Summary
מרובה יעד האיתור הוא פיתח אלגוריתם ביתי למעקב אחר בנפרד מולקולות שכותרתו בתוך קרום הפלזמה של תאים חיים. יעיל באיתור, הערכה ואיתור מולקולות לאורך זמן בצפיפות גבוהה לספק ידידותי למשתמש, כלי מקיף לחקור הדינמיקה קרום ננומטריים.
Abstract
המטרה שלנו היא לקבל תיאור מקיף של התהליכים המולקולריים המתרחשים קרומים תאיים על תפקודים ביולוגיים שונים. מטרתנו המאפיינת את הארגון מורכב הדינמיקה של קרום הפלזמה ברמת מולקולה בודדת, על ידי פיתוח כלים אנליטיים ייעודיים למעקב בודד החלקיקים (SPT) בצפיפות גבוהה: מרובות יעד Tracing (MTT) 1. מולקולה בודדת videomicroscopy, מציע אלפית השנייה ו ננומטריים ברזולוציה 1-11, מאפשר ייצוג מפורט של הארגון קרום 12-14 על ידי מיפוי מדויק מתארי כגון קולטנים לוקליזציה תא הכליאה, ניידות או אינטראקציות.
אנחנו וביקרה SPT, הן בניסוי ו אלגוריתמית. היבטים הניסוי כללו אופטימיזציה של ההתקנה וסימון התא, עם דגש מיוחד על הגעה צפיפות תיוג הגבוהה ביותר האפשרית, על מנת לספק תמונת מצב דינמית של דינמיקה מולקולריתזהו זה מתרחש בתוך הממברנה. בעיות אלגוריתמיות מודאג כל צעד המשמש מחדש מסלולים: איתור פסגות, האמידה המחודש, לטפל על ידי כלים מסוימים מתוך ניתוח התמונה 15,16. יישום דפלציה לאחר זיהוי מאפשר פסגות הצלת מוסתר בתחילה, פסגות שכנות חזקות יותר. יש לציין, שיפור זיהוי ישירות על חיבור מחדש, על ידי צמצום הפערים בתוך מסלולים. הופעות הוערכו באמצעות סימולציות מונטה קרלו עבור צפיפות תיוג ערכי רעש שונים, אשר בדרך כלל מייצגים את שתי המגבלות העיקריות מדידות מקבילות ברזולוציה גבוהה spatiotemporal.
דיוק ננומטריים 17 השיג עבור מולקולות בודדות, באף אחת ברציפות on / off אופטיקה photoswitching או שאינו ליניארי, יכול לספק תצפיות ממצה. זהו הבסיס של שיטות nanoscopy 17 כמו 18 STORM, פאלם 19,20, 21 או RESOLFT STED 22,23, WHIפרק עשוי לעיתים קרובות דורשים דגימות הדמיה קבועים. המשימה המרכזית היא זיהוי והערכה של דיפרקציה מוגבלים פסגות הנובעות מולקולות בודדות. לפיכך, מתן הנחות הולמים כגון טיפול דיוק מיקומית קבוע במקום התנועה הבראונית, MTT מתאים בצורה ישירה עבור ניתוחים הננוסקופי. יתר על כן, MTT יכול ביסודו לשמש בכל קנה מידה: לא רק מולקולות, אלא גם על תאים או על בעלי חיים, למשל. לפיכך, MTT הוא אלגוריתם מעקב רב עוצמה מוצא יישומים בקני מידה מולקולרית תאית.
Protocol
בסרטון הזה, אנו מציגים מעקב מלא יחיד ניסוי החלקיקים, באמצעות הקוונטים נקודות ממוקדות לקולטן בקרום מסוים. המטרה העיקרית של ניסוי זה מורכב מסוגים שונים של התנהגויות להפלות דיפוזיה מולקולרית שנמדדו בתוך הממברנה של תאים חיים. ואכן, תנועות מולקולריים הנובעים על הממברנה יכול בדרך כלל לסטות דיפוזיה הבראונית על ידי מכוונות באופן ליניארי או מוגבל בתוך 26-29 nanodomains, למשל. מטרתנו בו זמנית בעקבות כמו קולטנים רבים ככל האפשר מבחינה טכנית, כדי לספק תמונת מצב של מגוון שמקורה הדינמיקה המתרחשים בתוך הממברנה של התא החי. זה צפוי, בסופו של דבר לאפשר פענוח של מנגנוני ויסות שטח פני התא איתות הקולטן.
