Cytosolic CA의 측정 ^{2 +} 절연 수축성 Lymphatics에

Summary

우리는 cytosolic CA를 평가하는 접근 방법을 소개합니다

Abstract

림프 혈관은 액체 항상성 유지 중앙 순환에 lipids를 제공하고, 잠재적으로 해로운 항원에 대한 감시 시스템 역할, 점막 면역과 적응 면역 반응 ¹ 최적화 다기능 교통 시스템을 구성. 림프는 맹인 종단 초기 lymphatics를 입력하고, 다음 큰 수집 lymphatics에서 압력 구배에 대한 수송이다 중간 유체로부터 형성됩니다. 각 수집 림프는 역류를 방지 뾰족한 끝이 둘있는 밸브로 구분 lymphangions라는 세그먼트의 일련의 구성됩니다. 각 lymphangion는 중앙 혈액 ^순환이 방향 압력 구배에 대한 림프을 향한 추진력을 얻습니다 수축성 사이클을 가지고 있습니다. 이 phasic 수축성 패턴은 수축기 및 diastolic 단계와 심장주기에 유사하고, 낮은 수축 주파수 ^4. 또한, 림프 평활근은 음색을 생성하고 myogenic 수축과 팽창을 표시 I각각 luminal 압력 증가와 감소, ⁵ N 응답. lymphatics의 phasic와 토닉 수축성을 모두 지원하는 분자 메커니즘의 하이브리드 따라서 제안하고 있습니다.

평활근의 수축은 일반적으로 cytosolic 칼슘 ^{2 +} 농도 규제 ([칼슘 ^{2 +]} _I) 칼슘 ² 플러스 감성 ^+, 세포 ⁶ 주변 환경의 변화에 대한 응답으로 수축성 요소. [칼슘 ^{2 +]} _제가 ⁺ 플라즈마 막 리간드 또는 전압 문이 칼슘 ^{2 +} 채널과 ⁺ 내부 상점에서 칼슘 ^2의 릴리스와 이해를 통해 칼슘 ^2의 운동의 조합에 의해 결정됩니다. Cytosolic 칼슘 ^{2 +} calmodulin에 바인딩 및 마이 오신 조명 체인으로 효소를 활성화 (MLC) 차례로 MLC는 굴지 - 마이 오신 - 중재 수축 ⁸ 선도 phosphorylates 키나제 (MLCK). 그러나, 칼슘이 경로의 감도 9 조정할 수 있습니다. MLCP 활동 Rho 키나제 (바위)과 마이 오신의 인산 가수 분해 효소 억제제 단백질 CPI - 17에 의해 규제됩니다.

여기, 우리는 칼슘 ^{2 +} - 의존과 ^칼슘이 림프 평활근의 수축의 ⁺ - sensitizing 메커니즘을 연구하기 위해 절연, perfused lymphatics에서 시간이 지남에 따라 ^[+ 칼슘 ^2] _나는 변화를 평가하는 방법을 제시한다. 절연 쥐 mesenteric 수집 lymphatics를 사용하여 우리는 ^[+ 칼슘 ^2] _I 및 수축성 활동에 스트레칭 유발 변화를 공부했습니다. 격리된 림프 모델은 압력, 유량 및 욕조 솔루션의 화학 성분이 밀접하게 제어할 수있는 장점을 제공합니다. [칼슘 ^{2 +]} _제가 ratiometric, CA ^{2 +} 바인딩 염색 Fura - 2 lymphatics 로딩에 의해 결정되었다. 이러한 연구는 phasic 조절 다른 분자 메커니즘을 연구의 광범위한 문제에 대한 새로운 접근 방법을 제공합니다림프 평활근의 수축 토닉 대 수축.

Protocol

1. 동물

1. 모든 절차는 루이지애나 주립 대학 보건 과학 센터에서 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었으며 건강의 국립 연구소 (NIH 간행물 번호 85-12, 1996 개정)의 지침에 따라 수행되었다. 남자 스프 - Dawley 쥐 (찰스 리버 연구소, 2백70-3백50g 몸 wt)는 제어 온도 (22 ° C) 및 제어 조명 (12시 12분 H 조명 어두운 사이클) 환경에 보관되어 있었다. 도착 후, 쥐가는 한 주간의 acclimation 기간에 제출되었습니다 표준 쥐 차우 (2018 Teklad 글로벌 18% 단백질 쥐 다이어트, 할란)와 물 광고 libitum을 제공했다.

