साइटोसोलिक Ca के मापन ^{2 +} पृथक सिकुड़ा lymphatics में

Summary

हम एक दृष्टिकोण शुरू करने के लिए मूल्यांकन साइटोसोलिक Ca

Protocol

1. पशु

1. सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु देखभाल और लुइसियाना राज्य विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र में प्रयोग करें समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और गया राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच प्रकाशन सं 85-12, 1996 संशोधित) के दिशा निर्देशों के साथ अनुसार में प्रदर्शन किया. पुरुष Sprague-Dawley चूहों (चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं, 270-350 ग्राम शरीर wt) एक नियंत्रित तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) और नियंत्रित (00:12 घंटे प्रकाश अंधेरे चक्र) रोशनी वातावरण में रखे थे. आगमन के बाद, चूहों दशानुकूलन एक सप्ताह की अवधि के लिए प्रस्तुत किया गया और थे मानक चूहे (2018 Teklad ग्लोबल 18% प्रोटीन कृंतक आहार, Harlan) चाउ और पानी यथेच्छ प्रदान .

2. सेट - अप प्रयोग

1. बढ़ते lymphatics के लिए ग्लास micropipettes रेशा आयुध डिपो 1.2mm, आईडी 0.69mm (Sutter साधन 120-69-15 बीएफ) के साथ Borosilicate ग्लास से बना रहे हैं. एक ज्वलंत / ब्राउन micropipette डांड़ी पी 97 मॉडल (Sutter Instrum का उपयोग pipettes खींचो) ent और एक माइक्रो चक्की 400 उदा (Narishige) एक ~ 60 सुक्ष्ममापी बाहरी व्यास के साथ एक beveled टिप प्राप्त करने के साथ बेवल हैं.
2. पृथक पोत चैम्बर (CH-1 मॉडल, लिविंग सिस्टम, Burlington, VT) में micropipettes माउंट. pipettes प्रतिरोध (एक ही आकार खोलने) मिलान करना चाहिए.
3. चैम्बर (5 एमएल) और albumin शारीरिक नमक समाधान के साथ micropipettes (APSS, 1 टेबल देखें) भरें. सुनिश्चित करें कि वहाँ micropipettes या टयूबिंग में कोई बुलबुले हैं.
4. नेत्र sutures और प्रत्येक micropipette पर एक जगह के साथ समुद्री मील ओवरहैण्ड तैयार.