1. תא תרבות
- מכינים את המדגם נייד: להשתמש חסיד COS-7 תאים אשר מבטאים endogenously הצמיחה אפידרמיס גורם הקולטן (EGFR) 30. כאשרעבודה עם תאים חיים ללא אנטיביוטיקה לוודא שאין זיהום לטנטי משנה לזיהוי על ידי שימוש בטכניקות סטריליות הנכונים בכל עת במהלך תקופת ההכנה.
- לגדל תאים בינוני שלם (DMEM עם 10% נסיוב של עגלים, גלוטמין 1%, 1% ו HEPES פירובט סודיום 1%, ראה טבלה של חומרים כימיים ספציפיים בהמשך), על 37 מעלות צלזיוס עם 7% CO 2, מקפיד לקיים אותם תת confluent, גידול מעריכי לפני להפיץ אותם Lab-Tek.
- ביום שלפני הניסוי, להפיץ 5,000 תאים / היטב 8-גם בתאי (Lab-Tek) ו דגירה בן לילה. ספירת תאים מבטיחה צפיפות התאים קבוע, ולכן היחס לשחזור של הקוונטים נקודות לכל תא.
2. סימון התא
הכן הקוונטים נקודות עם ציפוי מסוים. הקוונטים נקודות הם חלקיקים המורכבים ניאון של מוליכים למחצה. חלקיקים אלה מהווים ריבית גבוהה כי הם בהירים מאוד photostable לעומת קלאסיתבדיקות ניאון 31,32, דבר המאפשר השגת האות המתאימה יחס רעש (SNR) הדמיה מולקולה בודדת.
- לפני הניסוי, להפיק קטעי Fab נגד EGFR מקו תא hybridoma (מב 108, ATCC HB-9764), על ידי עיכול עם פפאין כפי שתואר קודם לכן 21.
- המצומד Fab עם ביוטין, לפי הוראות היצרן (EZ-LINK sulfo-NHS-LC-biotinylation קיט, Thermo Scientific, איור 1 א.).
- השתמש הקוונטים נקודות פונקציונליות עם streptavidin (Invitrogen) ו פולטת ב 605 ננומטר (אורך גל הפליטה האופטימלי לגילוי הזוהר, והפרדה בין autofluorescence הסלולר).
- מכינים את הפתרון תיוג במדיום מלאה (ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים), על מנת להרוות את streptavidins הנוכחי סביב הקוונטים נקודות, כמו גם כדי למנוע צבירה הלא ספציפית מחייב את התאים כדי coverslip.
- הכן שני פתרונות ביניים:1 עם הקוונטים נקודות, streptavidin ועוד אחד עם Fab biotinylated, כל אחד ב -20 ננומטר.
- מערבבים נפח שווה של שני פתרונות: לערבב את הקוונטים-Fab נקודות עם יחס 1:01 להשיג ריכוז העבודה הסופית של 10 ננומטר Fab: הקוונטים נקודות מורכב. באמצעות יחס equimolar מעדיף את היווצרות מונו פונקציונליות קומפלקסים המורכבים 1 הקוונטים-dot ואחד שבר Fab biotinylated. זה מעדיף תיוג חד ערכי, הגבלת תצפיות החפצים ב בשל הקולטן cross-linking 33,34.
- דגירה במשך 15 דקות במהירות של 25 ° C, באמצעות שאכר ב -1,200 סיבובים לדקה כדי למנוע צבירה. לערבב ואז הוא מוכן לשימוש על תאים חיים.
- דגירה תאים μl 100 תמהיל במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 7% CO 2.
- לשטוף עם תאים בינוניים שאינם autofluorescent הדמיה (מאגר HBSS, HEPES 1%, ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים) מראש התחמם ב 37 ° C.
- מוציאים בזהירות את עודף תוויות למנוע האו"םצריך לפנק SNR ידי מאוגד, מתוך התמקדות הקוונטים נקודות, על ידי בהרחבה כביסה כל טוב עם בינוני הדמיה, בדרך כלל 5 פעמים בטמפרטורת החדר, עם עיכוב לפחות 5 דקות לפני הכביסה האחרונה.
3. אופטי ההתקנה
הגדרת וידאו מיקרוסקופ מורכב מארבעה חלקים עיקריים:
- מיקרוסקופ הפוכה עם קוביית הקרינה ספציפי (FF01-457/50 עירור, FF495-Di02 dichroic, ו FF01-617/73 מסנני פליטה, Semrock) ו צמצם המספרי גבוה (1.3 או 1.49) שמן טבילה 100x אובייקטיבי.