2. 설정 실험

1. 장착 lymphatics에 대한 유리 micropipettes는 필라멘트 OD 1.2mm, 0.69mm ID (셔터 악기 BF 120-69-15)와 Borosilicate 유리에서 만들어집니다. 불타는 / 브라운 Micropipette 풀러 모델 P - 97 (셔터기구를 사용하여 pipettes를 당겨물건을)하고 ~ 60 μm의 외경과 beveled 팁을 얻기 위해 마이크로 그라인더 EG 400 (Narishige)와 사각 수 있습니다.
2. 격리된 선박 챔버 (모델 CH - 1, 생활 시스템, 벌링턴, VT)에 micropipettes를 탑재합니다. pipettes은 (동일 크기의 개방) 저항을 일치해야합니다.
3. 챔버 (5 ML) 및 알부민 - 생리 식염수 micropipettes (APSS, 표 1 참조)를 입력합니다. micropipettes 또는 튜브에 거품이 없습니다 있는지 확인합니다.
4. 안과 봉합 각 micropipette에 자리 하나 매듭을 overhand 준비합니다.

3. 림프 절연 모집

1. BD의 주사기 (1 ML)와 바늘 (BD intradermal 베벨 26G3 / 8)을 사용하여, 케타민을 / xylazine의 근육 주사 (각각 90과 9 MG / kg)와 동물 마취.
2. , 소독에 70 % 알코올로 복부 영역을 스프레이 중간선 개복술을 수행하며, 작은 창자와 장간막을 외면 화하다 및 소비세. IC의 조직을 장소E - 차가운 APSS. 케타민을 / xylazine의 과다와 함께 동물을 안락사와 가슴 (안락사에 대한 미국 수의 의학 협회 가이드라인 당 등) 열어 죽음을 확인합니다.
3. 얼음처럼 차가운 APSS 가득한 해부 실에서 장간막의 섹션을 핀. 조심스럽게 stereomicroscope의 도움과 함께 지방과 결합 조직을 둘러싼에서 수집 림프 혈관 (80-200 μm의 내경 및 길이 1-2하셔야) 절개하다. (파인 과학 도구 # 15000-03) 뒤몽 포셉 - INOX 55 해부 (파인 과학 도구 # 11255-20)와 스프링 가위를 해부 사용합니다. 실험 기간 동안의 전체 세그먼트의 최적 압력 제어를 보장하기 위해 하나의 밸브와 격리 선박을 사용합니다.
4. APSS 5 ML를 포함하는 분리된 선박 챔버에 고립 림프을 전송합니다. 안과 봉합을 함께 묶는하여 두 개의 저항 검색 유리 micropipettes에 용기를 탑재합니다.
5. 거꾸로 형광 현미경으로 챔버를 전송 (우리는 닉입니다TE - 2000U에) 크세논 램프 (셔터 인 스트 루먼트 람다 LS2 300 W), 380분의 340 필터 휠 시스템 (채도 기술 340과 380 나노미터 여기 필터와 셔터 람다 10-3), 510 nm의 이색성 에미터 (채도 기술 D510을 갖춘 / 80m), 민감한 CCD 카메라 (Photometrics 본사 ^2), 및 취득 소프트웨어 (니콘 요소 AR) (그림 1).
6. 어느 저수지 또는 조정 압력과 흐름을 변경하는 데 사용할 수있는 모두 서보 피드백 펌프 시스템 (생활 시스템 계측, 벌링턴 VT)에 micropipettes에서 발생하는 튜브를 연결합니다.
7. 가열 장치 (생활 시스템)에 챔버를 연결하고 37 ° C.에 목욕을 설정
8. 10X 목표 (니콘 계획 형석 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0.17, WD 16.0)와 챔버의베이스에 직접 coverslip을 통해 림프를 볼 수 있습니다. 빠른 시간 저속 이미지 세트는 이미지 수집 소프트웨어 (시스템은 니콘 요소 AR 소프트웨어를 가지고)를 사용하여 취득하실 수 있습니다.

