細胞質のCaの測定 ^{2 +}絶縁収縮リンパ管における

Summary

我々は、細胞質のCaを評価するアプローチを紹介

Abstract

リンパ管は、流体の恒常性を維持する中心的な循環する脂質を提供し、潜在的に有害な抗原のための監視システムとして機能する、粘膜免疫と適応免疫応答^1を最適化する多機能搬送システムを含む。リンパは、ブラインドエンドの初期リンパ管に入り、その後大規模な収集リンパ管に圧力勾配に逆らって輸送される間質液から形成される。各収集リンパ管は、逆流を防ぐ二尖弁で区切られたlymphangionsと呼ばれる一連のセグメントから構成されている。 Each lymphangionは、中心循環^2の方向の圧力勾配に逆らってリンパ液を推進収縮サイクルを持っています。この相動性収縮パターンは、収縮期および拡張期の段階で、心周期に類似しており、低収縮の頻度^4。さらに、リンパ管平滑筋のトーンを生成し、筋原性収縮と膨張を表示されるiそれぞれ管腔の圧力の増減について^、5〜n個の応答。リンパ管の相動性および持続性収縮性の両方をサポートしている分子メカニズムのハイブリッドは、このように提案されている。

平滑筋の収縮は、一般的に細胞質ゾルのCa ²によって規制されています⁺濃度（[Ca ^{2 _+]} iの）のCa ^2〜プラス感受性^+、セル^6を取り巻く環境の変化に応答して、収縮要素の。 〔Ca ^{2 +]} _iは原形質膜のリガンドまたは電位依存性Ca ^{2 +}チャネルと内部貯蔵からのCa ^{2 +}の放出と取り込みを介してのCa ^{2 +}の動きの組み合わせによって決定されます。細胞質ゾルのCa ^{2 +}カルモジュリンに結合し、そのようなミオシン軽鎖の酵素を活性化（MLC）順番にMLCはアクチン-ミオシンを介する収縮⁸につながるリン酸化するキナーゼ（MLCK）、。ただし、CAへのこの経路の感度（MLCP）9により調整することができます。 MLCP活性は、Rhoキナーゼ（ROCK）とミオシンホスファターゼ阻害タンパク質CPI - 17によって制御されている。

ここで、我々は、Ca ^{2 +}依存性とCaのリンパ管平滑筋収縮の^{2 +}増感メカニズムを研究するために、孤立した、潅流リンパ管に時間をかけて[Ca ^{2 _+]} iの変化を評価する方法を提示する。リンパ管を収集する単離されたラットの腸間膜を用いて、我々は〔Ca ^{2 +]} _iと収縮活性の延伸による変化を調べた。孤立リンパモデルは、圧力、流量、および浴溶液の化学組成が厳密に制御できるという利点を提供しています。の[Ca ^{2 +]} _iはレシオメトリックは、Ca ^{2 +}結合色素フラ-2でリンパ管をロードすることによって決定された。これらの研究は、一過性調節する別の分子メカニズムを研究の広範な問題に新しいアプローチを提供しますリンパ管平滑筋の強直収縮に対する収縮。

Protocol

1。動物

1. すべての手順は、ルイジアナ州立大学健康科学センターでの動物実験使用の委員会によって承認されたと米国立衛生研究所（NIH出版番号85から12まで、1996年改訂）のガイドラインに従って行った。雄のSprague - Dawleyラット（チャールズリバー研究所、270〜350グラム本体重量）が制御された温度（22℃）と制御の照明（12:12 hの光暗サイクル）の環境で飼育し​​た。到着後、ラットは一週間の順化期間に提出され、標準のラット飼料（2018 Tekladグローバル18％の蛋白質のげっ歯類のダイエット、ハーラン）と水を自由に提供されていました。

2。実験セットアップ

1. 取り付けリンパ管用ガラスマイクロピペットはフィラメント径1.2ミリメートル、ID 0.69ミリメートル（サターインストゥルBF 120-69-15）とホウケイ酸ガラスから作られています。フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーモデルP - 97（サッターINSTRUMを使用してピペットを引っ張るENT）と〜60μmの外径と面取り先端を得るためにマイクログラインダーEG 400（ナリシゲ）とベベルです。
2. 摘出血管チャンバー（モデルCH - 1、リビングシステム、バーリントン、バーモント州）でマイクロピペットをマウントします。ピペットは、（同じサイズの開口部）抵抗を一致させる必要があります。
3. アルブミン - 生理食塩水でチャンバー（5 mL）およびマイクロピペットを埋める（APSS、表1を参照）。マイクロピペットやチューブ内に気泡がないことを確認します。
4. 眼科縫合糸および各マイクロピペット上の場所いずれかでノットをオーバーハンドの準備。