- 100 W כספית מנורה (מצמידים את המיקרוסקופ באמצעות סיב אופטי, הימנעות הפרעה thermoregulation).
- 512 x 512 פיקסלים רגישות גבוהה EMCCD המצלמה כדי להשיג את יחס אות לרעש מספיק.
- חממה לשמור דגימות ביולוגיות על 37 מעלות צלזיוס במהלך הניסוי.
4. רכישה
- בחר בתאים מבודדים היטב התפשטות. זהמעדיף את הארכת lamellipodia, נחמד שטוחה, המותאמת הטוב ביותר לחפש בו מישורי תנועה של מולקולות בממברנה.
- להעריך את המצב הפיזיולוגי הסלולר על ידי המראה שלה הן האור המועבר וב הקרינה: התנועה שלפוחי אינטנסיבי, היעדר סימנים נמקי או אפופטוטיים, autofluorescence נמוך, ואת ממוצע חזקה הקוונטים-dot תיוג (בדרך כלל עד 1000 הקוונטים נקודות לכל תא, ראה איור. 1 ב ', ג').
- בחר צפיפות גבוהה תיוג, שהוא קריטי עבור ניטור בו זמנית קולטנים רבים ככל האפשר. זה מוגבל למעשה הן על ידי פיזיולוגיים (ביטוי פני השטח, הנגישות epitope, תנועה לרוחב) ופרמטרים אלגוריתמיים (שאינן חופפות נקודה ממרח פונקציות (כוחות הביטחון הפלסטינים), גם תוך טשטוש חשבון בשל ההצעה, כדי לאפשר גילוי נאות המחודש).
- עבור כל תא, 1 לרכוש התמונה בשדה brightfield (מעדיפים להשתמש DIC, אם קיים) שיכולים להמשיך לאפשר בדיקת היבט התאגבולות מרחביים של lamellipodia.
- שמור את התמונה באמצעות שם זהה לזה של מחסנית-video (כגון cell1.tif & cell1.stk למשל), בתוך תיקיית משנה בשם DIC, שכן, עם המוסכמות הללו, האלגוריתם יכול למצוא באופן אוטומטי בחזרה את התמונה ההתאמה כל המחסנית.
- לרכוש 1 עד 3 קטעי וידאו לכל תא, ללא הרף, בדרך כלל בשיעור 36-MS, קצב המהיר ביותר להשגה במסגרת מלאה עם המצלמה הזו. עם זאת ניתן לרכוש בתדרים גבוהים יותר, עד לשיעור 1-MS, באמצעות CCD ייעודי עם רגישות מוגברת ו / או פחות פיקסלים. הטכנולוגיה מספקת מסגרת העברת עיכוב זניח בין מסגרות.
- שיפור אלקטרונים להכפיל תמיד צריך להגדיר לכל היותר (ממש מתחת רוויה, אם רלוונטי) כדי לאפשר להגיע רגישות מולקולה בודדת, עם יחס אות לרעש מספיק, לפחות מעל dB 20 (לאיתור יעיל השיא 1), בדרך כלל סביב 25-30 דציבל.
- בדרך כלל לרכוש 300 מסגרות לשנייה חטא וידאו,מסלולי לספירה משוחזרים על ~~~HEAD=NNS 100 מסגרות בממוצע, מוגבלת בעיקר על ידי אירועים מהבהב ארוכות. תדירות ואורך וידאו ניתן להתאים ליתר ביטחון נתון, אשר יכול לדרוש עקבות ארוכים יותר, למשל.
5. MTT ניתוח
- בחר את הנתיב אל הספריה המכילה את קבצי וידאו כדי להעריך את בסיס הנתונים נתון עם Matlab או אוקטבה.
- כדי להפעיל את ניתוח אוטומטי לחלוטין 1,35, הקלד את הפקודה detect_reconnex23 של אוקטבה, או MTT23i ב Matlab. תוכנית זו הוא קיצור של "גרסה 2.3, עם ממשק משתמש" והוא זמין להורדה, יחד עם הגירסה הקודמת 2.2. זה 1 מציג ממשק גרפי המציג את כל הפרמטרים המשמשים, כפי שמוצג באיור. 2.
