Medição do Ca citosólico ^{2 +} Em Isolated linfáticos contráteis

Summary

Nós introduzimos uma abordagem para avaliar o Ca citosólico

Abstract

Vasos linfáticos formam um sistema de transporte multifuncional que mantém a homeostase dos fluidos, oferece lípidos para a circulação central, e atua como um sistema de vigilância para os antígenos potencialmente prejudiciais, otimizando a imunidade da mucosa e respostas imunes adaptativas ^1. A linfa é formado a partir de líquido intersticial que entra cego-ended linfáticos iniciais, e depois é transportado contra um gradiente de pressão na maior sistema linfático coleta. Cada linfáticos é composta de uma série de segmentos chamados lymphangions, separados por válvulas bicúspide, que impedem o refluxo. Cada lymphangion possui um ciclo de contração que impulsiona linfáticos contra um gradiente de pressão para a circulação central ^2. Este padrão contrátil fásica é análogo ao do ciclo cardíaco, com fases sistólica e diastólica, e com menor freqüência ⁴ contração. Além disso, o músculo liso linfático gera tom e exibe miogênica constrição e dilatação in resposta a aumentos e diminuições na pressão luminal, respectivamente ^5. Um híbrido de mecanismos moleculares que suportam tanto a contratilidade fásicas e tônicas dos vasos linfáticos são assim propostas.

Contração do músculo liso é geralmente regulado pelo Ca ^{2 +} citosólico concentração ([Ca ^{2 +]} _i) a sensibilidade de mais para Ca ^{2 +,} dos elementos contrátil em resposta a mudanças no ambiente ao redor da célula ^6. [Ca ^{2 +]} _i é determinado pela combinação do movimento do Ca ^{2 +} através da membrana plasmática ligante ou tensão gated Ca ^{2 +} e canais a liberação e absorção de Ca ^{2 +} das lojas internas. Citosólica de Ca ^{2 +} se liga a calmodulina e ativa enzimas como a cadeia leve de miosina (MLC) quinase (MLCK), que por sua vez fosforila MLC levando a actina-miosina-contração mediada ^8. No entanto, a sensibilidade desta via de Ca 9. MLCP atividade é regulada por Rho quinase (Rock) e da proteína miosina inibidor da fosfatase CPI-17.

Aqui, apresentamos um método para avaliar as alterações na [Ca ^{2 +]} _i ao longo do tempo isolado, vasos linfáticos perfundidos para estudar Ca ^{2 +-dependente} e Ca ^{2 +-sensibilizar} os mecanismos de contração do músculo liso linfático. Usando linfáticos mesentéricos isolados de ratos coletando estudamos estiramento induzido por mudanças na [Ca ^{2 +]} _i e atividade contrátil. O modelo linfático isolado oferece a vantagem de pressão, fluxo e da composição química da solução de banho podem ser bem controladas. [Ca ^{2 +]} _i foi determinado pela carga linfáticos com o raciométrica, Ca ^{2 +-binding} corante Fura-2. Estes estudos fornecem uma nova abordagem ao problema mais amplo de estudar os diferentes mecanismos moleculares que regulam fásicacontrações contra constrição tônica no músculo liso linfático.

Protocol

1. Animais

1. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Louisiana State University Health Sciences Center e foram realizados de acordo com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (NIH publicação 85-12 No., revista em 1996). Masculino Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 270-350 g de corpo wt) foram alojados em uma temperatura controlada (22 ° C) e iluminação controlada (12:12 h ciclo de luz escuro) ambiente. Após a chegada, os ratos foram submetidos a um período de aclimatação de uma semana e foram fornecidas ração padrão (2018 Teklad Rodent Diet global de 18% de proteína, Harlan) e água ad libitum.

2. Experimento Set-Up

1. Micropipetas de vidro para montagem de vasos linfáticos são feitos de vidro borosilicato com filamento OD 1,2 milímetros, 0,69 milímetros ID (Sutter Instrument BF 120-69-15). Puxe a pipetas usando um Flaming / Brown Micropipeta Puller modelo P-97 (Sutter Instrument) e são cônicas com uma Grinder Micro EG 400 (Narishige) para obter uma ponta chanfrada, com um diâmetro ~ 60 mm exterior.
2. Monte o micropipetas na câmara de navio isolado (modelo CH-1, os sistemas vivos, Burlington, VT). As pipetas devem ser combinados de resistência (abertura do mesmo tamanho).
3. Encha a câmara (5 mL) e micropipetas com albumina-fisiológica solução salina (APSS, ver Tabela 1). Certifique-se que não há bolhas no micropipetas ou a tubulação.
4. Prepare overhand nós com suturas oftálmica e coloque uma em cada micropipeta.

3. Coleta de isolamento Linfática

1. Anestesiar os animais com uma injeção intramuscular de ketamina / xilazina (90 e 9 mg / kg, respectivamente), usando uma seringa BD (1 ml) e agulha (BD bisel intradérmica 26G3 / 8).
2. Pulverizar a área do abdômen com álcool 70% para esterilizar, realizar uma laparotomia mediana, e exteriorizar e consumo do intestino delgado e mesentério. Coloque o tecido no ICe-frio APSS. Eutanásia dos animais com uma overdose de ketamina / xilazina e confirmar a morte, abrindo o peito (como por American Veterinary Medical Association diretrizes sobre a eutanásia).
3. Pin uma seção de mesentério em uma câmara cheia de dissecção gelada APSS. Dissecar cuidadosamente um vaso linfático coleta (8-20 mM de diâmetro interno e 1-2 mm de comprimento) do tecido circundante adiposo e conjuntivo, com o auxílio de um estereomicroscópio. Use uma pinça de dissecação Dumont-INOX 55 (Tools Ciência Belas # 11255-20) e dissecando tesoura primavera (Ferramentas Ciência Belas # 15000-03). Use vasos isolados com apenas uma válvula de pressão para garantir o controle ideal em todo o segmento durante o experimento.
4. Transferência do sistema linfático isolado para a câmara de navio isolado contendo 5 ml da APSS. Monte o navio para as duas micropipetas resistência de correspondência de vidro, amarrando com as suturas oftálmico.
5. Transferência da câmara a um microscópio invertido fluorescente (o nosso é um Nikem TE-2000U) equipado com uma lâmpada de xenônio (Sutter Lambda Instruments LS2 300 W), 340/380 sistema roda de filtros (Sutter Lambda 03/10 com tecnologia Chroma 340 e 380 filtros de excitação nm), 510 nm emissor dicróicas (D510 Tecnologia Chroma / 80m), uma câmera CCD sensíveis (fotométricos HQ ^2), e software para aquisição (Nikon Elements AR) (Figura 1).
6. Prenda a tubulação proveniente do micropipetas quer para reservatórios ajustável ou ao sistema de bomba de servo-feedback (Instrumentação Sistemas Vivos, Burlington VT), tanto que pode ser usado para alterar a pressão e fluxo.
7. Ligue a câmara à unidade de aquecimento (Sistemas Vivos) e definir o banho a 37 ° C.
8. Ver o linfática diretamente através da lamela na base da câmara com uma objetiva de 10X (Nikon Plano Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0,17, WD 16,0). Rápida conjuntos de lapso de tempo de imagem pode ser adquirido usando o software de aquisição de imagem (o nosso sistema tem Nikon Elements software AR).

2 +] _i

1. [Ca ^{2 +]} i no músculo liso linfático isolado é medido pelo Ca ^{2 +-sensing} corante Fura 2-acetoxymethyl éster (AM) (Molecular Probes, Eugene, OR).
2. Carregar o vaso linfático com Fura-02:00, trocando o banho para APSS solução contendo Fura-02:00 (2 mM) e ácido PLURONIC (0,2% wt / vol) por 30 minutos a 37 ° C.
3. Depois de 30 minutos a mudança de volta para o banho APSS solução. Enxágüe duas vezes para lavar o Fura-2 a partir da solução do banho. Deixe o vaso para um tempo de equilíbrio de pelo menos 20 min antes de [Ca ^{2 +]} _i medidas para permitir a re-estabelecimento de contrações espontâneas.
4. Coletar raciométrica Fura-2 medições em vasos linfáticos isolados com um protocolo de aquisição que, alternativamente ilumina a 340 nm e 380 comprimentos de onda para as durações de 50 ms cada. A luz fluorescente passa através de um espelho dicróico (400 nm; Chroma Technology Corp 400DCLP) e uma larga banda de emissão de filtro (510 nm, 80 nm de largura de banda; Chroma Technology Corp D510/80m) e é adquirida pelo HQ fotométricos câmera de ^2. Recolhemos dois minutos de dados a uma pressão inicial intraluminal de 2 cm H ₂ O e durante aumenta etapa do +2, +4, +6, +8, e +10 cm H ₂ O.
5. Analisar a média de [Ca ^{2 +]} _i, desenhe uma região de interesse (ROI) que inclui o vaso linfático inteiro e área circundante, para que o navio está totalmente rastreados durante o relaxamento e contração (Figura 2). Se qualquer micropipeta está no campo de visão dessas áreas não devem ser incluídos no ROI. ROIs menor também pode ser escolhido, no entanto um problema potencial com ROIs pequenos é que as paredes dos vasos pode mover-se ligeiramente na direção longitudinal para fora do ROI como o vaso contrai e relaxa. Outro problema potencial é que alguns vasos torção durante a contração, e estes vasos linfáticos não deve ser usado para o estudo. Thmovimentos de torção e geralmente são evitados, limitando o comprimento da linfático isolado a <1 mm. Além disso, por vezes, os segmentos de cada lado de uma válvula de não contrair / relaxar em sincronia. Neste caso, porque estes segmentos representam separados lymphangions funcional, a linfática deve ser estudado em apenas um lado da válvula, ou cada lymphangion podem ser estudados separadamente, com um ROI colocado em ambos os lados. Ao usar a objetiva de 10x, as paredes dos vasos devem ficar em foco durante contrações fásicas, porém se houver alguma partes das paredes que vão fora de foco durante as contrações nestas áreas não devem ser incluídos no ROI. Um ROI de fundo também é usado e deve ser colocado longe do navio (por exemplo, no canto da imagem). Um aumento na proporção de 340/380 indica um aumento na [Ca ^{2 +]} _i. Diâmetro luminal em vários pontos do tempo também pode ser medida usando a função do software de monitoramento por medida ou as paredes dos vasos ao longo do tempo (ver secção 6). </ Li>

5. Protocolo de Controle de Pressão

1. Para o estudo de pressão independentes do fluxo de impostos, a mesma pressão deve ser aplicada a cada micropipeta pela bomba de retorno servo-nulo. A tubulação de cada micropipeta é ligada através de um T-conector para tubo comum montado na bomba. Inicialmente ajustar a pressão intraluminal menos 2 cm H ₂ O por 45-60 min., Que é tempo suficiente para permitir o desenvolvimento de contrações espontâneas linfática.
2. Para o estudo use somente utensílios que atendam os seguintes critérios dentro do período de equilíbrio: (1) o navio desenvolve tom espontâneo de 2 cm H ₂ O, (2) o navio desenvolve regular, contrações espontâneas que são razoavelmente uniforme em todo o comprimento da embarcação . Muitas vezes, a jusante da área de uma válvula contrai mais do que o resto do navio, e estes navios serão usados ​​enquanto há evidências de que o restante do navio exibe atividade contrátil.
3. Registre o rápido time-lapse imagens durante o procedimento passo a pressão. Para cada um, a pressão vai começar a 2 cm H ₂ O por 30 s, e depois é levantada em uma etapa por dois, quatro, seis, oito, ou 10 centímetros H ₂ O por um minuto, e baixou de volta a 2 cm H ₂ O por 30 s.
4. Após a conclusão da série passo pressão, mudar a solução para um banho de Ca ^{2 +} livre APSS a 37 ° C para medir o diâmetro máximo passiva (Max D) e Ca ^{2 +-fluorescência} medidas em cada uma das pressões acima luminal. A D Max é usado para calcular tom e normalizar os dados entre vasos linfáticos de diferentes tamanhos.

6. Parâmetros linfáticos contráteis

1. Alterações no diâmetro do vaso ao longo do tempo pode ser determinada usando ferramentas de monitoramento objeto, na maioria dos pacotes de software de análise de imagem. Isto pode ser conseguido usando apenas um dos canais (usamos o canal de 340 nm, mas o canal 380 também pode ser usada). Um limiar de contraste é appmentiu para a pilha de imagem de modo que as paredes dos vasos são destaque, e depois ROIs abrangendo cada parede são atraídos para monitorá-los ao longo do tempo (Figura 3 A). O diâmetro interno pode ser determinada medindo o centróide de cada parede e calcular a distância entre os dois centróides, menos metade da espessura de cada parede.
   Uma segunda opção, quando é difícil controlar cada parede devido a um sinal forte na área luminal é medir o diâmetro externo, e usar um fator de correção baseado em uma medição estática das paredes dos vasos para obter diâmetro interno. Neste caso, o ROI mede o navio todo o diâmetro externo é monitorado (Figura 3 B). Este método também pode ser usado para determinar toda a área visível cruz seccional do linfática (Figura 3 C). Por causa da forma típica de um lymphangion, esta última opção pode fornecer uma melhor estimativa do volume real de fluido bombeado a cada contração do que usar de diâmetro em uma parte selecionadado navio.
2. A partir do estudo de lapso de tempo determinar os seguintes parâmetros de medições de diâmetro luminal linfática ^4,12,13:
   Freqüência de contração (CF), determinado pela contagem do número de contrações fásicas por minuto.
   Diâmetro diastólico final (EDD), que é o diâmetro pouco antes de uma contração fásica.
   Sistólico final diâmetro (ESD), o diâmetro no final de uma contração fásica.
   Amplitude da contração (AMP = EDD-ESD), um índice simplificado do volume sistólico.
   O diâmetro máximo passiva para cada pressão (Max D; determinado em Ca ^{2 +} livre de condições), que pode ser usado para determinar o tom gerada pelo músculo liso linfático, e também é utilizado para normalizar os dados entre os vasos linfáticos de diferentes diâmetros, ou do sistema linfático mesmo estudou em diferentes pressões luminal.
   EDD _1, que é o EDD associado com a primeira contração, após um passo de pressão. Isto é usado como ponto de partida quandodeterminar a constrição miogênica de um vaso linfático em resposta a um aumento na pressão luminal passo ^5.
   Constrição miogênica de um linfática isolado após um passo pressão é representada pela mudança normalizada na sequência de um aumento EDD passo pressão = 100 * (EDD - EDD ₁₎ / Max D.
   Variáveis ​​adicionais que podem ser calculados, mas são discutidos em detalhe em outro lugar ⁴ são:
   Tone = 100 * (Max D - EDD) / Max D, AMP normalizada = AMP / Max D
   Índice de volume sistólico (IVS) = π (EDD ² - ESD ²⁾
   Fração de ejeção (EF) = SVI / (πEDD2)
   Índice de Volume de fluxo (VFI) = CF x SVI.

7. Resultados representativos:

No início de cada contração fásica, houve um aumento transitório na [Ca ^{2 +]} _i (Figura 4). Além disso, após os aumentos na pressão luminal passo, a freqüência de Ca ^{2 +} e transientes phasic contrações aumentaram em sincronia. Estas observações são semelhantes a uma conclusão anterior, através de dutos torácico montado em um myograph fio ¹⁴ e suporte a dados anteriores que indica um papel central para oscilatório Ca ^{2 +} liberação das lojas interno no mecanismo subjacente o ciclo contrátil fásica ^15.

Também investigamos se [Ca ^{2 +]} _i durante a diástole (entre o Ca ^{2 +} transientes e contrações fásicas) está associada com o tom linfática e constrição miogênica causada por estiramento aumenta quando passo na pressão são impostas (Figura 5). Imediatamente após os aumentos passo na pressão de 4 centímetros H ₂ O e superior, [Ca ^{2 +]} _i durante a diástole aumentado constantemente, em comparação à linha de base antes da etapa de pressão (Figura 5B). Além disso, após o aumento inicial de diâmetro, devido aos aumentos passo na pressão (EDD _1), houve constrição miogênica (Figure 5C), definida como uma diminuição na EDD de EDD ₁ em relatórios anteriores ^5,12. Quando se compara a variação média normalizada em EDD entre os níveis de pressão diferentes, houve constrição significativamente mais após aumentos de 8 e 10 centímetros H ₂ O em relação ao 2 centímetros H ₂ O (Figura 6 A). O aumento constante da [Ca ^{2 +]} _i também foi relacionada com a pressão, com os aumentos passo de 6, 8 e 10 centímetros H ₂ O provocando mudanças significativamente maior no Ca ^{2 +} do que 2 centímetros H ₂ O ( Figura 6 B). No entanto, a pressão passo-Ca ^{2 +} relação parece planalto a essas pressões também. Estes resultados sugerem que um mecanismo Ca ^{2 +-dependente} está associada a constrição linfática miogênica em resposta ao estiramento. No entanto, o planalto da pressão passo-Ca ^{2 +} relacionamento sugere um mecanismo que aumenta o Ca ^{2 +} sensibilidade também pode contribuir para o aumento miogênica constriction nas etapas mais elevadas de pressão.

Figura 1. Esquemática do sistema de microscópio utilizado para a medição de [Ca ^{2 +]} _i em uma linfático isolado. A câmara linfático isolado é colocado no palco do microscópio invertido. A amostra é iluminada alternativamente a 340 e 380 nm, eo sinal fluorescente emitida pelo linfática é coletada com uma câmera CCD e armazenada em um computador pessoal. A pressão intraluminal do linfática é controlado por um sistema de feedback servo-nulo. O usuário define a pressão para o sistema e os transdutores de pressão em linha com o linfática relay a pressão intraluminal para o sistema de feedback, que pode aumentar ou diminuir dinamicamente a pressão através de uma bomba.

Figura 2. Exemplo da Região de Interesse (ROI) seleção para Fura-2 estudos de imagem raciométrica em vasos linfáticos isolados. A região selecionada inclui a maior parte do navio (excluindo as áreas de tocar o micropipetas) e zona envolvente para garantir o navio vai ser rastreados para o curso de tempo inteiro. Um ROI de fundo (canto superior direito) também é usado para eliminar sinais inespecíficos do banho envolvente.

Figura 3. Métodos de rastreamento linfático de bombeamento. A. O diâmetro interno pode ser determinado ao longo do tempo usando ROIs que o movimento trilha das paredes dos vasos. B. Quando o limiar de contraste é definido para incluir o navio inteiro, o diâmetro externo podem ser rastreados com um ROI único. Diâmetro interno pode ser estimada a partir dessas medições, corrigindo para a espessura da parede. C. Outra opção é acompanhar a área de abrangência do vaso, que pode ser usado para calcular o volume através da correção de espessura da parede eassumindo a linfática tem geometria cilíndrica.

Figura 4. Relação entre [Ca ^{2 +]} _i de diâmetro e linfático. A. Imagens representativas de um vídeo time-lapse de Fura-2 intensidade (formato de mapa de calor) em uma linfático isolado. As setas em cada imagem delinear o diâmetro externo do navio. Imagem 1 mostra o linfática durante a diástole, com relativamente baixa [Ca ^{2 +]} _i. Na imagem 2, a intensidade da relação 340/380 aumenta nas paredes dos vasos, pouco antes de a contração fásica que ocorre em imagens de 3-5. Por imagem 4, o Ca ^{2 +} transitória acabou, e por imagem 5, a fase sistólica terminou e que a embarcação está retornando ao seu estado de repouso. B. A trama de [Ca ^{2 +]} _i e diâmetro luminal linfática mostra que um aumento transitório na [Ca ^{2 +]} _i ocorre apenas antes de cadacontração fásica.

Figura 5. Mudanças no linfática [Ca ^{2 +]} _i eo ciclo linfática contrátil em resposta a aumentos na pressão. Os protocolos pressão etapa (A), 340/380 dados de taxa, representando [Ca ^{2 +]} _i (B), e mudanças de diâmetro linfático ao longo do tempo (C) são mostradas. A. pressão luminal da linha de base foi de 2 cm H ₂ O e os vasos linfáticos foi submetido a passo aumentos de +2, +4, +6, +8, e +10 cm H ₂ O. O intervalo de tempo entre cada gravação passo a pressão foi de 1-2 min. Cada passo de pressão causou um aumento na freqüência de aumentos transitórios da [Ca ^{2 +]} _i (B) e contrações fásicas (C). Diâmetro linfático também aumentou com cada passo de pressão luminal, e para a 4-10 cm H ₂ O de pressão passos, houve uma queda inicial no EDD que ocorreu after EDD1 (C), previamente descrita como constrição linfática miogênica. Houve também um aumento constante no basal [Ca ^{2 +]} _i entre transientes imediatamente após cada etapa aumento na pressão (B). A constrição miogênicas foi mais pronunciada com os passos maior pressão, no entanto, o aumento basal [Ca ^{2 +]} _i foi aproximadamente o mesmo para a 4-10 cm H ₂ O etapas pressão (B). Um aumento relatado anteriormente compensatório AMP também ficou evidente após as etapas de pressão de 6-10 cm H ₂ O (C).

Figura 6. Constrição Linfática miogênica eo aumento gradual da livre [Ca ^{2 +]} _i durante a diástole, aumenta logo após a etapa de pressão. A. A média EDD entre 30-50 s após o ₁ EDD é usado para calcular a mudança no EDD normalizado para cada passo de pressão. B. A intensidade da relação s 340/380 30-50 após o ₁ EDD foi dividido pela relação 340/380 média durante linha de base (2 cm H ₂ O). * P <0,05 versus o H 2 centímetros ₂ passos pressão ó. N = 4 navios estudados.

Movie 1. Exemplo de contrações fásicas em um vaso linfático isolado utilizado para o estudo. A pressão luminal foi fixado em 2 cm H ₂ O. O tempo decorrido e uma barra de escala são mostradas na parte inferior. As imagens de lapso de tempo foram coletadas com uma objetiva de 10X usando luz transmitida. Clique aqui para assistir o filme.

Filme 2. Raciométrica imagem Fura-2 em um bombeamento linfático isolado. A escala do mapa de calor é mostrado no canto superior esquerdo eo tempo decorrido e barra de escala são mostradas na parte inferior. A pressão foi inicialmente fixado em 2 cm H ₂ O e foi criado a 8 cm H ₂ O a partir de 0,5 min e returned a 2 cm H ₂ O em 1,5 min. Clique aqui para assistir o filme.

Discussion

A nova combinação de métodos foi empregado para estudar intrínseca de bombeamento dos vasos linfáticos. A capacidade de medir simultaneamente mudanças na [Ca ^{2 +]} _i e diâmetro no sistema linfático de bombeamento permitirá estudos sobre as contribuições relativas de Ca ^{2 +-dependente} e Ca ^{2 +-sensibilizantes} vias de sinalização em todo o mecanismo que rege o ciclo linfática contrátil.

O ciclo contrátil linfática consiste em contrações fásicas sobreposto tom. Os dados mostram que cada contração fásica é associada a um aumento transitório na [Ca ^{2 +]} _i, sugerindo um papel central de Ca ^{2 +} no mecanismo de marca-passo, e que a frequência dos transientes de Ca ^{2 +} é sensível a mudanças na pressão luminal . Nossos dados mostram também que o rápido aumento de pressão pode provocar um aumento constante no basal [Ca ^{2 +]} _i entre transientes. Este aumento pode contribuir paraa constrição miogênica que é observado na coleta de vasos linfáticos seguinte aumenta passo na pressão luminal. No entanto, observou-se um platô dos aumentos neste basal [Ca ^{2 +]} _i com etapas que vão da pressão 6-10 cm H ₂ O, que tinha diferentes graus de constrição miogênica. Estes dados sugerem que um outro mecanismo, possivelmente um mecanismo Ca ^{2 +-sensibilizante,} também está envolvido na resposta miogênica à pressão.

Uma hipótese com esses estudos é que a maioria das medidas Ca ^{2 +} está contido em músculo liso. No entanto, Ca ^{2 +} nas células endoteliais e outros tipos de células que podem estar presentes nos vasos linfáticos também contribuem para o observado geral [Ca ^{2 +]} _i, portanto, os valores medidos são, provavelmente, uma superestimação do músculo liso [Ca ^{2 +]} _i em linfáticos. Quaisquer ² Ca ⁺ medido a partir do endotélio não se espera que contribuem diretamentepara suavizar a contração muscular com base em estudos anteriores em arteríolas ^16. Esta questão será abordada em futuras experiências em que os vasos linfáticos são desprovidos de endotélio.

Ao usar corantes raciométrica para avaliar [Ca ^{2 +]} _i em células ou tecidos, o movimento da amostra podem causar artefatos. Para minimizar artefatos de movimento na contratação de vasos linfáticos, utilizamos um ROI que inclui tanto do navio como possível determinar 340/380 rácios. Nós também só estudo vasos que ficam em foco durante o seu ciclo de contração. Por causa de artefatos potenciais que podem surgir do movimento dos navios, ao invés de determinar a absoluta [Ca ^{2 +]} _i em um local particular, obtemos a média de uma grande área do navio. Nós nos concentramos em relação as mudanças na média [Ca ^{2 +]} _i ao longo do tempo e como essas mudanças se relacionam com a contração fásica e tônica dos vasos.

Dete em resumo,rmination de mudanças na [Ca ^{2 +]} _i por imagem raciométrica no sistema linfático coleta isolado representa uma poderosa ferramenta para decifrar o Ca ^{2 +-dependente} e Ca ^{2 +-sensibilizantes} mecanismos subjacentes do ciclo linfática contrátil. Com este método, futuros estudos utilizando agonistas seletivos ou inibidores de várias vias de transdução de sinal também irá ajudar a diferenciar os mecanismos moleculares subjacentes a única contração fásica contra tônica no músculo liso linfático.