Summary
Çoklu Hedef İzleme canlı hücrelerinin plazma membranı içinde ayrı ayrı işaretli moleküllerin izlenmesi için geliştirilen ev yapımı bir algoritma. Verimli, tespit nano ölçekli membran dinamiğini incelemek için kullanıcı dostu, kapsamlı bir araç sağlamak, yüksek yoğunluklu zaman içinde moleküller tahmin ve izleme.
Abstract
Amacımız farklı biyolojik fonksiyonları hücre zarının meydana gelen moleküler süreçlerin kapsamlı bir açıklaması elde etmektir. Çoklu Hedef İzleme (MTT) 1: Biz yüksek yoğunlukta Tek Parçacık Takibi (SPT) adanmış analitik araçları geliştirerek, tek-molekül düzeyinde karmaşık organizasyon ve plazma zarı dinamikleri karakterize hedefliyoruz. Milisaniye ve nanometrik 1-11 çözünürlük sunan tek-molekül videomicroscopy, doğru, hücre reseptörlerine lokalizasyonu, mobilite, tutuklama veya etkileşimleri gibi tanımlayıcılar eşleyerek membran organizasyonu 12-14 ayrıntılı bir temsilini sağlar.
Biz hem deneysel hem de algoritmik, SPT gözden. Deneysel açıdan moleküler dinamik dinamik bir anlık sağlamak için, mümkün olan en yüksek etiketleme yoğunluğu ulaşan özel bir vurgu ile, kurulum ve hücre etiketleme optimize dahilHepsi bu zarının içinde oluşur. Tepe algılama, tahmin ve yeniden bağlanma, görüntü analiz 15,16 belirli araçları tarafından ele: Algoritmik sorunları yörüngeleri yeniden inşası için kullanılan her adımı ilgili. Algılama sonra deflasyon Uygulama tahlisiye zirveleri başlangıçta komşu, güçlü zirveleri tarafından gizli sağlar. Not olarak, algılama geliştirerek doğrudan yörüngeleri içindeki boşlukları azaltarak, yeniden bağlanma etkiler. Performans genellikle yüksek zamanmekansal çözünürlükte paralel ölçümleri için iki büyük sınırlama temsil eden çeşitli etiketleme yoğunluğu ve gürültü değerleri, Monte-Carlo simülasyonları kullanılarak değerlendirilmiştir.
Photoswitching veya non-lineer optik on / off ya arda kullanarak, tek moleküllerin için elde edilen nanometrik doğruluk 17, ayrıntılı gözlemler sunabilirsiniz. Bu tür 17 STORM 18, PALM 19,20, 21 ya da RESOLFT 22,23 STED, WHI olarak nanoscopy yöntemlerin temelich genellikle görüntüleme sabit örnekleri gerektirebilir. Merkezi görevi tek moleküllerin kaynaklanan kırınım-sınırlı pik tespit ve tahmin edilmesidir. Bu yüzden böyle Brown hareketi yerine sürekli bir pozisyon hassasiyetini ele almak gibi yeterli varsayımlar sağlayarak, MTT ve sade bir dille Ortaölçek analizleri için uygundur. Dahası, MTT temelde herhangi bir ölçekte kullanılabilir: moleküller için değil, aynı zamanda hücreleri veya hayvanlar için değil, sadece örnek olarak sayılabilir. Bu nedenle, MTT, moleküler ve hücresel ölçeklerde uygulamaları bulur güçlü bir izleme algoritması olduğunu.
Protocol
Bu videoda, belirli bir membran reseptör hedefleyen kuantum noktaları kullanarak, tam bir tek parçacık izleme deneyi sunuyoruz. Bu deneyin temel amacı canlı hücrelerin plazma zarının içinde ölçülen moleküler difüzyon davranışları ayırt farklı tipte oluşur. Gerçekten de, membran ortaya çıkan moleküler hareketleri genellikle doğrusal olarak yönlendirilmiş veya örneğin nanodomains 26-29, içinde sınırlı kalarak Brownian difüzyon sapabilir. Biz canlı bir hücre zarı içinde meydana dinamikleri ortaya çıkan çeşitli bir anlık sağlamak için, aynı zamanda teknik olarak mümkün olduğunca çok sayıda reseptör olarak takip hedefliyoruz. Bu, nihai olarak hücre yüzey reseptörü sinyalleşme düzenleyen mekanizmalarının deşifre izin beklenmektedir.