6. נציג תוצאות
MTT מנתח באופן אוטומטי את כל וידיאו, כדי לספק עקבות של מטרות שזוהו והעריך, כהשלמה נוספתvestigations, כגון איתור הכליאה. בסופו של דבר זה מאפשר מיפוי עקבות על תמונות תא (איור 1 ג & 3).
MTT תיאור
ניתוח MTT הליבה מתבצע על כל מסגרת, הפנייה 3 משימות עיקריות (איור 3):
- גילוי של נוכחות או העדר של היעד (הקוונטים-dot), בתוך תת אזור במרכז ברציפות סביב כל פיקסל, כאשר שתי השערות מושווים הזזה: נוכחות גם של האות, עם כוחות הביטחון הפלסטינים modelized כמו דו מימדי גאוס שיא , או רק רעש, תוך שימוש הסף ביטוח נמוכה אזעקת שווא מספיק, עם זיהוי פחות מופרכת לכל מסגרת. זה מוביל מפת ההסתברות לגילוי. לכל היותר בכל המקומי נחשב כמטרה המשוערת, לבטח, כי רמת ההסתברות שלה הוא גבוה יותר מאשר הערך המינימלי, נקבע לפי ההסתברות הרצויה של אזעקת שווא (PFA). גבול זה נקבע נמוך מספיק כדי להבחין ביעילות SIGnals של רעש, מניעת על לתגליות מזויף הטוב ביותר (PFA של 10 -6 כברירת מחדל, כדי להבטיח פחות שגיאות 512 x 512 תמונות פיקסל), תוך מתן הסתברות גבוהה מספיק של איתור, והגיע 1 אופטימלית ניבא באופן תיאורטי. ראוי לציין, כי הדרישה של שימוש באזור המשנה מרמז על כך את גבולות התמונה (3 פיקסלים, עבור חלון ברירת המחדל של 7 x 7 פיקסלים) לא ניתן להעריך.
- הערכה, עבור כל מטרה מזוהה, הפרמטרים הרלוונטיים, כגון מיקום תת פיקסלים ועוצמת האות. עבור כל מטרה מזוהה, לפחות מרובע גאוס, ניוטון בכושר מתבצע הבא להעריך את המיקום, הרוחב והגובה של גאוס זוהה. זה מספק בעיקר את עמדת תת פיקסלים של צבע (10 עד 20 ננומטר דיוק של טיפוסי ערכים SNR וצבעים חסרי תנועה או להתפוגג אט אט, להגדיל עד ל ~ 100 ננומטר במשך צבעים מתפשטים והולכים על 0.1 מיקרומטר 2 / s).
- חיבור מחדש של מטרות חדשות עםעקבות בנו כבר מעל המסגרות הקודמות. סט של מטרות חדשות משתווה עם סט של עקבות קודמות. לשם כך, על מנת להקצות לכל יעד זכר, אם אפשר, כל מידע סטטיסטי ניתן לקבל בשלב הגילוי נעשה שימוש, לא רק המיקום, אלא גם בעוצמה, רוחב, מהבהב וסטטיסטיקה הכרוכים בכך. לפיכך, מטרות לא מוקצים רק עקבות הקרוב: במקרה של עקבות המעבר, עוצמה, מהירות, רוחב המהבהבים ייחשב. זה מספק את הציון המחודש אופטימלית מבחינה סטטיסטית. אסטרטגיה זו נמנעת, כאשר הדבר אפשרי, הטיית המחודש לעבר השכנים הקרובים ביותר.
פסגות זוהה יכול להיות בדיעבד דחה אם הערכה או חיבור מחדש נכשל. מבחן מיוחד מטפל זיהוי של לשיאים חדשים, אשר תיזום עקבות חדשות. בדיקה זו עושה שימוש PFA מחמירה יותר (10 -7), להתחבר מחדש מאז השיא שמץ ניתן לפרש דה פקטו כמו O אימות ו הרלוונטיות שלה (קריטריון וזאת על פי הגדרה לא ישים עבור לשיאים חדשים).
מסלול ניתוח
כליאה זמני אפשרי מוערך הבא הפונקציה ביחס הפוך דיפוזיה המקומית 24-29. החלת הסף מאפשר להגדיר מוגבל או לא פרקים. על ידי iterating אלה על כל עקבות, אנחנו יכולים למפות הדינמיקה הממברנה, מבחינת הכליאה חולף / להאט את האירועים. זה יכול לחילופין להיות מיוצג באמצעות או בינארי או ערכים בדידים של מדד זה ריתוק.