3. लसीका अलगाव संग्रह

1. Ketamine / xylazine के एक intramuscular इंजेक्शन (90 और 9 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः) के साथ पशुओं anesthetize, एक BD (1 मिलीलीटर) सिरिंज और सुई (बी.डी. अंतर्त्वचीय 26G3 बेवल / 8) का उपयोग.
2. पेट क्षेत्र को 70% करने के लिए बाँझ शराब के साथ स्प्रे, एक midline laparotomy प्रदर्शन, और अमल में लाना और आबकारी छोटी आंत और अन्त्रपेशी. आईसी में ऊतक प्लेसई - ठंड APSS. Ketamine / xylazine की एक ज्यादा के साथ जानवरों euthanize और सीने (के रूप में इच्छामृत्यु पर पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन के दिशानिर्देशों के अनुसार) खोलने के द्वारा मौत की पुष्टि.
3. एक विच्छेदन ठंडा APSS के साथ भरा कक्ष में अन्त्रपेशी का एक खंड पिन. ध्यान stereomicroscope की सहायता के साथ वसा और संयोजी ऊतक आसपास से एकत्रित लसीका वाहिका (8-20 सुक्ष्ममापी आंतरिक व्यास और लंबाई के 1-2 मिमी) टुकड़े करना. संदंश - आईनॉक्स Dumont 55 विदारक (ललित विज्ञान उपकरण 11255-20 #) और वसंत कैंची विदारक (ललित विज्ञान उपकरण 15000-03 #) का उपयोग करें. केवल एक वाल्व के साथ पृथक वाहिकाओं का प्रयोग प्रयोग के दौरान पूरे सेगमेंट में इष्टतम दबाव नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए.
4. पृथक पोत APSS के 5 मिलीलीटर युक्त चैम्बर के लिए पृथक लसीका स्थानांतरण. दो प्रतिरोध मिलान कांच micropipettes पर नेत्र sutures के साथ बांधने द्वारा पोत माउंट.
5. एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के लिए स्थानांतरण कक्ष (हमारा Nik हैते-2000U पर) एक क्सीनन दीपक (Sutter उपकरण Lambda LS2 डब्ल्यू 300), 340/380 फिल्टर पहिया प्रणाली (Sutter Chroma प्रौद्योगिकी 340 और 380 एनएम उत्तेजना फिल्टर के साथ Lambda 10-3), 510 एनएम dichroic (emitter Chroma प्रौद्योगिकी D510 के साथ सुसज्जित /) 80m, एक संवेदनशील सीसीडी कैमरा (Photometrics मुख्यालय ^2), और अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर (Nikon तत्वों ए.आर.) (चित्रा 1).
6. Micropipettes से या तो समायोज्य जलाशयों या सहायक प्रतिक्रिया पंप (लिविंग सिस्टम, इंस्ट्रुमेंटेशन, Burlington VT) प्रणाली है, जो दोनों दबाव और प्रवाह को बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उद्भव टयूबिंग संलग्न.
7. हीटिंग इकाई (लिविंग सिस्टम) के लिए कक्ष कनेक्ट और 37 डिग्री सेल्सियस स्नान सेट
8. Coverslip के माध्यम से सीधे एक 10X उद्देश्य (Nikon योजना Fluor 10x/0.3, L/N1 डीआईसी, ∞ 0.17 / 16.0 WD) के साथ चैम्बर के आधार में लसीका देखें. रैपिड समय चूक छवि सेट छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (हमारे सिस्टम Nikon तत्वों ए.आर. सॉफ्टवेयर है) का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.