3。リンパのアイソレーションを収集

1. BDシリンジ（1ml）と針（BD皮ベベル26G3 / 8）を使用して、ケタミン/キシラジンの筋肉内注射（それぞれ90および9 mg / kgの、）で動物を麻酔。
2. 、殺菌に70％アルコールで腹部領域を吹き付けます正中開腹術を行い、小腸と腸間膜を露出させると消費税。 IC内の組織を配置電子冷たいAPSS。ケタミン/キシラジンの過剰摂取で動物を安楽死させると（安楽死についてアメリカ獣医学協会のガイドラインに従って）胸を開くことによって、死を確認する。
3. 氷冷APSSで満たされた解剖室内の腸間膜のセクションをピン。慎重に実体顕微鏡の助けを借りて、脂肪と結合組織を周囲から収集するリンパ管（80〜200μmの内径と長さ1〜2 mm）を解剖。 （ファイン科学ツール＃15000〜03）デュモン鉗子- INOX 55解剖（ファイン科学ツール＃11255〜20）と春のはさみを解剖使用。実験中に、セグメント全体での最適な圧力制御を確保するためにだけ1つのバルブで分離された容器を使用してください。
4. APSS 5 mlを入れた絶縁容器チャンバーに分離されたリンパ管を転送する。眼科縫合糸で結ぶことにより、2つの抵抗をマッチさせたガラスのマイクロピペットの上に容器をマウントします。
5. 倒立蛍光顕微鏡にチャンバーを転送する（我々のはニックです。TE - 2000U上）キセノンランプ（サターインスツルメンツラムダLS2 300 W）、380分の340フィルターホイールシステム（クロマテクノロジー340と380 nmの励起フィルターとサターラムダ10-3）、510 nmのダイクロイックエミッタ（クロマテクノロジーのD510を装備/ 80メートル）、感度CCDカメラ（Photometrics HQ ^2）、および取得するためのソフトウェア（ニコン要素AR）（図1）。
6. どちらかの調整可能な貯水池に、サーボフィードバックポンプシステム（生命システムの計装、バーリントンバーモント州）にマイクロピペットから発信されたチューブ、圧力および流量を変更するために使用することができます両方を取り付けます。
7. 加熱ユニット（生活システム）にチャンバーを接続し、37℃にバスを設定する
8. 10X目標（ニコンプランフルアー10x/0.3、DIC L/N1、∞/ 0.17、WD 16.0）とチャンバーの底にカバースリップを介して直接リンパを見る。迅速なタイムラプス画像セットは、画像取得ソフトウェアを（私たちのシステムはニコンの要素ARのソフトウェアを持っている）を使用して取得することができます。