כברירת מחדל, MTT מבצעת באופן אוטומטי משימות אלה, תוך חיסכון 8 פרמטרים השיא בקובץ טקסט: מספר מסגרת, אני ואת המיקום J, עוצמת האות, רדיוס, לקזז למצמץ, עבור כל מסגרת וידאו (קבוצה של 7 שורות) זכר (עמודה) . פרמטרים אלה הפלט ניתן מחדש ב Matlab או אוקטבה באמצעות סקריפט fread_data_spt להמשך ניתוח עקבות IE או עוצמת אות, כפי שהודגם ב "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example התסריט בנספח.
ניתוחים נוספים להוביל למפות עקבות על כל תא (איור 1 ג & 3) ולספק הפצה היסטוגרמה עבור הפרמטרים הרלוונטיים (כגון עוצמות שיא, יחס אות לרעש או ערכים מקומיים דיפוזיה). עבור כל קובץ, כלומר וסטיית התקן של כל פרמטר נשמרים בקובץ טקסט, יחד עם תמונה של היסטוגרמות את. הפצות לוגריתמי, כמו עבור התקות רבועים R 2, להוביל ממוצע גיאומטרי. מקדם הדיפוזיה D מחושב בהתקף ליניארי במהלך חמש הנקודות הראשונות של עקומת MSD. ערכים אלה מספקים סקירה של הניסוי היו מעורבים על קינטיקה של תגובות למשל הסלולר או טיפולים תרופות / אנזימטית המשפיעים על הארגון הממברנה. מאז MTT הוא קוד מקור פתוח, היבט זה יכול להיות מותאם בקלות לכל חקירה ייעודי.
599fig1.jpg "alt =" איור 1 "/>
באיור 1. מעקב אחר רצפטורים הדינמיקה קרום ידי MTT (א) רכיבי ממברנה, כמו EGFR, מתויגים עם הקוונטים נקודות מצמידים את שברי Fab biotinylated (ציור סכמטי עם קנה המידה הנכונה של כ כל מולקולה). (ב ') תמונה ניאון אופייני רכשה תא חי COS-7, עם הזמן 36-ms חשיפה, המתארת מוגבלים עקיפה פסגות המתאימים לקולטן שכותרתו בנפרד. (ג) פלט של ניתוח MTT הצגת מסלולי משוחזרות של הקולטנים, מעולף על התמונה brightfield של התא.
איור 2. פרמטרים MTT קלט. פעולה MTT23i פותח ממשק משתמש גרפי המציג את כל הפרמטרים קלט, שמות ערכי ברירת מחדל, כמתואר בפרסום הקודם שלנו 1. בפרמטרים, האלגוריתם במרחב ובזמן (Windows Search, רדיוס שיא, דיפוזיה מקסימלית ו מהבהב) הן ביחידות סטנדרטיות מימדים, פיקסלים ומסגרות. כיולים ניתן ליישם בדיעבד להמיר תוצאות פלט. ערכים של ברירת מחדל, המתאימים 512BFT אשד עם בהגדלה 100x, הם גודל פיקסל: 156 ננומטר / pxl ועיכוב מסגרת: 36 ms / המסגרת.
החוקרים צריכים לייעל כמה פרמטרים קריטיים, כגון מקדם דיפוזיה המרבי הצפוי ("גרסאות מקס") והיעלמות מהבהב לכל היותר ("T off"). שתי מגבלות המרחב והזמן הם כמעט היחידים שצריכים לשקול מחדש את תנאי הניסוי נתון, את האחרים להיות מוגדר ערכי ברירת המחדל חזקים. למשל, מספר אזעקות שווא מוגדרת באופן ישיר, כדי להבטיח פחות שגיאות לכל מליון פיקסלים, ולכן פחות מ 1 לכל מסגרת, אשר מספקת ברוב המקרים. כל הפרמטרים נשמרים בקובץ טקסט בתיקייה פלט, המאפשר למשתמשים לבדוק אילו הגדרות לאחר מכן שימשו לניתוח.
s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" איור 3 "/>
איור 3. השלבים העיקריים של ניתוח MTT. החל מ מחסנית ניסיוני של תמונות הקרינה, פסגות מזוהים ברצף ובאופן אוטומטי, מוערך על ידי התאמה גאוס ו מחדש על מסגרות (טווח הראשונה לפעילותו, החלק העליון של תרשים זרימה). עקבות יכולים להמשיך לנתח את הכליאה המשוער, למשל, ובסופו של דבר מובילים למפה דינמית של מתארי הרלוונטיים (טווח של 2 פעולות, החלק התחתון).
באיור 4. ולנסי תיוג לא משפיע MTT. כדי להעריך את הטיות אפשריות הציג תיוג ערכית artefactual, ניתוח MTT בוצע מעקב אחר EGFR אנדוגני מתויג באמצעות 2 שיטות שונות, כדי ליצור ולנתח מפות של מסלולים. (א) רצפטורים תויגו עם Fab biotinylated ו הקוונטים dots605-streptavidin, כמפורט בפרוטוקול.במקרה זה, ערכיות רב של הקוונטים נקודות ו streptavidins עלול לגרום צימוד קולטנים כמה צבע אחד. (ב) רצפטורים תויגו עם Fab מצמידים ישירות צבע אורגני, Atto647N. במקרה זה, Fab 1, ומכאן 1 הקולטן, ניתן מצמידים את צבע אחד או יותר. (ג) ממוצע עקומת מרובע (MSD) עקירה חושבה עבור כל זכר עבור כל תא, שכותרתו או עם נקודה קוונטית, או צבעים ATTO (גרפים על ימין ועל שמאל, בהתאמה). מקדמי דיפוזיה חושבו על ידי התאמה ליניארית על פני חמש הנקודות הראשונות (קו מקווקו אדום) MSD. כל תוכנית של תיוג הוביל ערכים דיפוזיה דומה (גרף המרכזי). Qdot: הקוונטים dots605 (n = 5 תאים), ATTO: Atto647N (N = 7 תאים), NS: לא משמעותי (מבחן t של סטודנט ערך p> 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במעקב אחר חלקיק יחיד, לצד ההיבטים התא במיקרוסקופ, ניתוח מייצג חלק ניכר של העבודה. זה פותר את האלגוריתם המשמש לביצוע שלוש משימות עיקריות: איתור, הערכה וחיבור מחדש פסגות על כל מסגרת. אבל היבט הסוגר של עבודה זו מתגורר לפרט את האלגוריתם עצמו, ייתכן שיהיה צורך להתאים עבור כל חקירה ייעודי חדש, למעשה, את הצעדים האחרונים נוספות (כגון לפענח מצבים של תנועה, אינטראקציות או stoichiometry).
עם זאת, לאחר האלגוריתם היא מפותחת, פועל זה היא פשוטה, במיוחד לאור העובדה שאנו שמים לב על שמירה על מספר פרמטרים של קלט לפחות (איור 3). זה הופך MTT מאוד חזקים וקלים ליישום. כאשר לפרט MTT, אנחנו מכוונים אך ורק לשקול מחדש את האפשרויות אנליטיים המשמשים עבור כל משימה. רצינו כדי לייעל את התהליך לאורך שני צירים מאתגרים:
- התמודדות שנינותצפיפויות גבוהות של ש תיוג מספק מידע מפורט מרחבית לטווח של הדגימה שטח פני התא. באופן אידיאלי, אחד ינסה לעקוב האוכלוסייה מולקולרית מלאה כמעט בו זמנית, על מנת לקבל תצפית מקיפה. עם זאת, תיוג ממצה כזו תביא תמונה דומה לזה שהושג על ידי immunofluorescence קלאסי, ללא החלטה מולקולה בודדת, שכן כל תוויות מאוד חופפים עקב עקיפה. מכירה מספר מולקולרי טיפוסי (כלומר ~~~HEAD=NNS 10 5 רצפטורים של תא 30) וגודל התא (כלומר ~~~HEAD=NNS 30 מיקרומטר), אם נניח התפלגות אחידה, המרחק הממוצע בין מולקולה הוא ~ 100 ננומטר. דיפוזיה במהלך הרכישה תורמת גם להפיץ את כוחות הביטחון הפלסטינים במידה דומה: בדרך כלל ~ 100 ננומטר עבור התנועה הבראונית על 0.1 מיקרומטר 2 / ים במשך 30 אלפיות שנייה. ראוי לציין, זה מתפשט הוא איזוטרופיים בממוצע ולכן עדיין מייצר גאוס, כמו כוחות הביטחון הפלסטינים. לפיכך עד 10% מהאוכלוסייה ניתן היה לזהות באופן תיאורטי, שכן זה היה לאהd המרחק הממוצע של ~ 300 ננומטר, תואם גבולות עקיפה ותנועה. עם זאת, זה צריך להיות מווסתת על ידי החשבונאי הומגניות החלוקה המרחבית, תיוג מגבלות (כגון אילוצים סטרית, נגישות epitope וכו '), הגברת ואפילו לא ניתנת לפתרון סכסוכים בשל מסלולי המעבר, ויעילות איתור הכוללת. בניסוי, נוכל להגיע ומדויק לפקח חלק ניכר של האוכלוסייה, עם צפיפות של ~ 1000 תוויות בתוך שדה הראייה של רוחב 80 מיקרומטר. מגבלה זו התוצאות העליונות של פשרה בין הצורך לתגליות בודדים מטרת המדידה מרחבית ממצה (ראה איור. 1C להעריך את הדגימה המרחבי של פני התא).