2 +] _난의 Ratiometric 측정

1. [칼슘 ^{2 +]} 고립 림프 평활근에 나 ⁺ 센싱 염료 Fura 2 - 아세 톡시 메틸 에스테르 (AM) (분자 프로브, 유진, OR) 칼슘 ² 측정됩니다.
2. 37 30 분 Fura 2시 (2 μm의)와 pluronic 산 (0.2 % wt / 권)를 포함하는 솔루션을 APSS하기 위해 목욕을 교환하여 Fura - 2 AM와 림프 혈관을로드 ° C.
3. 30 분 후에 솔루션을 APSS 다시 목욕을 변경합니다. 목욕 솔루션에서 Fura - 2를 씻어 2 번 린스. 전에 최소한 20 분 평균 시간에 대한 혈관을 남겨주 [칼슘 ^{2 +]} 수 _I 측정 자발적인 수축이 다시 설립.
4. 또는 50 MS 각각의 기간이를 위해 340과 380 나노미터 파장의 빛이 인수 프로토콜 격리 lymphatics에 ratiometric Fura - 2 측정을 수집합니다. 채도 테, 형광등은 이색성 거울 (400 NM 통과chnology 주식 회사 400DCLP) 및 광대역 방출 필터 (510 나노미터, 80 나노미터 대역 폭, 채도 기술 주식 회사 D510/80m)와은 Photometrics ^HQ이 카메라로 획득한 것입니다. 우리는 2cm H ₂ O의 기준 intraluminal 압력 및 2 단계 증가, 4, 6, 8시 데이터 이분를 수집하고, 10cm H ₂ O.
5. 평균 분석 [칼슘 ^{2 +]} _I, 전체 ​​림프 혈관과 혈관이 완전히 휴식과 수축 (그림 2) 동안 추적되도록 주변 지역을 포함의 관심 영역 (ROI)을 그립니다. 중 micropipette 볼 분야의 경우이 영역은 투자 수익 (ROI)에 포함되지 않습니다. 작은 ROIs도하지만 작은 ROIs있는 잠재적인 문제가 혈관이 수축과 진정으로 용기 벽의 투자 수익 (ROI) 밖으로 세로 방향으로 약간 이동 수있다는 것입니다, 선택할 수 있습니다. 또 다른 잠재적인 문제는 일부 혈관이 수축하는 동안 꼬임 즉, 이러한 lymphatics가 연구에 사용해서는 안됩니다. 일전자 왜곡의 움직임은 일반적으로 <1 mm까지 격리된 림프의 길이를 제한하여 피할 수 있습니다. 또한, 가끔 밸브의 양쪽에 세그먼트 수축하지 / synchrony에서 휴식을 취할 수. 이 경우, 이러한 세그먼트는 별도의 기능 lymphangions을 대표하기 때문에, 림프는 밸브의 한 쪽 공부를해야하거나 각 lymphangion가 양쪽에 배치 투자 수익 (ROI)과 별도로 공부하실 수 있습니다. 10X 목적을 사용하는 경우, 선박 벽이 분야는 투자 수익 (ROI)에 포함하지 않아야 수축하는 동안 초점 나갈 벽의 모든 부분이있다 그러나 경우, phasic 수축하는 동안 초점을 유지한다. 배경 투자 수익 (ROI)도 사용되며, 선박 (이미지의 모서리에있는 예)에서 멀리 배치해야합니다. 380분의 340 비율의 증가는 [칼슘 ^{2 +]} _내가 증가를 나타냅니다. 여러 시간 지점에서 Luminal 직경도 (제 6 항 참조) 또는 시간이 지남에 따라 선박 벽면을 추적하여 소프트웨어의 측정 기능을 이용하여 측정할 수 있습니다. <이/ 리>