[2 Ca ^+] _मैं ratiometric मापन

1. [Ca ^{2 +]} मैं पृथक लसीका चिकनी मांसपेशियों में ⁺ संवेदन डाई 2-acetoxymethyl (AM) एस्टर (आण्विक जांच, यूजीन, या) Fura Ca ² द्वारा मापा जाता है.
2. Fura-2 AM साथ स्नान का आदान प्रदान करने के लिए 37 में 30 मिनट के लिए Fura - 2 (2 सुक्ष्ममापी) AM और pluronic एसिड (0.2% wt / खंड) युक्त समाधान APSS द्वारा लसीका वाहिका ° लोड सी.
3. 30 मिनट के बाद स्नान वापस बदलने के लिए समाधान APSS. 2 बार कुल्ला स्नान समाधान से बाहर Fura-2 धोने. कम से कम 20 से पहले मिनट के एक संतुलन समय के लिए जहाज छोड़ दो ^{[Ca 2} _+] मैं माप की अनुमति सहज संकुचन की पुनः स्थापना .
4. अधिग्रहण प्रोटोकॉल है कि वैकल्पिक रूप से 50 प्रत्येक एमएस के durations के लिए 340 और 380 एनएम तरंगदैर्य पर illuminates के साथ पृथक lymphatics में ratiometric Fura 2 माप लीजिए. Chroma ते, फ्लोरोसेंट रोशनी एक dichroic दर्पण (400 एनएम के माध्यम से गुजरता हैchnology 400DCLP कार्पोरेशन) और एक विस्तृत बैंड उत्सर्जन फिल्टर (510 एनएम, 80 एनएम बैंड चौड़ाई, Chroma प्रौद्योगिकी कार्पोरेशन D510/80m) और Photometrics मुख्यालय ² कैमरे द्वारा अधिग्रहण कर लिया है. हम 2 सेमी एच ₂ हे की एक आधारभूत intraluminal दबाव पर डेटा के 2 मिनट इकट्ठा और के दो कदम बढ़ जाती है, 4, 6, 8 के दौरान, और 10 सेमी _एच 2 ओ
5. औसत विश्लेषण [Ca ^{2 +],} _मैं ब्याज की एक क्षेत्र (आरओआई) है कि पूरे लसीका वाहिका और आसपास के क्षेत्र में तो यह है कि पोत पूरी तरह से छूट और संकुचन (चित्रा 2) के दौरान लगाया है शामिल आकर्षित. यदि या तो micropipette देखने के क्षेत्र में इन क्षेत्रों रॉय में शामिल नहीं होना चाहिए. छोटे ROIs भी चुना जा सकता है, लेकिन छोटे ROIs के साथ एक संभावित समस्या यह है कि वाहिनियों की दीवारों से थोड़ा रॉय के अनुदैर्ध्य दिशा में कदम के रूप में पोत constricts और आराम हो सकता है. एक अन्य संभावित समस्या है कि कुछ वाहिकाओं संकुचन के दौरान मोड़, और इन lymphatics अध्ययन के लिए नहीं किया जाना चाहिए. गुई घुमा गतियों आमतौर पर <1 मिमी पृथक लसीका की लंबाई को सीमित करने से परहेज कर रहे हैं. इसके अलावा, कभी कभी एक वाल्व के दोनों तरफ क्षेत्रों कसना / नहीं synchrony में आराम करते हैं. इस मामले में, क्योंकि इन क्षेत्रों को अलग कार्यात्मक lymphangions का प्रतिनिधित्व करते हैं, तो लसीका वाल्व के केवल एक तरफ का अध्ययन किया जाना चाहिए, या प्रत्येक lymphangion दोनों तरफ रखा रॉय के साथ अलग से अध्ययन कर सकते हैं. जब एक 10X उद्देश्य का उपयोग कर, वाहिनियों की दीवारों phasic संकुचन के दौरान ध्यान में रहना है, लेकिन अगर वहाँ है कि ध्यान से बाहर संकुचन के दौरान इन क्षेत्रों रॉय में शामिल नहीं किया जाना चाहिए दीवारों के किसी भी हिस्से हैं चाहिए. एक पृष्ठभूमि रॉय भी प्रयोग किया जाता है और पोत (जैसे छवि के कोने में) से दूर रखा जाना चाहिए. 340/380 अनुपात में वृद्धि ^[2 Ca ^+] _मैं में वृद्धि इंगित करता है. विभिन्न बिंदुओं पर समय luminal व्यास भी या समय पर वाहिनियों की दीवारों पर नज़र रखने सॉफ्टवेयर उपाय समारोह का उपयोग कर सकते हैं मापा जा (अनुभाग 6 को देखें) <./ Li>

5. दबाव नियंत्रण प्रोटोकॉल

1. लगाया प्रवाह के स्वतंत्र दबाव का अध्ययन करने के लिए, सहायक अशक्त प्रतिक्रिया पंप से ही दबाव प्रत्येक micropipette के लिए लागू किया जाना चाहिए. प्रत्येक micropipette से टयूबिंग आम पंप पर घुड़सवार टयूबिंग के लिए टी संबंधक के माध्यम से जुड़ा हुआ है. शुरू में 45-60 मिनट, जो काफी समय लसीका सहज संकुचन के विकास की अनुमति देने के लिए ₂ सेमी एच 2 हे intraluminal दबाव सेट.
2. अध्ययन के लिए केवल वाहिकाओं है कि संतुलन की अवधि के भीतर निम्नलिखित मानदंडों को पूरा उपयोग करें: (1) पोत ₂ एच 2 हे सेमी पर सहज स्वर विकसित, पोत (2) नियमित रूप से, सहज संकुचन है कि पोत की लंबाई भर में काफी समान हैं विकसित . अक्सर एक वाल्व से बहाव क्षेत्र पोत के बाकी की तुलना में अधिक constricts, और इन जहाजों के रूप में लंबे समय के रूप में वहाँ सबूत है कि जहाज के शेष सिकुड़ा गतिविधि प्रदर्शित करता है इस्तेमाल किया जाएगा.
3. दबाव कदम प्रक्रिया के दौरान तेजी से समय चूक छवियों रिकॉर्ड. प्रत्येक के लिए, दबाव 30 एस के लिए 2 सेमी एच ₂ हे पर शुरू, और करेंगे तो 2 द्वारा एक कदम में उठाया है, 4, 6, 8, या एक मिनट के लिए 10 सेमी एच ₂ हे, और वापस कम 2 सेमी 30 एस के लिए एच ₂ हे
4. दबाव कदम श्रृंखला के पूरा होने के बाद 37 ⁺ मुक्त APSS ² Ca ° सी स्नान समाधान को बदलने के लिए ऊपर luminal दबाव के प्रत्येक पर अधिक से अधिक निष्क्रिय व्यास (अधिकतम डी) और ^{सीए 2} + प्रतिदीप्ति माप उपाय . अधिकतम डी टोन की गणना और विभिन्न आकारों की lymphatics बीच डेटा को मानक के अनुसार करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