- טיפול יחס אות לרעש החלש ביותר האפשרי מאפשר הדמיה גם על תאורה נמוכה, אשר מועיל תאים, הכדאיות ו / או במהירות גבוהה, המספק מידע הזמני טוב יותר. עם זאת, זה מרמז על אותות נמוכים יותרלכל תמונה, בשל מספר נמוך יותר של הפוטונים שנאספו. שים לב, התזמון הקצר ביותר שניתן להשיג על ידי מצלמות EMCCD (1 MS) נראה מתאימות SNR מקובל הנמוך ביותר (20 dB) לגילוי הערכה נכונה של MTT.
תיוג ולנסי הוא נושא חוזר ונשנה במחקרים מולקולה בודדת. אכן, מידה ישירה של היחס צבע / היעד הוא מאוד מאתגר 34. עם זאת, דרך חלופית לחקור את ההטיה המשוערת הציג תיוג ערכית artefactual מורכב השוואת אמצעי עם או הקוונטים-dot תגיות (עם מספר יעדים putatively לכל צבע, גרימת crosslinking artefactual) או תגי צבע אורגניות (עם, בניגוד לעבר, מספר צבעים putatively לכל יעד, הטיית עוצמת האות בלבד הלבנת מאפיינים). אנחנו ואחרים 6,36,37 הבחינו בהתנהגות דומה בעת שימוש באפשרות הקוונטים נקודות או צבעים אורגניים (atto647N במקרה שלנו, איור. 4), במונחים של דיפוזיה המעבר בין מודה התנועה. וריאציה ערכים דיפוזיה בין שני התנאים הוא נמוך יותר מאשר הפער התא אל התא (איור 4C). זה מראה כי ולנסי תיוג, גם אם לא חד ערכי בלבד, לא השפיעו באופן משמעותי על תוצאות SPT.
הכליאה ו אינטראקציות מולקולריות
כליאה זמני או יציב יכול להתפרש את החתימה של זיקה מועדף או אינטראקציה 24-29. Biomembranes אכן הומוגניות מאוד, עם מכלולים המקומיים המוכתבים על ידי תכונות מבניות כגון hydrophobicity, גודל הטרנסממברני ומתח interfacial. אלה הכוחות המניעים להוביל שיפוץ spatiotemporal של מכלולים תפקודיים בעלי תפקידים קריטיים עבור כלומר איתות, הדבקה או סחר. מיפוי וכימות אירועים כאלה צפוי לספק מפתח לפענח איך התא משלב גירויים שהוצגו ברציפות. ואכן, עבור התא, מציג עיבוד מספקת דרך דרושה תשובה מדויקתuires כוונון אינטראקציות בין בני זוג איתות סביבתם. קולטני קרום יכול לתקשר גם עם הגדרות cytoskeleton משנה הממברנה, מבנים קרום כגון בורות endocytic או הידבקויות מוקד, או גם שותפים proteic / שומנים בדם, המעורבים איתות תחומים למשל. בייצוג שלנו, אירועים כאלה ניתן לחקור באמצעות כוח הכליאה והווריאציות שלה על פני מרחב וזמן. זה מחזק עוד יותר את החשיבות של עובד ברזולוציה הגבוהה ביותר במרחב בזמן השגה, תוך התחשבות באילוצים הקשורים תזמונים קצרים צפיפות גבוהה, כאמור לעיל.