5. 압력 제어 프로토콜

1. 부과 흐름 독립 압력을 공부하고, 같은 압력은 서보 NULL 피드백 펌프에 의해 각 micropipette에 적용해야합니다. 각 micropipette에서 튜브는 펌프에 장착된 일반적인 튜브에 T - 커넥터를 통해 연결되어 있습니다. 처음에는 45-60 분., 충분한 림프 자연 수축의 개발을 허용하는 시간에 대한 2cm H ₂ O에서 intraluminal 압력을 설정합니다.
2. 연구에 대한 평균 기간 내에 다음과 같은 기준을 충족에만 혈관을 사용합니다 (1) 선박은 2cm H ₂ O에서 자발적인 음색을 개발 (2) 선박은 선박의 길이에 걸쳐 합리적으로 균일한 아르 정기적으로 자발적인 수축을 개발 . 종종 밸브의 하류 지역은 선박의 나머지 부분보다 더 수축, 이러한 혈관은 한 그릇의 나머지 부분이 수축성 활동을 표시 증거가 그대로 사용됩니다.
3. 압력 단계 절차 동안 빠른 시간 경과 이미지를 기록합니다. 각각의 경우, 압력이 30 s에 대한 2cm H ₂ O에서 시작되며, 다음 여섯은, 4, 2에 의해 단계에서 일분 8, 또는 10cm H ₂ O를 제기하고, 다시 낮아 2cm 30 S.를위한 H ₂ O로
4. 압력 단계 시리즈의 완료 후, 위의 luminal 압력 각에 최대한 수동 직경 (최대 D) 및 CA ^{2 +} - 형광 측정을 측정하는 ⁺ 무료 APSS 37 ^칼슘이 ° C로 목욕 솔루션을 변경합니다. 최대 D는 음색을 계산하고 다른 크기의 lymphatics간에 데이터를 정상화하는 데 사용됩니다.

6. 림프 수축성 매개 변수

1. 시간이 지남에 따라 용기 직경의 변화는 대부분의 이미지 분석 소프트웨어 패키지에 객체 추적 도구를 사용하여 결정하실 수 있습니다. 이것은 채널의 한 (우리가 340 나노미터 채널을 사용하지만 380 채널도 사용할 수)를 사용하여 얻을 수 있습니다. 대비 임계값 응용 프로그램입니다혈관 벽이 강조되도록 이미지 스택에게 거짓말을했고, 다음 각 벽면을 포함한 ROIs는 (그림 3) 시간이 지남에 따라 그들을 추적하기 위해 그려있다. 내부 직경은 각 벽면의 두께의 마이너스 절반 각 벽면의 중심을 측정하고 두 centroids 사이의 거리를 계산하여 결정하실 수 있습니다.
   그것은 luminal 지역에 강력한 신호로 인해 각각의 벽면을 추적하기 어려운 두 번째 옵션은 외부 직경을 측정하고, 내부 직경을 얻을 수있는 선박 벽의 정적 측정을 기반으로 한 보정 계수를 사용하는 것입니다. 이 경우 투자 수익 (ROI)은 전체 혈관을 걸쳐 및 외경은 (그림 3 B) 추적이다. 이 방법은 또한 림프의 전체를 볼 교차 단면적 (그림 3 C)를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 때문에 lymphangion의 전형적인 모양이 후자의 옵션은 선택한 부분에 직경을 사용하는 것보다 각각의 수축과 펌핑 유체의 실제 볼륨의 더 나은 견적을 제공할 수선박의.
2. 시간 저속 연구에서 림프 luminal 직경 측정 ^4,12,13 다음과 같은 매개 변수를 결정 :
   분당 phasic 수축의 숫자를 계산에 의해 결정 수축 빈도 (CF).
   phasic 수축하기 직전 직경입니다 diastolic 직경 (EDD)를 종료합니다.
   최종 수축기 직경 (ESD), phasic 수축의 끝에 지름.
   수축의 진폭 (AMP = EDD - ESD), 스트로크 볼륨의 단순 인덱스.
   림프 평활근에 의해 생성되는 색조를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 다양한 직경의 lymphatics간에 데이터를 정상화하는 데 사용됩니다,, 또는, 최대한 수동 각각의 압력 직경 ⁽⁺ 프리 조건 칼슘 ^2에 결정 최대 D) 같은 림프 다른 luminal 압력에서 공부했습니다.
   압력 단계 후 첫 수축과 관련된 EDD는 EDD _1. 이것은 시작 지점으로 사용하는 경우luminal 압력 ⁵ 단계 증가에 대한 응답으로 림프 혈관의 수축을 결정 myogenic.
   / 최대 D - 압력 단계 이후 격리된 림프의 Myogenic 수축은 = 100 * (EDD ₁ EDD) 압력 단계 증가 다음 EDD의 표준 변경 사항으로 표시됩니다.
   계산할 수 있지만 다른 상세 ^넷에 나와있는 추가적인 변수는 다음과 같습니다
   톤 = 100 * (최대 D - EDD) / 최대 D, 표준 AMP = AMP / 최대 D
   뇌졸중 볼륨 인덱스 (SVI) (EDD ² - ESD ²⁾ = π
   배출 분율 (EF)는 = SVI / (πEDD2)
   볼륨 흐름 지수 (VFI) = CF X SVI.

7. 대표 결과 :

각 phasic 수축의 시작 부분에 [칼슘 ^{2 +]} _나는 (그림 4)에서 과도 증가가 발생했습니다. 또한, luminal 압력 단계에서 증가 후, CA ^2의 주파수 ⁺ 과도 및 Phasic 수축 synchrony 증가. 이 관측 선 myograph ¹⁴ 장착하고 oscillatory 칼슘 ² phasic 수축성주기 ¹⁵ 기본 메커니즘의 내부 상점에서 ⁺ 릴리스의 중심 역할을 나타내는 이전 데이터를 지원 흉부 덕트를 사용하여 이전 찾는 비슷합니다.

우리는 또한 조사 여부 [칼슘 ^{2 +]} 심장 확장하는 동안 _제가 (칼슘 ² 사이 ⁺ 과도 및 phasic 수축) 림프 색조와 압력 단계 증가는 (그림 5) 부과 때 스트레칭으로 인한 myogenic 수축과 관련된 것입니다. 즉시 압력 단계 (그림 5B)하기 전에 기준에 비해 꾸준히 증가하고 심장 확장하는 동안 4cm H ₂ O 이상, [칼슘 ^{2 +]} _난의 압력 단계에서 증가 이후. 또한, 인해 압력 (EDD ₁₎ 단계 증가 직경의 초기 증가 후, myogenic 수축은 (그림가 발생했습니다이전 보고서 ^5,12의 EDD ₁ EDD의 감소로 정의 ure 5C). 다른 압력 단계 사이 EDD의 의미 표준 변경 사항을 비교하면, 거기에 훨씬 더 많은 수축이 8의 증가 이후 있었고 10cm H ₂ O는 2cm H ₂ O (그림 6)에 비교했다. 의 꾸준한 상승 [칼슘 ^{2 +]} _{나는 또한} 칼슘 ^2에 상당히 높은 변화를 일으키는 단계 6의 증가, 8, 그리고 10cm H ₂ O와 압력에 관한했습니다 ^+보다 2cm H ₂ O ( 그림 6 B). 그러나, 압력 단계 - CA ^{2 +} 관계뿐만 아니라 이러한 압력에서 대지로 나타납니다. 이러한 결과는 칼슘 ^{2 +} 종속 메커니즘 스트레칭에 대한 응답으로 림프 myogenic 수축과 연관된 것이 좋습니다. 그러나, 압력 단계 - CA ^2의 고원 ⁺ 관계는 ⁺ 감도도 증가 myogenic constri에 기여할 수 칼슘 ² 증가 메커니즘을 제안높은 압력 단계에서 ction.

그림 1. 측정에 사용되는 현미경 시스템의 도식 [칼슘 ^{2 +]} _나는 고립 림프 인치 격리된 림프 챔버는 거꾸로 현미경의 무대에 배치됩니다. 표본은 340과 380 nm의 또는 조명에 있으며, 림프에 의해 배출 형광 신호가 CCD 카메라 수집 및 개인 컴퓨터에 저장됩니다. 림프의 intraluminal 압력은 서보 NULL 피드백 시스템에 의해 제어됩니다. 사용자는 시스템의 압력을 설정하고, 압력 트랜스 듀서는 림프와 함께 온라인에서 피드백 동적으로 증가시킬 수 시스템, 또는 펌프를 통해 낮은 압력으로 압력을 intraluminal 릴레이.

그림 2. 관심 지역 (RO의 예나는 고립 림프 혈관의 Fura - 2 ratiometric 영상 연구를위한) 선택합니다. 선택한 지역은 선박이 전체 시간 과정 추적됩니다 있도록 용기 (micropipettes를 만지고 지역 제외)와 주변 지역의 대부분을 포함하고 있습니다. 배경 ROI (오른쪽 상단)도 주변 목욕탕에서 특이 현상이 신호를 제거하는 데 사용됩니다.

그림 3. 펌핑 추적 림프위한 메소드. A. 내부 직경은 ROIs를 사용하여 시간이 지남에 따라 결정될 수있는 용기 벽을 추적하는 운동. B. 대비 임계값은 전체 선박을 포함하도록 설정하면, 외부 직경은 하나의 투자 수익 (ROI)과 함께 추적할 수 있습니다. 내부 직경은 벽 두께에 대한 수정하여 이러한 측정에서 추정하실 수 있습니다. C는. 또 다른 옵션과 벽 두께에 대한 보정하여 볼륨을 계산하는 데 사용할 수있는 영역으로 포함하고 선박을 추적하는 것입니다림프를 가정하면 원통형 기하학을하고 있습니다.

그림 4. 간의 관계 [칼슘 ^{2 +]} _i와 림프 직경.. 격리된 림프의 Fura - 2 농도 (열지도 형식)의 시간 경과 비디오에서 대표 이미지를 표시합니다. 각 이미지의 화살표는 선박의 외부 직경을 설명합니다. 이미지 1 상대적으로 낮은 [칼슘 ^{2 +]} _난과 심장 확장시 림프를 보여줍니다. 이미지 2에서 직전 이미지 3-5에서 발생 phasic 수축으로 혈관 벽에 380분의 340 비율 증가의 강도. 이미지 넷으로 칼슘 ^{2 +} 과도이 종료되었습니다, 이미지 5, 수축기 단계 종료 및 선박는 휴식 상태로 반환됩니다. B는. [칼슘 ^{2 +]} _i와 림프 luminal 직경의 줄거리에 일시적 증가 [칼슘 ^{2 +]} _제가 각각 직전 발생 것으로 나타났습니다phasic 수축.

그림 5. 림프의 변화 [칼슘 ^{2 +]} _i와 응답 림프 수축성주기는 압력 증가 단계로. 압력 단계 프로토콜 (A), [칼슘 ^{2 +]} _나는 (B), 시간 (C) 이상의 림프 직경의 변화를 대표 380분의 340 비율 데이터가 표시됩니다. A. 기준 luminal 압력은 2cm H ₂ O되었고 림프 배는 2의 증가, 4, 6, 8 단계로 받게되었고, 10cm H ₂ O. 각 압력 단계 녹음 사이의 시간 간격은 1-2 분했습니다. 각 압력 단계에서 일시적인 증가의 빈도 모두에서 증가 원인 [칼슘 ^{2 +]} _I (B) 및 phasic 수축 (C). 림프 직경은 luminal 압력의 각 단계 증가와 함께 증가하고 4-10센티미터 H ₂ O의 압력 단계, AF 발생 EDD에 처음 감소가 발생했습니다이전 림프 myogenic 수축으로 설명 ter EDD1 (C). 기초의 꾸준한 증가도 발생했습니다 [칼슘 ^{2 +]} 과도 사이에 _나는 즉시 압력의 각 단계 증가 (B) 후. myogenic 수축하지만 기초 [칼슘 ^{2 +]} 증가 _나는 약 H ₂ O의 압력 단계 (B) 4-10cm에 대해 동일했습니다., 큰 압력 단계를 더 발음했다 AMP에서 이전에 보고된 보상 증가 6-10센티미터 H ₂ O (C)의 압력 단계 이후에도 분명했다.

그림 6. 곧 압력 단계에서 증가 후 림프 myogenic 수축 무료로 점차 증가 [칼슘 ^{2 +]} _나는 심장 확장시.. EDD _{1 일} 이후 30-50의 사이 EDD 평균은 각 압력 단계에 대한 표준 EDD의 변화를 계산하는 데 사용됩니다. B는. EDD _{1 일} 이후 380분의 340 비율은 30-50 s의 강도는 기준 기간 동안의 평균 380분의 340 비율 (2cm H ₂ O)로 나눈되었습니다. * P <2cm H ₂ O의 압력 단계 대 0.05. N = 4 선박 공부했습니다.

영화 1. 연구에 사용되는 격리된 림프 혈관의 수축 phasic의 예. luminal 압력이 2cm H ₂ O.에서 설정되었다 경과 시간과 규모 표시줄이 하단에 표시됩니다. 시간 저속 이미지가 전송 조명을 사용하여 10X 목적으로 수집된 것은. 영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.