2 _+] iのレシオメトリック測定

1. の[Ca ^{2 +]} iの孤立リンパ管平滑筋のCa ^{2 +}感知染料フラ2 -アセトキシメチルエステル（AM）（モレキュラープローブ、オレゴン州ユージーン）によって測定されます。
2. 37℃で30分間フラ-2 AM（2μM）及びロニック酸（0.2％重量/体積）を含む溶液をAPSSに浴室を交換することにより、フラ-2午前とリンパ管をロード℃に
3. 30分後に溶液をAPSSに戻って風呂に変更。浴溶液からフラ-2を洗い流すために2回すすいでください。 [Ca ^{2 _+]} iの測定値は自発的な収縮の再確立を許可する前に、少なくとも20分の平衡時間のための容器のままにしておきます。
4. 代わりに50ミリ秒ごとの期間のため340と380nmの波長で点灯買収プロトコルを使用して分離されたリンパ管のレシオメトリックフラ-2測定値を収集する。クロマTeを、蛍光灯は、ダイクロイックミラー（波長400nmを通過chnology株式会社400DCLP）と広帯域発光フィルター（510 nmの80 nmのバンド幅、クロマテクノロジー社D510/80m）とPhotometrics HQ ²カメラによって取得されます。我々は、H ₂ Oとステップ2の増加、+4、+6、+8、そして10センチメートル中のH _{2 O} 2 cmのベースライン管腔内圧でデータの2分を収集する
5. 平均を分析するには[Ca ^{2 _+]} iの、全体のリンパ管と血管が完全に弛緩と収縮（図2）中に追跡されるように、周辺地域を含む関心領域（ROI）を描く。どちらかのマイクロピペットを視野内にある場合はこれらの領域は、ROIに含まれるべきではない。小さいROIをも選択することができます、しかし、小さなROIを持つ潜在的な問題は、血管が収縮と弛緩と血管壁がROIのうち長手方向に若干移動する可能性があるということです。別の潜在的な問題は、一部の血管は収縮時にねじれていることであり、そしてこれらのリンパ管は、試験には使用しないでください。目Eのねじれの動きは通常<1 mmから分離されたリンパ管の長さを制限することによって回避されています。さらに、場合によってはバルブの両側のセグメントが収縮していない/同期してリラックス。このケースでは、これらのセグメントは独立した機能的なlymphangionsを表すため、リンパ管はバルブの片側のみに検討する必要がある、または各lymphangionはどちら側に配置されたROIを使用して個別に研究することができる。 10倍対物レンズを用いてする場合は、血管壁は相動性収縮時の焦点に留まる必要がある、しかし収縮の間にピントが合って行く壁のいずれかのパーツがあるかどうかをこれらの領域は、ROIに含まれるべきではない。バックグラウンドのROIにも使用され、容器（画像の隅にあるなど）から遠くに配置する必要があります。 380分の340の比率の増加は、[Ca ^{2 _+]} iの増加を示している。様々な時点で血管径も（セクション6を参照）、ソフトウェアの測定機能を使用するか、時間をかけて血管の壁を追跡することによって測定することができます。</ LI>

5。圧力制御プロトコル

1. 課されたフローの独立した圧力を調べるために、同じ圧力をサーボヌルフィードバックポンプにより各マイクロピペットに適用する必要があります。各マイクロピペットからチューブをポンプに搭載された一般的なチューブにT -コネクタを介して接続されている。最初は45から60分間、H ₂ O ₂ cmの管腔内圧を設定する。、リンパ管自発収縮の開発を可能にする十分な時間である。
2. 、（1）容器は2cm H ₂ Oで自発的なトーンを開発（2）容器は、容器の長さにわたって合理的に均一である規則的な、自発的な収縮を開発：研究のために平衡期間内に以下の基準を満たす唯一の船を使用してください。多くの場合、バルブからの領域の下流には、容器の他の部分よりも多くを収縮し、これらの血管は、長い容器の残りの部分は収縮活性を示すという証拠があるとして使用されます。
3. 圧力ステップの手順の間に急速なタイムラプス画像を記録します。それぞれについて、圧力は30秒のためのH ₂ O ₂ cmで開始されますし、+2、+4、+6、+8、または+10センチのステップで1分間H ₂ Oを発生し、戻って下げ2センチメートル30秒のためのH ₂ Oへ
4. 圧力ステップのシリーズ終了後、上記の内腔の圧のそれぞれで最大パッシブ直径（最大D）とCa ^{2 +}蛍光測定値を測定するために⁺ -フリーAPSS 37のCa ^2℃に浴溶液を変更してください。マックスDは、トーンを計算し、異なる大きさのリンパ管との間でデータを正規化するために使用されます。