משלימים טכניקות
זה מומלץ להשוות מדידות דינמיות כאלה עם גישות אחרות. עבור אחרים, למשל טכניקות דינמיות מיקרוסקופיה, כמו FRAP ו FCS, מספקים רגישות משלימה ברזולוציה 4,38,39. FRAP מספק מדידה אנסמבל של דיפוזיה מולקולרית, בעוד FCS יכול להגיע sIngle מולקולה רגישות, עם רזולוציה זמן טוב מאוד. עם זאת, שתי השיטות מוגבלים מטבעם למדוד מקומית (בדרך כלל תוך המקום confocal). זה הניע אותנו לנצל ולדחוף את גבולות האפשרויות המרחביים של SPT: חקירת שדה גדול של תצוגה, כדי להקיף את התא כולו בבת אחת, יחד עם דיוק spatiotemporal רלוונטי באופן מקומי.
התפתחויות נוספות וחקירות
על פי מגוון של שאלות ביולוגיות ניתן לפנות באמצעות מולקולה בודדת מדידות, MTT ניתן להרחיב לאורך כיוונים שונים, בכל רמה: גילוי הערכה, חיבור מחדש וניתוחים נוספים. למשל, ניתן לשקול התמודדות עם האוכלוסייה יותר מולקולרית, קורא לגילוי ססגוניות - כפי שניתן לבצע באמצעות שיטות אופטיות או אנליטית ייעודיים. הערכה יכולה לכלול מתארי הרלוונטיים חדשים, כמו רוח רפאים או מידע הקיטוב או ציריתהמיקום Z, להארכת העתקה לתוך 3D 40.
עבור חיבור מחדש, ההנחות הבראונית מהבהב ניתן לבחון מחדש באופן מלא על בעיה ספציפית. די מעניין, מולקולה בודדת מדידות שהורחבו בעשור האחרון למשטר שנקרא הננוסקופי 17,22,23. למרות MTT הוא פונה ישירות יחיד מולקולה לוקליזציה, יש חשיבות מכרעת לשקול את המקרה של מדגם קבוע, אשר מספקת פתרון בטוח לוקליזציה ממצה של האוכלוסייה מולקולרית. עם זאת, במקרה כזה, ההנחה בראונית אינו חוקי. והחלפתו על ידי טיפול מדויק מדד הננוסקופי, מוגבל רק על ידי יחס אות לרעש, הוא קריטי להשגת הפתרון הטוב ביותר ננומטריים.
במקביל להתפתחויות אלה, המבוססים על או כך, ססגוניות 3D ו / או אמצעים ממצה, לעבוד בעתיד צפוי לספק תמונה מקיפה של נתונים סטטיים ודינמיים מולקולרית. זה יהיה relev ישירההאיזון לביולוגיה מחקרים סלולריים, כגון לפענח את שיטות עדינות המסדירים איתות נוספות ו תאיים.
הורדת MTT
קוד המקור של MTT זמין כמו תוכנות קוד פתוח למחקר אקדמי. ניתן להוריד מדף האינטרנט שלנו, ב -ciml.univ mrs.fr , באמצעות ניווט לדף הקבוצה שלנו, הוא & Marguet מעבדה, אשר מספק קישור לתיאור תוכנות להורדה. יש לציין כי אנו מבקשים את שמך ואת המוסד היחיד לקבלת מידע, למשל במקרה של שיתוף פעולה נוסף או להודיע לך על שחרור עדכון חדש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
אנו מודים חברי הצוות שלנו, בלאכה MC במיוחד לקבלת סיוע טכני, כמו גם M ו-B Irla Imhof, על תמיכתם בדיונים פוריים. נתוני דפלציה וכליאה לשכפל באדיבות הטבע שיטות. פרויקט זה נתמך על ידי מענקים מוסדיים מן CNRS, INSERM ומרסיי האוניברסיטה, על ידי מענקים ספציפיים של אזור פרובנס-Alpes-Côte-d'Azur, המכון הלאומי לסרטן du, סוכנות הידיעות הלאומית דה לה משוכלל ונדיר (ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 BLAN 1214 01) & Fondation Pour la משוכלל ונדיר Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR נתמך על ידי מענק של סרטן הלאומית Ligue Contre Le.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
|||
| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
|||
| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
|||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
|||
| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
|||
| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
|||
| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
|||
References
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H.
- Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
- Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
- Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
- Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
- Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
- Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
- Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
- Saffman, P. G., Delbruck, M.
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
- Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
- Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
- Andrew, S. M.
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
- Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).
- Saxton, M. J.
- Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
- Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
- Jacobson, K., Dietrich, C.
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
- Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
- Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
- Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
- Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
- Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
- Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
- Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
- Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).