6. लिम्फेटिक सिकुड़ा पैरामीटर्स

1. समय पर पोत व्यास में परिवर्तन सबसे छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर संकुल में वस्तु ट्रैकिंग उपकरण का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है. यह केवल चैनलों की एक (हम 340 एनएम चैनल का उपयोग करें, लेकिन 380 चैनल भी इस्तेमाल किया जा सकता है) का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. एक विपरीत दहलीज बॉक्स हैछवि ढेर झूठ बोला ताकि वाहिनियों की दीवारों पर प्रकाश डाला जाता है, और तब प्रत्येक दीवार ROIs शामिल करने के लिए उन्हें समय पर ट्रैक करने के लिए तैयार कर रहे हैं (चित्रा 3). आंतरिक व्यास प्रत्येक दीवार के केन्द्रक को मापने और दो centroids के बीच की दूरी की गणना के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है है एक दीवार की मोटाई का आधा शून्य,.
   एक दूसरा विकल्प है जब यह मुश्किल है के लिए प्रत्येक luminal क्षेत्र में एक मजबूत संकेत करने के लिए कारण दीवार ट्रैक के लिए बाहरी व्यास को मापने, और एक सुधार वाहिनियों की दीवारों की एक स्थिर माप आंतरिक व्यास प्राप्त करने के आधार पर कारक का उपयोग करने के लिए है. इस मामले में, रॉय spans पूरे पोत और बाहरी व्यास (3 चित्रा बी) लगाया है. इस विधि को भी पूरे देखा जा सकता लसीका के क्रॉस अनुभागीय क्षेत्र (चित्रा 3 सी) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Lymphangion के विशिष्ट आकार के कारण, बाद इस तरल पदार्थ की वास्तविक मात्रा के एक बेहतर अनुमान चयनित भाग में व्यास का उपयोग कर से प्रत्येक संकुचन के साथ पंप विकल्प प्रदान कर सकते हैंपोत के.
2. समय चूक अध्ययन से निर्धारित लसीका luminal व्यास ^4,12,13 माप के निम्न पैरामीटर:
   संकुचन आवृत्ति (CF), प्रति मिनट phasic संकुचन की संख्या की गणना के द्वारा निर्धारित है.
   डायस्टोलिक (EDD) व्यास, जो सिर्फ एक phasic संकुचन पहले व्यास है अंत.
   अंत सिस्टोलिक (ESD) व्यास, phasic संकुचन के अंत में व्यास.
   संकुचन के आयाम (एएमपी = EDD-ESD), स्ट्रोक की मात्रा का एक सरल सूचकांक.
   प्रत्येक दबाव में निष्क्रिय अधिक से अधिक व्यास (अधिकतम डी, ² CA में निर्धारित ⁺ मुक्त शर्तों), जो लसीका चिकनी मांसपेशियों द्वारा उत्पन्न टोन निर्धारित किया जा सकता है, और है भी अलग व्यास के lymphatics के बीच डेटा को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया या वही लसीका विभिन्न luminal दबाव पर अध्ययन किया.
   ₁ EDD, जो एक दबाव कदम के बाद पहली संकुचन के साथ जुड़े EDD है . यह एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में प्रयोग किया जाता है जबluminal ⁵ दबाव में एक कदम बढ़ाने के लिए प्रतिक्रिया में एक लसीका पोत के myogenic कसना निर्धारण.
   / अधिकतम डी - दबाव कदम के बाद एक पृथक लसीका के Myogenic कसना EDD में सामान्यीकृत दबाव कदम वृद्धि = 100 * ₍₁ EDD EDD) निम्नलिखित परिवर्तन द्वारा प्रतिनिधित्व किया है .
   अतिरिक्त चर कि लेकिन गणना की जा सकती है और ^कहीं और 4 में विस्तार से चर्चा कर रहे हैं:
   / अधिकतम डी, सामान्यीकृत एएमपी = डी / एएमपी अधिकतम = * 100 (EDD अधिकतम डी) स्वर
   स्ट्रोक की मात्रा (SVI) सूचकांक = π ⁽² EDD - ESD ²⁾
   इंजेक्शन फ्रैक्शन (एफई) = / SVI (πEDD2)
   वॉल्यूम प्रवाह सूचकांक (VFI) = सीएफ़ एक्स SVI.