6。リンパ管収縮パラメータ

1. 時間をかけて血管径の変化は、ほとんどの画像解析ソフトウェアパッケージにオブジェクトトラッキングツールを使用して決定することができる。これは、チャネル（我々は340nmのチャネルを使用するが、380チャンネルも使用することができます）の一方のみを使用することによって達成することができます。コントラストのしきい値は、アプリです。血管壁が強調されるように画像のスタックに嘘をつき、その後、各壁を包含したROIの時間（図3）上にそれらを追跡するために描画されます。内径は、それぞれの壁の厚さの半分を引いた値、各壁の重心を測定する二重心間の距離を計算して決定することができます。
   それは内腔面積の強力な信号による各壁を追跡することは困難である二つ目のオプションは、外径を測定し、および内径を取得するために血管壁の静的な測定に基づいて補正係数を使用することです。この場合、ROIは全体の血管に及び、外径は、（図3 B）追跡されます。このメソッドはまた、リンパの全体表示可能な断面積（図3 C）を決定するために使用することができます。理由lymphangionの典型的な形状から、この後者のオプションは、選択された部分で直径を使用するよりも陣痛のたびにポンプの流体の実際のボリュームの良い推定を提供することができます容器の。
2. 時間経過の研究からリンパ管腔径測定^4,12,13の次のパラメータを決定します。
   毎分相動性収縮の数を数えることによって決定される収縮の周波数（CF）、。
   一過性収縮の直前に直径である拡張期直径（EDD）を、終了する。
   エンド収縮期径（ESD）、一過性収縮の終わりに直径。
   収縮の振幅（AMP = EDD - ESD）、一回拍出量の簡易インデックス。
   リンパ管平滑筋によって生成された音色を決定するために使用することができ、また、異なる直径のリンパ管との間でデータを正規化するために使用されている、、または、最大受動各圧力で直径^（+ -フリー条件のCa ²で決定した最大D）同じリンパ管は、さまざまな内腔の圧力で学んだ。
   圧力ステップ後の最初の収縮に関連付けられているEDDであるEDD _1。これは、開始点として使用されている場合内腔圧⁵のステップの増加に応じてリンパ管の筋原性収縮を決定する。
   /マックスD -圧力工程の後に分離されたリンパ管の筋原性収縮は、加圧ステップの増加量= 100 *（EDD ₁ EDD）は、次のEDDの正規化の変化によって表されます。
   算出することができますが、詳細⁴でどこにも説明されている追加の変数は次のとおりです。
   トーン= 100 *（最大D - EDD）/マックスD、正規化されたAMP = AMP /マックスD
   一回拍出量係数（SVI）=π（EDD ² - ESD ^2）
   駆出率（EF）= SVI /（πEDD2）
   ボリュームフローインデックス（VFI）= CF X SVI。

7。代表的な結果：

各一過性収縮の開始時には、[Ca ^{2 _+]} iの（図4）の一過性増加があった。加えて、内腔の圧の段階が増加した後、Ca ^{2 +}の周波数は^、+トランジェントとphasic収縮が同期して増加した。これらの観察は、ワイヤーのミオグラフ¹⁴および相動性収縮サイクル^15の基礎となるメカニズムの内部貯蔵からの振動のCa ²のための中心的な役割を示す以前のデータをサポートしている⁺のリリースに搭載された胸部ダクトを使用して、以前の所見と類似しています。

我々はまた、〔Ca ^{2 +]}拡張期_iは （のCa ^{2 +}過渡電流と相動性収縮の間に）リンパ音と圧力のステップが増加するが（図5）課されているときにストレッチによって引き起こされる筋原性収縮に関連付けられているかどうか。調べたすぐにステップを+4 cmの圧力の上昇H ₂ Oとより高い後、〔Ca ^{2 +]}拡張期_私着実に圧力のステップ（図5B）へ前のベースラインに比べ、増加しました。さらに、による圧力（EDD _1）のステップの増加に直径の初期増加後、筋原性収縮（図があった前のレポート^5,12のEDD ₁からEDDの減少として定義されてURE 5C）、。異なる圧力のステップの中でEDDの平均正規化された変更を比較するとき、2センチメートルH ₂ O（図6）に比べて8と10センチメートルH ₂ Oの増加後に有意に多くのくびれがあった。ステップ6の増加、8、および10センチメートルH ₂ Oは+2 cm以上のCa ^{2 +}の有意に高い変化を引き起こし、H ₂ O（と_私も圧力に関連した^[+のCa ^2]が、着実に上昇図6 B）。しかし、圧力のステップ- Ca ^{2 +の}関係も同様にこれらの圧力でプラトーに表示されます。これらの結果は、Ca ^{2 +}依存性のメカニズムを伸ばすに応じてリンパ管筋原性収縮に関連付けられていることを示唆している。しかし、圧力の高原ステップのCa ^{2 +}の関係は、Ca ^2を増加させるメカニズムを示唆している⁺感受性はまた増加する筋原性constriに貢献するかもしれないより高い圧力の手順でction。

孤立リンパ管の図1。の測定に使用される顕微鏡システムの概略図[Ca ^{2 _+]} iの。孤立リンパチャンバーは倒立顕微鏡のステージ上に配置されます。試料は、340および380nmで交互に点灯され、リンパ管から放出される蛍光シグナルは、CCDカメラで収集され、パーソナルコンピュータに格納されています。リンパ管の管腔内圧は、サーボヌルフィードバックシステムによって制御されます。ユーザは、システムの圧力、および動的にポンプを介して圧力を上げたり下げたりできるリンパリレーフィードバックシステムの管腔内圧、とラインの圧力トランスデューサを設定します。

図2対象領域（ROの例私は孤立リンパ管のフラ-2レシオメトリックイメージング研究のための）選択。血管を確保するために容器（マイクロピペットに触れる領域を除く）と周辺地域のほとんどを含む、選択した領域は、全体の時間経過のために追跡されます。バックグラウンドのROI（右上隅）も、周囲のお風呂からの非特異的な信号を除去するために使用されます。

図3。ポンプの追跡リンパためのメソッド。 A.内径は、血管壁のROIをそのトラックの動きを使って時間をかけて決定することができます。 B.コントラストのしきい値は、全体の容器を含むように設定されている場合、外径は、単一のROIを追跡することができます。内径は肉厚を補正することで、これらの測定値から推定することができます。Cは 。別のオプションは、壁の厚さを補正することで体積を計算するために使用できる容器、に包含される領域を追跡することですし、リンパ管と仮定して円筒状の形状を持っています。

図4の関係の[Ca ^{2 +]} _iとリンパ管の直径。。孤立リンパのフラ-2強度（ヒートマップ形式）のタイムラプスビデオからの代表的な画像。各画像中の矢印は血管の外径を概説。画像1は比較的低い[Ca ^{2 _+]} iの持つ心拡張期にリンパ管を示しています。画像2の、直前の画像を3-5で発生した一過性収縮に対する血管壁の380分の340の比率の増加の強さ、。画像4では、Ca ^{2 +}過渡は終了しました、とイメージ5で、収縮期は終了しましたと容器は、その休止状態に戻っている。B。の[Ca ^{2 +]} _iとリンパ管腔径のプロットは、一過性に増加の[Ca ^{2 +]} _iは 、それぞれの直前に発生したことを示しています一過性収縮。

図5。リンパ管の変化、圧力の上昇をステップ応答での[Ca ^{2 +]} _iとリンパ管収縮サイクル。圧力ステップのプロトコール（）、[Ca ^{2 _+]} iの（B）、および時間（C）上のリンパ径の変化を表す380分の340比のデータは、表示されます。 A.ベースライン内腔の圧力は、H _{2 O} H ₂ Oとリンパ管が+2増加、+4、+6、+8を工程に供した2センチ、および+10 cmであった各圧力ステップ録音との間の時間間隔は1〜2分であった。各圧力ステップは、[Ca ^{2 _+]} iの（B）と相性収縮（C）における一時的な増加の周波数の両方の増加を引き起こした。リンパ管の直径はまた、内腔圧の各ステップの増加とともに増加し、4〜10センチメートルH ₂ Oの圧力のステップについては、AFが発生したEDDの初期減少があった以前にリンパ管筋原性収縮として記述さTER EDD1（C）、。基礎に着実に増加の[Ca ^{2 +]} _iはすぐに圧力（B）の各ステップの増加の後に過渡の間でもあった。筋原性収縮は、しかし、基礎の増加より大きい圧力のステップでより顕著であったの[Ca ^{2 +]} _iは約4〜10センチメートルH ₂ Oの圧力のステップ（B）のための同じだった。 AMPで以前に報告された代償性増加は、6〜10センチメートルH ₂ O（C）の圧力のステップの後にも明らかであった。

図6。リンパ管筋原性収縮と自由が徐々に増加する場合は[Ca ^{2 _+]} iの拡張期、まもなく圧力のステップの増加の後に。。 EDD _1日以降30〜50秒間EDD平均は、各圧力ステップのための正規化されたEDDの変化を計算するために使用されます。B。 EDD _1日以降に380分の340比30〜50秒の強度は、ベースライン時の平均380分の340の比率（2センチメートルH ₂ O）で除した。 * P <2センチメートルH ₂ Oの圧力のステップ対0.05。 N = 4隻が学んだ。

