunda än skulle uppstå ur ett ägg. Slutligen är spermier hålla sig till väggarna ett potentiellt problem som inte skulle finnas i ett tredimensionellt kammare.

Medan vissa forskare tyder på att spermier spårning är det enda tillförlitliga sättet att studera spermier chemotaxis kan dessa analyser att vara arbetsintensiva på både experimentella och dataanalys gradvis om semi-manuella istället automatiserade metoder används. Av denna anledning beskrivs analyser som de två kammare analysen här har använts för att ge kvantitativa och reproducerbara data som kan ge bevis för chemotaxis. Denna typ av analys har sitt ursprung i Boyden kammare, där en neutrofila fjädring placerades i kontakt med ytan av ett poröst filter barriär ^29. En chemoattractant lösning placerades i kontakt med den motsatta sidan av filtret så att en kemisk gradient för att bilda i filtret. Celler in i filtret matrisen kan vara antingen färgas och räknas microscopically eller, om märkt radioaktivt, räknat i ett scintillationsräknare. Denna metod utvecklades ytterligare med hjälp av stora porer polykarbonat filter genom vilket chemotaxing cellerna kan faktiskt passera som i de två kammare analysen beskrivs här ^5.

Tidigare har vi validerat två kammare analysen som ett mått på kemotaxi groda spermier. Först med hjälp av ägg vatten som lockmedel, har vi visat att stimulering av spermier passage genom filtret kräver att en koncentration gradient skapas genom nedfall av en enda droppe chemoattractant i botten. Om chemoattractant är spridda över hela den nedre kammaren bufferten genom att blanda, är spermier rörelsen inte stimuleras ^5. För det andra, skapandet av en "omvänd gradient" genom tillsats av chemoattractant till den övre kammaren stimulerar inte passagen av spermier. Slutligen finner vi att i experiment spermier spåra i Zigmond kammaren, spermierörlighet och hastighet ärinte minskat eller ändrat oavsett riktning spermier resor i förhållande till lutningen (Burnett, opublicerade observationer). Denna sista iakttagelse är viktigt eftersom det har påpekats att hämmare av spermierörlighet faktiskt kan bromsa eller stoppa spermier i närheten av kemiska källan därmed presentera en artefaktuella anhopning av spermier som skulle kunna misstas som chemotaxis ^18.

Trots dessa förbehåll har spermier ackumulering analyser såsom de två kammare analys visat sig vara mycket användbar arbetsbesparande verktyg som har varit avgörande för att karakterisera neutrofila chemotaxis för bakteriella peptider ^29,30, i den första upptäckten av däggdjur spermier chemoattraction till follikelvätskan och progesteron ^6,31,32 och i rening och karakterisering av grodan spermier chemoattractant allurin ^4,5,33.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	BD Biosciences	35/1147
12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane	EMD Millipore	PIXP01250	We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued
Zigmond chamber	Neuroprobe	Z02
Silicone oil	GE Healthcare	SF1154	Equivalent to Dow Corning 550 Fluid
Image J software	Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health	Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
MtrackJ software	Biomedical Imaging Group	Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
Virtual Dub software	GNU General Public Licensed	Free download via http://www.virtualdub.org/index.html	Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only
cellSens software	Olympus Corporation	See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070	Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability