Summary
Para seguir a progressão de uma resposta imune ao longo do tempo dentro do mesmo rato, gânglios linfáticos pode ser sequencialmente removido por cirurgia. Aqui, nós descrevemos como esta técnica pode ser realizada.
Abstract
No campo da imunologia, para compreender a progressão de uma resposta imunitária contra uma vacina, uma infecção ou um tumor, a resposta é muitas vezes seguida ao longo do tempo. Do mesmo modo, o estudo da homeostase de linfócitos, requer a realização do curso de tempo. Realização destes estudos, dentro do mesmo rato é ideal para reduzir a variabilidade experimental, bem como o número de ratinhos utilizados. Retirada de sangue permite realização de experimentos do curso de tempo, mas ele só dá informações sobre linfócitos circulantes e fornece um número limitado de células 1-4. Uma vez que os linfócitos circulam pelo corpo e que residem nos gânglios linfáticos têm propriedades diferentes, é importante examinar ambos os locais. A remoção sequencial de nódulos linfáticos por cirurgia proporciona uma oportunidade única para seguir uma resposta imune ou expansão de células imunes no mesmo rato ao longo do tempo. Além disso, esta técnica produz entre 1-2x10 células por 6 nó de linfa que é suficiente para perform caracterização fenotípica e / ou ensaios funcionais. Cirurgia nó de linfa ou seqüencial linfadenectomia foi usada com sucesso por nós e outros 5-11. Aqui, nós descrevemos como os nódulos linfáticos inguinais braquial e pode ser removido através de uma pequena incisão na pele de um rato anestesiado. Desde a cirurgia é superficial e feito rapidamente, o mouse se recupera muito rapidamente, é que cura bem e não sentir dor excessiva. Cada segundo dia, é possível colher um ou dois nódulos linfáticos, permitindo para experiências de curso de tempo. Esta técnica é portanto adequado para estudar as características de nódulo linfático que residem linfócitos ao longo do tempo. Este método é adequado para vários projetos experimentais e acreditamos que muitos laboratórios se beneficiariam de realização de cirurgias seqüenciais nó de linfa.
Protocol
1. Preparação antes da cirurgia
Os ratos foram tratados de acordo com o Conselho Canadense sobre as orientações de cuidados com animais.
- Ratinhos anestesiar por injecção de cetamina / xilazina (150/300 mg / kg, ip) ou por inalação de isoflurano (2%, oxigénio 1L). Se estiver disponível, isoflurano deve ser utilizado, pois permite um melhor controlo da anestesia tempo e profundidade. Além disso, o oxigénio é administrado ao mesmo tempo que suporta as funções fisiológicas do animal. Além disso, isoflurano está directamente eliminado pelos pulmões e, assim, não necessita de metabolização hepática ou renal.
- Injectar a buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg, sc) ou outro analgésico.
- Aplicar pomada para os olhos do mouse antes da cirurgia para evitar ressecamento do olho (se o isoflurano é usado).
- Verifique se o mouse está dormindo por beliscar a sua pata e rolar sua cauda. Se o mouse não reagir, avançar com a cirurgia.
2. A Cirurgia
- Coloque o mouse de lado.
- Localize a região onde você vai realizar uma incisioN, dependendo do LN deseja colher. (Figura 1).
- Aplicar clorexidina, ou outro desinfectante, a essa região.
- Fazer uma pequena incisão, com uma tesoura afiada (cerca de 5 mm), quer na parte de trás da perna dianteira ou acima da pata posterior perto do abdómen (Figura 1).
- Retire os pêlos soltos tenha sido cortada com a pinça. Se preferir, você pode raspar o mouse antes de fazer a incisão. No entanto, ela aumenta o procedimento e descobrimos que não é necessário uma vez que, como mostrado aqui, ela não melhorar a cicatrização ou diminuição da infecção, que são ambos muito raro.
- Estique a incisão com pinça de 2 a fim de ver o LN. A incisão pode chegar a 10 mm. A LN aparece acinzentada ou escura do que a gordura ao redor.
- Comprima a fáscia (a fina membrana que cobre a gordura e de tecido) em cima da LN com um fórceps e puxar levemente sem quebrar o tecido circundante.
- Coloque a pinça segundo, tanto quanto possível underneath o LN. Com as pinças primeiro, quebrar a fáscia e remover o LN. Se você tiver êxito colheu o LN, uma mancha de sangue deve aparecer no local onde o LN foi previamente localizado. Note-se que os dissipadores de LN em solução isotónica. Este teste simples permite validar que você tenha extraído um LN e tecido não gordura.
- Verificar que nenhum pêlos são na ferida.
- Feche o incisão furando as 2 partes de pele em conjunto (o interior da pele) e por grampeamento-los com um clip. Utilizamos alguns Clipe Michel com a pinça aplicando. Instalar um ou dois clipes, dependendo do tamanho da incisão. Na maioria das vezes, os clipes de cair quando o tecido cicatriza.
3. Cuidados Pós-Operatórios
- Adicionar algum alimento molhado para o fundo da gaiola de modo que os ratinhos pode alimentar facilmente após a cirurgia.
- Cerca de 6 a 8 horas após a cirurgia, os ratos verificar para garantir que eles não experimentam dor. Observar atentamente o seu comportamento (postura, marcha, eminteracção com congéneres ea aparência da pele). Se a aparência geral dos ratinhos é pobre, administrar uma segunda dose de buprenorfina. No dia seguinte, os ratos devem recuperar a sua comportamento normal de outro modo continuar a administração de buprenorfina. Os ratos nunca deve atingir os parâmetros previamente estabelecidos e aceites pelo seu Conselho Animal Care. Você pode querer procurar aconselhamento e ajuda de seu técnico de biotério de animais cuidados.
4. Manuseio de Linfonodo
- No laboratório, para obter uma suspensão de célula única, dissociar o LN como por sua procedimento habitual. Nós pressionamos LN contra lâminas foscas e rotineiramente obter 1-2 x 10 6 células por LN. Alternativamente, podemos preparar o LN para a extração de RNA.
- Corar as células de acordo com o protocolo usual. Você deve obter esperados LN perfis de citometria de fluxo.
5. Os resultados representativos
Um exemplo de p dispersão frontal e laterallote é mostrado para LNs colhidas a partir de um rato anestesiado por cirurgia ou a partir de um rato sacrificado (Figura 2). O perfil e as percentagens de células na porta vivo de linfócitos são os mesmos que demonstra que a cirurgia LN é uma técnica apropriada para as células de colheita.
Figura 1. Inguinal e localização LN braquial no mouse. A. A LN inguinal está localizado logo acima da pata traseira, um pouco em direção à barriga. B. A LN braquial está localizado atrás da pata dianteira.
Figura 2. Perfil de citometria de fluxo de linfócitos obtidos após a cirurgia LN. Perfis de dispersão frontal e lateral são mostrados para linfonodos colhidos a partir de um Anesthrato etized por cirurgia (A) ou de um rato sacrificados (B). LNs foram colhidas, dissociados e analisadas num citómetro de fluxo. As percentagens de células na porta vivo de linfócitos são mostrados.
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Discussion
Nós descrevemos um protocolo de cirurgia LN que pode ser aplicado a muitos sistemas experimentais. Embora muito útil para acompanhar as respostas imunes ou homeostase de células imunes, esta técnica tem algumas limitações. Em primeiro lugar, apenas quatro LNS pode ser colhido. Em segundo lugar, a resposta imune deve ser estudada sistémica ou ocorrer nas inguinais superficiais ou braquial (pele de drenagem) LNS. Finalmente, o número de células colhidas é influenciada pela qualidade da remoção LN, uma limitação técnica, que podem contribuir para a variabilidade experimental quando os números de células absolutas são necessários. No entanto, a percentagem de células alvo, por si próprio, pode proporcionar informação relevante e precisas particularmente quando o tamanho do LN não varia entre as diferentes condições experimentais. Felizmente, uma vez que a técnica é bem dominado, a qualidade de LN remoção melhora, permitindo o número de células altamente reprodutíveis em cada LN. Acreditamos que, apesar destas poucas limitações, a cirurgia LN oferece vantagens importantes para estudara progressão de respostas imunes. Em primeiro lugar, a resposta imunitária ao longo do tempo pode ser controlado no rato um dado, diminuindo variabilidade experimental, bem como o número de ratinhos utilizados. Segundo, os eventos, tais como linfócitos ou homeostase de iniciação da resposta imune ocorrendo nos LNS pode ser directamente estudada. Outra vantagem importante é que as células mais pode ser recuperado a partir LNs do que a partir de sangue para a caracterização de células permitindo estendida. Esta técnica é também adequado para outros fins, como genotipagem ratinhos transgénicos ou estudar outras populações de células residentes ou tráfico através das LNs tais como células B, células dendríticas e macrófagos.
Nosso laboratório e outros têm vindo a utilizar essa técnica por vários anos e nunca observou qualquer interferência no curso da resposta imune 7-9,12,13 e na homeostase imune 5-7. LN cirurgia seqüencial em repouso tipo selvagem C57BL / 6 não afetou a porcentagem eo número de células CD4 + CD8 + 5-7. Além disso, também não afetou esses parâmetros nos linfonodos residuais. Além disso, durante o curso de uma resposta imune, a remoção LN superficial não afectou a cinética da resposta de células T, nem a geração de células T de memória 8,9,12,13. Além disso, comparação lado a lado de resposta das células T seguidas por cirurgia LN seqüencial ou sacrificado rato não apresentaram diferenças em nossas mãos (resultados não publicados e Figura 2). Portanto, a cirurgia LN sequencial é adequado para estudar a homeostase da célula T e de resposta.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Sylvie Lesage e todos os membros do laboratório para a leitura crítica do protocolo. Este trabalho foi financiado por uma subvenção (MOP-77545) do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque é apoiado por uma bolsa de estudos FRSQ Sênior e Mélissa Mathieu recebeu um NSERC Alexander Graham Bell Canada Bolsa de Pós-Graduação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
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