1. Hücre Kültürü
- Hücresel örnek hazırlayın: endojen epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) 30 ifade yapışık COS-7 hücreleri kullanır. Ne zamanantibiyotik hazırlanması sırasında her zaman uygun steril teknikleri kullanarak herhangi bir gizli alt saptanabilir kirlenme var emin olmadan canlı hücreleri ile çalışıyor.
- Bunların sahip özen,% 7 CO 2 ile 37 ° C 'de, tam bir ortam (% 10 buzağı serumu ile DMEM,% 1 glutamin,% 1 HEPES ve% 1 sodyum piruvat, aşağıda özel reaktiflerin tablosu bakınız) hücre büyümesi Lab-Tek onları yayılmadan önce alt birleşmiş, üstel büyüme.
- Gün deneyden önce, 8-kuyu odaları (Lab-Tek) in / de 5.000 hücreleri yayılmış ve bir gece inkübe edin. Hücrelerin sayılması, hücre başına kuantum nokta tekrarlanabilir bir oranı böylece sabit bir hücre yoğunluğu sağlar.
2. Hücre Etiketleme
Özel bir kaplama ile kuantum noktalar hazırlayın. Kuantum-nokta yarıiletkenler oluşan floresan nanopartiküller vardır. Onlar klasik kıyasla çok parlak ve ışığa, çünkü bu nanopartiküller yüksek bir faiz sunmaktek bir molekül görüntüleme için gürültü oranı (SNR) için uygun bir sinyal başarı sağlayan floresan probların 31,32.
- Daha önce tarif edildiği gibi 21 deneyden önce, papain ile sindirim, hibridom hücre çizgisinden (mAb 108, ATCC HB-9764) gelen EGFR karşı Fab parçaları üretir.
- Konjuge biotin ile Fab, üreticinin talimatlarına (EZ-link sülfo-NHS-LC-biyotinilasyon Kiti; Thermo Scientific, Şekil 1A.) Başı olarak.
- 605 nm (hücresel otofloresans gelen parlaklık, algılama ve ayrılması için en uygun emisyon dalga boyu) streptavidin (Invitrogen) ve yayan ile fonksiyonelleştirilmiş kuantum nokta kullanın.
- Kuantum nokta çevresinde Mevcut streptavidins yanı sıra, toplama ve hücrelere ve coverslip üzere spesifik olmayan bağlanma önlemek için doyurmak üzere, (spesifik reaktiflerin tablosu) tam medyum içinde etiketleme çözeltisi hazırlayın.
- Iki ara çözümler hazırlayın:Kuantum-nokta-streptavidin biyotinile Fab ile başka biri, 20 nM her ile bir.
- Bu iki çözüm eşit hacimde bir karıştırın: kuantum nokta kompleksi: 10 nM Fab son bir çalışma konsantrasyonunu elde etmek için 1:1 oranında Fab ile kuantum noktalar karıştırın. Eşmolar bir oranı kullanılarak bir kuantum-noktalı ve bir biyotinile Fab parçası oluşan mono-fonksiyonlu kompleksleri oluşumu birleştirmektedir. Bu reseptör 33,34 çapraz bağ nedeniyle artifakı gözlemler sınırlayıcı monovalan, etiketleme yanadır.
- Agregasyonunu önlemek için dakikada 1200 dönüş bir çalkalayıcı kullanarak, 25 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Karışımı canlı hücreler üzerinde kullanıma hazırdır.
- 7% CO 2 ile 37 ° C de 5 dakika için karışımın 100 ul hücre inkübe.
- Olmayan autofluorescent görüntüleme ortamı (HBSS tampon,% 1 HEPES, özel reaktiflerin tabloya bakınız) 37 önceden ısıtılmış ° C hücreleri yıkayın
- Dikkatle un önlemek için etiket aşırı kaldırmakGerekli geniş görüntüleme ortamı, son yıkama önce en az 5 dakika gecikme ile oda sıcaklığında tipik olarak 5 kez, her iyi yıkayarak, odak dışında kuantum nokta, ilişkisiz tarafından SNR bozulmadan.
3. Optik Ayarı
Video-mikroskopi kurulum dört ana bölümden oluşmaktadır:
- Belirli bir floresan küp (FF01-457/50 uyarma, FF495-DI02 dikroik ve FF01-617/73 emisyon filtreleri, Semrock) ve yüksek sayısal açıklık (1.3 veya 1.49) yağ immersiyon 100x amacı ile bir inverted mikroskop.