7. प्रतिनिधि परिणाम:

प्रत्येक phasic संकुचन की शुरुआत में, ^[2 Ca ^+] _मैं (चित्रा 4) में एक क्षणिक वृद्धि हुई थी. Luminal दबाव में कदम बढ़ जाती है के बाद इसके अलावा, आवृत्ति ^के 2 ^Ca + यात्रियों और पीhasic संकुचन synchrony में वृद्धि हुई है. इन टिप्पणियों पिछले एक वक्ष एक तार ¹⁴ myograph पर घुड़सवार और पिछले oscillatory Ca ^{2 +} phasic सिकुड़ा चक्र ¹⁵ अंतर्निहित तंत्र में आंतरिक दुकानों से रिहाई के लिए एक केंद्रीय भूमिका का संकेत डेटा का समर्थन नलिकाओं का उपयोग कर खोजने के लिए समान हैं.

हम भी जांच क्या [ca ^{2 +]} हृत्प्रसार के दौरान _मैं (Ca ² के ^बीच + यात्रियों और phasic संकुचन) लसीका टोन और myogenic खिंचाव द्वारा कारण कसना जब दबाव में कदम बढ़ जाती है (चित्रा 5) लगाया जाता है के साथ जुड़ा हुआ है. 4 सेमी एच ₂ हे और अनुशिथिलन के दौरान उच्च, Ca ^{[2 +]} _मैं दबाव कदम (चित्रा 5B) के लिए पूर्व आधारभूत की तुलना में तेजी से वृद्धि हुई है, के दबाव में तुरंत कदम बढ़ जाती है के बाद. इसके अलावा, व्यास में प्रारंभिक वृद्धि के बाद दबाव में कदम ₍₁ EDD) बढ़ जाती है के कारण, वहाँ myogenic कसना ( चित्र था5C ure), ₁ EDD से EDD में पिछले ^5,12 रिपोर्ट में कमी के रूप में परिभाषित किया. जब अलग दबाव चरणों के बीच मतलब EDD में सामान्यीकृत परिवर्तन की तुलना, वहाँ आठ की वृद्धि के बाद काफी अधिक कसना _था और 10 एच 2 _हे सेमी +2 एच 2 हे सेमी (चित्रा 6) की तुलना में. में लगातार वृद्धि ^[2 Ca ^+] _मैं भी दबाव से संबंधित था के छह कदम बढ़ जाती है, 8, और 10 सेमी एच ₂ हे ² CA में काफी अधिक परिवर्तन के कारण के साथ, ² + की तुलना में एच ₂ हे सेमी ( चित्रा 6) बी. हालांकि, दबाव कदम Ca ^{2 +} रिश्ता इन के रूप में अच्छी तरह से दबाव में पठार के लिए प्रकट होता है. इन परिणामों का सुझाव है कि एक ^{CA 2} + निर्भर तंत्र लसीका खिंचाव प्रतिक्रिया में myogenic कसना के साथ जुड़ा हुआ है. हालांकि, दबाव कदम Ca ² में पठार ⁺ रिश्ता एक तंत्र है कि ² Ca बढ़ जाती है ⁺ संवेदनशीलता भी वृद्धि हुई myogenic constri करने के लिए योगदान कर सकते हैं पता चलता हैउच्च दबाव चरणों पर ction.

1. माइक्रोस्कोप की माप के लिए इस्तेमाल किया प्रणाली के योजनाबद्ध ^[2 Ca ^+] _मैं एक अलग लसीका में चित्रा. पृथक लसीका कक्ष उलटा माइक्रोस्कोप के मंच पर रखा गया है. नमूना वैकल्पिक रूप से 340 और 380 एनएम पर प्रबुद्ध है, और फ्लोरोसेंट लसीका द्वारा उत्सर्जित संकेत एक सीसीडी कैमरे के साथ एकत्र की है और एक व्यक्तिगत कंप्यूटर में संग्रहीत. लसीका के intraluminal दबाव सहायक अशक्त प्रतिक्रिया प्रणाली द्वारा नियंत्रित किया जाता है. उपयोगकर्ता सिस्टम के लिए दबाव सेट, और दबाव transducers लसीका के साथ लाइन में राय प्रणाली, या जो गतिशील रूप से बढ़ा सकते हैं एक पंप के माध्यम से कम दबाव intraluminal दबाव रिले.

चित्रा 2 ब्याज क्षेत्र (आरओ का उदाहरण है .मैं चयन) के Fura 2 पृथक लसीका वाहिकाओं में ratiometric इमेजिंग अध्ययन के लिए. चयनित क्षेत्र (micropipettes छू क्षेत्रों को छोड़कर) पोत और आसपास के क्षेत्र के सबसे शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें पोत पूरे समय के पाठ्यक्रम के लिए नज़र रखी जाएगी. एक पृष्ठभूमि रॉय (ऊपरी दाएँ कोने) भी आसपास के स्नान से nonspecific संकेत को खत्म करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 3 ट्रैकिंग पंप लसीका के लिए तरीके . ए आंतरिक व्यास समय पर निर्धारित किया जा सकता है ROIs का उपयोग कि वाहिनियों की दीवारों का ट्रैक आंदोलन. बी जब विपरीत दहलीज पूरे पोत को शामिल करने के लिए सेट कर दिया जाता है, बाहरी व्यास के साथ एक एकल रॉय ट्रैक किया जा सकता है. आंतरिक व्यास दीवार मोटाई के लिए सही द्वारा इन मापों से अनुमान लगाया जा सकता है सी . एक अन्य विकल्प के लिए क्षेत्र पोत द्वारा encompassed, जो दीवार मोटाई के लिए सही मात्रा की गणना कर सकते हैं और इस्तेमाल किया ट्रैकलसीका संभालने बेलनाकार ज्यामिति है.

चित्रा 4 के बीच रिश्ते ^[2 Ca ^+] _मैं और लसीका व्यास. एक अलग लसीका में तीव्रता Fura 2 (गर्मी नक्शा प्रारूप) की एक समय व्यतीत हो वीडियो से प्रतिनिधि छवियाँ. प्रत्येक छवि में तीर पोत के बाहरी व्यास रूपरेखा. Image 1 हृत्प्रसार के दौरान अपेक्षाकृत कम ^{[Ca 2} _+] मैं के साथ, लसीका से पता चलता है. छवि 2 में, वाहिनियों की दीवारों में 340/380 अनुपात बढ़ जाती है की तीव्रता, बस से पहले phasic संकुचन है कि 3-5 छवियों में होता है. 4 छवि, Ca ^{2 +} क्षणिक समाप्त है, और 5 छवि द्वारा, सिस्टोलिक चरण समाप्त हो गया है और पोत उसके आराम की स्थिति में लौट रहा है बी. ^[2 Ca ^+] _मैं और लसीका luminal व्यास की एक साजिश से पता चलता है कि में ^एक क्षणिक वृद्धि ^[2 _{Ca +]} मैं बस से प्रत्येक के लिए पूर्व होता हैphasic संकुचन.