ムービー1。研究のために使用される分離されたリンパ管の相動性収縮の例。内腔の圧力を2 cmのH ₂ Oを設定していた経過時間とスケールバーが下部に表示されます。タイムラプス画像は透過光を用いて10倍目的で採取された。 映画を見て、ここをクリックしてください。

ポンピング孤立リンパの動画2。レシオメトリックなフラ-2イメージング。ヒートマップの縮尺は、左上に表示され、経過時間とスケールバーが下部に表示されます。圧力は最初に2 cmのH ₂ Oに設定され、Oは0.5分とreturneから始まるH ₂ 8 cmに上昇したdは1.5分で2センチメートルH ₂ Oは。ために映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。

Discussion

手法の新たな組み合わせはリンパ管のポンプ組み込み関数を勉強するために採用した。同時にリンパ管をポンプでの[Ca ^{2 +]} _iと直径の変化を測定する能力は、リンパ管収縮サイクルを支配する全体的な機構におけるCa ^{2 +}依存性とCa ^{2 +}感受性を高めるシグナル伝達経路の相対的寄与の研究のためにできるようになります。

リンパ管収縮サイクルは、トーンの上に重ねて相動性収縮で構成されています。データは、それぞれの一過性収縮が⁺ pacemaking機構でのCa ²の中心的役割を示唆し、[Ca ^{2 _+]} iの中の一時的上昇に関連付けられていることを示し、そのCA ²の周波数⁺トランジェントは、内腔の圧の変化に敏感です。 。我々のデータはまた、圧力の急激な増加が基礎が着実に上昇を引き出すことができることを示しているの[Ca ^{2 +]}トランジェントの間に_私 。この上昇はに貢献するかもしれない内腔の圧のステップの増加を、以下のリンパ管を収集する際に観察される筋原性収縮。しかし、我々はこの基礎の増加のプラトーを観測したの[Ca ^{2 _+]} iの6から10センチメートル筋原性収縮の度合いをしていたH ₂ O、の範囲の圧力の手順で。このデータは、別のメカニズムが、おそらくのCa ^{2 +}感受性を高める機構が、また圧力に筋原性反応に関与していることを示唆している。

これらの研究で一つの仮定は、測定のCa ^{2 +}の大部分は平滑筋に含まれているということです。しかし、 ^{のCa 2 +}内皮細胞ともリンパ管に存在する可能性がある他の細胞型で、全体的な観測に貢献での[Ca ^{2 +]} _iは 、したがって、測定値は、おそらく平滑筋の過大評価である[Ca ^{2 _+]} iのリンパ管。任意のCa ^{2 +}内皮からの測定は直接寄与するものと期待されていません動脈¹⁶の以前の研究に基づいて筋肉の収縮をスムーズに。この問題は、リンパ管は血管内皮の剥離されている将来の実験で解決される予定です。

細胞や組織での[Ca ^{2 +]} _iを評価するためにレシオメトリック色素を使用する場合、試料の動きは、アーティファクトを引き起こす可能性があります。リンパ管の収縮の動きのアーチファクトを最小限に抑えるために、我々は、380分の340の比率を決定するために可能な限り船舶の多くを含むROIを利用。我々はまた、唯一の彼らの収縮サイクル中にフォーカスに滞在船を研究する。ため船舶の動きから生じるのではなく、判断する可能性のある成果物の絶対的な[Ca ^{2 _+]} iの_が特定_のサイトで、我々は船の大面積の平均値を得る。我々は、平均の相対的変化[Ca ^{2 _+]} iの時間の経過とどのようにこれらの変化は血管の一過性および持続性収縮に関連に焦点を当てる。

要約、deteに孤立収集リンパ管のレシオメトリックイメージングによる[Ca ^{2 _+]} iの変化のrminationは、リンパ管収縮サイクルを基礎と解読のCa ^{2 +}依存性とCa ^{2 +}感受性を高めるメカニズムに強力なツールを表します。この方法では、様々なシグナル伝達経路の選択的アゴニストまたは阻害剤を利用した今後の研究はまた、リンパ平滑筋の相動性に対する強壮収縮の根底にあるユニークな分子メカニズムを区別するのに役立ちます。