펌프 고립 림프의 영화 2. Ratiometric Fura - 2 영상. 열지도 스케일은 왼쪽 상단에 표시되며 경과 시간과 규모 표시줄이 하단에 표시됩니다. 압력이 처음 2cm H ₂ O로 설정되었으며 0.5 분 및 returne에서 시작 8cm H ₂ O로 자랐어요D 1.5 분 2cm H ₂ O는.로 동영상을 감상하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

방법의 소설 조합은 림프 혈관의 펌핑 본질을 연구하기 위해 고용되었다. 동시에 변화 측정 기능 [칼슘 ^{2 +]} _i와 펌핑 lymphatics의 직경은 칼슘 ^2의 상대적인 기여도 ⁺ 종속 및 CA ² 림프 수축성주기를 지배하는 전체 메커니즘에 ⁺ - sensitizing 신호 경로. 연구를 허용합니다

림프 수축성주기 톤 이상 겹쳐 phasic 수축으로 구성되어 있습니다. 데이터는 각 phasic 수축이 ⁺ pacemaking 메커니즘에 ^칼슘이의 중심 역할을 제안, [칼슘 ^{2 +]} _나는에 과도 증가와 관련된 것을 보여, 그리고 칼슘 ^2의 주파수 ⁺ 과도는 luminal 압력의 변화에 민감 . 우리의 데이터는 또한 압력 급속한 증가는 기저의 꾸준한 상승을 이끌어내는 수 표시 [칼슘 ^{2 +]} 과도 사이 _전. 이것은 상승에 기여할 수 있습니다luminal 압력 단계 증가에 따라 lymphatics를 수집 관찰하는 myogenic 수축. 그러나, 우리는이 기저에있는 증가의 대지를 관찰 [칼슘 ^{2 +]} 6에서 myogenic 수축의 학위를 변화했다 10cm H ₂ O,에 이르기까지 압력 단계 _I. 이 데이터는 다른 메커니즘 가능성이 칼슘 ^{2 +} - sensitizing 메커니즘도 압력에 myogenic 반응에 관여하는 것이 좋습니다.

이러한 연구와 함께 한 가정의 측정 칼슘 ^{2 +의} 대부분이 평활근에 포함되어 있기 때문입니다. 그러나, CA lymphatics에 존재할 수 내피 세포와 다른 세포 유형에있는 ^{2 +는} [칼슘 ^{2 +]} _나는, 따라서 측정값 아마 평활근의 과대 평가 아르 [칼슘 ^{2 +]} _난의 전반적인 관찰에 기여 lymphatics. 모든 칼슘 ^{2 +} 내피에서 측정한 직접 기여할 것으로 예상되지 않습니다arterioles ¹⁶ 이전의 연구를 기반으로 근육 수축을 원활하게합니다. 이 문제는 lymphatics가 내피의 denuded하는 미래의 실험에 처리해 드리겠습니다.

평가 ratiometric 염료를 사용하는 경우 [칼슘 ^{2 +]} 세포 또는 조직, 표본의 움직임이 아티팩트를 일으킬 수 있습니다 _속에서. lymphatics을 계약에 운동 아티팩트를 최소화하기 위해, 우리는 380분의 340 비율을 결정하기 위해 가능한 한 선박의 많은을 포함하는 투자 수익 (ROI)을 활용. 우리는 또한 오직 자신의 수축성 사이클 동안 초점에 남아 선박을 공부합니다. 때문에 선박의 움직임에서 발생보다는 결정할 수있는 잠재적인 유물의 절대 [칼슘 ^{2 +]} _나는가 특정 사이트에서, 우리는 선박의 넓은 지역에 대한 평균을 구하십시오. 우리는 평균 상대적인 변화에 초점을 [칼슘 ^{2 +]} 시간과 어떻게 이러한 변화는 혈관의 수축 phasic 및 토닉과 관련된 이상 _전.

요약 dete에서격리된 수집 lymphatics에서 ratiometric 영상으로 [칼슘 ^{2 +]} _나는 변화의 rmination은 강력한 해독 칼슘 ² 도구 ⁺ 종속 및 CA ² 림프 수축성 사이클을 기본 ⁺ - sensitizing 메커니즘. 나타냅니다 이 방법으로, 다양한 신호 전달 경로의 선택 agonists 또는 억제제를 이용하는 미래 연구는 또한 림프 평활근에 phasic 대 토닉 축소를 기본 고유의 분자 메커니즘을 차별화하는 데 도움이됩니다.