चित्रा 5 लसीका में परिवर्तन [Ca ^{2 +]} _मैं और लसीका सिकुड़ा चक्र के जवाब में. दबाव में वृद्धि के कदम के लिए. दबाव कदम (ए) प्रोटोकॉल, 340/380 अनुपात डेटा ^[2 Ca ^+] _मैं (बी), और लसीका व्यास से अधिक समय (सी) में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व दिखाए जाते हैं . ए बेसलाइन luminal दबाव था 2 सेमी एच ₂ हे और लसीका वाहिका दो की बढ़ जाती है, 4, 6, 8 कदम अधीन था, और 10 सेमी एच ₂ ओ प्रत्येक दबाव कदम रिकॉर्डिंग के बीच समय अंतराल 1-2 मिनट था. प्रत्येक दबाव कदम दोनों में क्षणिक बढ़ जाती है की आवृत्ति में वृद्धि के ^कारण होता है ^[2 _Ca +] मैं (बी) और phasic संकुचन ( सी). लिम्फेटिक व्यास भी luminal दबाव में प्रत्येक कदम वृद्धि के साथ वृद्धि हुई है, और +4 +10 सेमी एच ₂ हे दबाव चरणों के लिए, वहाँ EDD में एक प्रारंभिक कमी है कि वायुसेना हुई थीआतंकवाद EDD1 (सी), पहले लसीका myogenic कसना के रूप में वर्णित है. वहाँ भी बेसल में एक स्थिर वृद्धि हुई थी ^[2 Ca ^+] _मैं तुरंत दबाव में प्रत्येक कदम वृद्धि (बी) के बाद यात्रियों के बीच . myogenic कसना बड़ा दबाव कदम के साथ और अधिक स्पष्ट किया गया था, लेकिन बेसल ^{[2 Ca} +] में _{वृद्धि} मैं लगभग +4 करने के लिए +10 सेमी एच ₂ हे दबाव कदम (बी) के लिए ही किया गया था. एक पहले की रिपोर्ट एएमपी में प्रतिपूरक वृद्धि भी +6 करने के लिए +10 सेमी एच ₂ हे (सी) के दबाव कदम के बाद स्पष्ट किया गया था .

चित्रा 6 myogenic कसना और लसीका ^{[+ 2} Ca] _मैं हृत्प्रसार के दौरान मुफ्त में क्रमिक वृद्धि दबाव में कदम बढ़ जाती है के बाद शीघ्र ही. EDD _एक के बाद 30-50 के बीच EDD औसत प्रत्येक दबाव कदम के लिए सामान्यीकृत EDD में परिवर्तन की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है बी.. 340/380 EDD _एक के बाद अनुपात 30-50 एस की तीव्रता आधारभूत दौरान औसत 340/380 अनुपात (2 सेमी एच ₂ हे) द्वारा विभाजित किया गया था . * पी <0.05 2 सेमी एच ₂ हे दबाव कदम बनाम. एन = 4 जहाजों का अध्ययन किया.

1 मूवी को एक अलग लसीका अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया बर्तन में phasic संकुचन के उदाहरण. luminal दबाव 2 सेमी एच ₂ ओ में स्थापित किया गया था elapsed समय और एक पैमाने पर पट्टी के नीचे दिखाई जाती हैं. समय चूक छवियों को एक 10X पारेषित प्रकाश का उपयोग करने के उद्देश्य से एकत्र किए गए थे. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मूवी पंप पृथक लसीका में 2. Ratiometric इमेजिंग Fura-2. एक गर्मी नक्शे पैमाने ऊपर छोड़ दिया पर दिखाया गया है और elapsed समय और पैमाने पट्टी के नीचे दिखाई जाती हैं. दबाव के शुरू में ₂ एच 2 हे सेमी में स्थापित किया गया था और 8 सेमी _एच 2 हे करने के लिए उठाया गया था .5 मिनट और returne में शुरूघ 1.5 मिनट में 2 सेमी एच ₂ हे. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

Discussion

तरीकों का एक उपन्यास संयोजन लसीका वाहिकाओं के आंतरिक पंप अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया था. के लिए एक साथ में बदलाव को मापने की क्षमता ^[2 Ca ^+] और _मैं पम्पिंग lymphatics में व्यास ² Ca के रिश्तेदार योगदान ⁺ निर्भर और ² Ca ⁺ sensitizing समग्र शासी लसीका सिकुड़ा चक्र तंत्र में संकेत दे रास्ते के अध्ययन के लिए अनुमति देगा

लसीका सिकुड़ा चक्र phasic टोन से अधिक आरोपित संकुचन के होते हैं. आंकड़े बताते हैं कि प्रत्येक phasic संकुचन ^[2 Ca ^+] _मैं में एक क्षणिक वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है, pacemaking ^{तंत्र +} 2 सीए के एक केंद्रीय भूमिका सुझाव है, और है कि आवृत्ति ^के 2 ^Ca + यात्रियों luminal दबाव में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है . हमारे आंकड़े भी बताते हैं कि दबाव में तेजी से वृद्धि बेसल में एक स्थिर वृद्धि प्रकाश में लाना कर सकते हैं ^[2 Ca ^+] _मैं यात्रियों के बीच. यह वृद्धि करने के लिए योगदान कर सकते हैंmyogenic कसना कि luminal दबाव में कदम बढ़ जाती है निम्नलिखित lymphatics एकत्र करने में मनाया जाता है. हालांकि, हम इस बेसल में बढ़ जाती है की एक पठार मनाया ^[2 Ca ^+] _मैं 6 से 10 सेमी एच ₂ हे, जो myogenic कसना की डिग्री अलग था लेकर दबाव कदम के साथ . इस डेटा से पता चलता है कि एक और ^{तंत्र, संभवतः} एक 2 Ca + sensitizing तंत्र, के दबाव के myogenic जवाब में भी शामिल है.

इन अध्ययनों के साथ एक धारणा यह है कि मापा ^{Ca +} 2 के बहुमत चिकनी पेशी में निहित है . हालांकि, endothelial कोशिकाओं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं कि lymphatics में मौजूद हो सकता है ^{2 +} Ca समग्र मनाया [Ca ^{2 +]} _मैं, इसलिए मापा मूल्यों शायद चिकनी पेशी का एक अत्यधिक [Ca ^{2 +]} _मैं भी योगदान lymphatics. कोई Ca ^{+ 2} endothelium से मापा सीधे योगदान करने के लिए उम्मीद नहीं हैचिकनी मांसपेशी संकुचन arterioles ¹⁶ में पिछले अध्ययनों के आधार पर. यह समस्या भविष्य में जो lymphatics endothelium के denuded हैं प्रयोगों में संबोधित किया जायेगा.

जब ratiometric रंगों का उपयोग का आकलन ^{[2 Ca} _+] मैं कोशिकाओं या ऊतकों, नमूना के आंदोलन कलाकृतियों पैदा कर सकता है . Lymphatics करार में आंदोलन कलाकृतियों को कम करने के लिए, हम एक रॉय के रूप में संभव के रूप में में पोत के ज्यादा 340/380 अनुपात का निर्धारण भी शामिल है का उपयोग किया. हम भी केवल वाहिकाओं है कि उनके सिकुड़ा चक्र के दौरान ध्यान में रहने का अध्ययन. क्योंकि संभावित कलाकृतियों कि पोत आंदोलन से उठता है, बजाय हो सकता है निर्धारित निरपेक्ष ^[Ca + _2] मैं एक विशेष साइट पर, हम पोत के एक बड़े क्षेत्र के लिए औसत प्राप्त करते हैं. हम औसत में रिश्तेदार परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित ^{[Ca 2} _+] मैं समय और कैसे इन परिवर्तनों से संबंधित जहाजों के phasic और टॉनिक संकुचन पर .

सारांश देते^[2 Ca ^+] _मैं में परिवर्तन की पृथक एकत्रित lymphatics में ratiometric इमेजिंग द्वारा rmination समझने Ca ² के लिए एक शक्तिशाली उपकरण ⁺ निर्भर और ² Ca ⁺ sensitizing लसीका सिकुड़ा चक्र अंतर्निहित तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है इस विधि के साथ, भविष्य अध्ययन चयनात्मक agonists या inhibitors के विभिन्न संकेत पारगमन मार्ग के उपयोग में भी मदद अद्वितीय आणविक लसीका चिकनी मांसपेशियों में phasic बनाम टॉनिक संकुचन अंतर्निहित तंत्र अलग होगा.