- A 100 W civa lambası (termoregülasyon engel kaçınarak, bir fiber optik aracılığıyla mikroskop akuple).
- Bir 512 x 512 piksel yüksek hassasiyeti yeterli SNR ulaşmak için kamera EMCCD.
- Deney süresince 37 ° C'de biyolojik örnekler tutmak için bir kuluçka.
4. Edinme
- Izole ve iyi yayılmış hücreleri seçin. Buiyi membran moleküllerini düzlemsel hareket aramak için adapte güzel, düz lamellipodia, uzatılması yanadır.
- Iletilen ışık ve floresan hem de görünüşü ile hücresel fizyolojik durumunu değerlendirin: yoğun veziküler trafik, nekrotik ya da apoptotik işaretler, düşük otofloresans ve ortalama güçlü kuantum nokta etiketleme (genellikle hücre başına en fazla 1.000 kuantum nokta olmaması, bkz Şek. 1B, C).
- Aynı anda mümkün olduğunca çok reseptörleri izlenmesi için kritik bir yüksek etiketleme yoğunluğu seçin. Bu aslında her ikisi tarafından fizyolojik (yüzey ekspresyonu, epitop erişilebilirlik, yanal hareket) ve algoritmik parametreleri (örtüşmeyen noktadan yayılan fonksiyonları (PSF), hatta uygun algılama ve yeniden bağlanma izin vermek için, hareket nedeniyle hesap bulanıklık dikkate alınarak). Sınırlıdır
- Her hücre, önce daha fazla, hücre yönü kontrol izin veren bir aydınlık alan görüntüsü (varsa tercihen, DIC kullanarak) eldeve lamellipodia mekansal sınırları.
- Bu sözleşmeler ile bu yana, dic adlı bir alt klasörde, video-yığını (örneğin örneğin cell1.tif & cell1.stk gibi) aynı ismi kullanarak bu görüntüyü kaydet, algoritma otomatik olarak eşleşen görüntüyü bulabilirsiniz Her yığını.
- Tipik olarak 36-ms oranı, bu fotoğraf makinesi ile full frame ulaşılabilir en hızlı oranda, sürekli hücre başına 1 ila 3 videoları edinin. Ancak bir artmış duyarlılık ve / veya daha az piksel ile özel CCD kullanarak, yukarı 1-ms oranı, yüksek frekanslarda edinebilirler. Çerçeve aktarım teknolojisi kareler arasında ihmal edilebilir bir gecikme sağlar.
- Elektron çarpma geliştirme her zaman, en az 20 dB (verimli doruk tespit 1) Yukarıda, yeterli SNR, tipik olarak yaklaşık 25-30 dB tek bir molekül hassasiyeti ulaşmasını sağlamak için azami (sadece doygunluk altında, ilgili ise) olarak ayarlanmalıdır.
- Genellikle video, günah başına 300 kare eldece yörüngeleri çoğunlukla uzun yanıp sönen olayları ile sınırlı ortalama ~ 100 kare üzerinde yeniden inşa edilir. Video frekansı ve uzunluğu, örneğin daha uzun izleri gerektirebilir verilen bir ölçüsüdür için adapte edilebilir.
5.. MTT Analizi
- Matlab veya Octave verilen bir veri kümesi değerlendirmek video dosyalarını içeren dizinin yolunu seçin.
- Tam automatized analiz 1,35 başlatmak için, Matlab Octave, ya MTT23i, komut detect_reconnex23 yazın. Bu program "kullanıcı arayüzü ile, sürüm 2.3" anlamına gelir ve 2.2 önceki sürümü ile birlikte yüklenebilir. Şek olarak ilk olarak, kullanılan tüm parametreleri listeleyen bir grafik ara gösterir. 2.
6. Temsilcisi Sonuçlar
MTT otomatik olarak daha da tamamlanan tespit ve tahmin hedeflerinin izleri, teslim etmek, her kaydedici video analizgibi kapatılma algılama gibi vestigations. Bu sonuçta hücre görüntüleri (Şekil 1C & 3) üzerinden haritalama izleri sağlar.
MTT Açıklama
Çekirdek MTT analizi 3 ana görevleri (Şekil 3) çağırarak, her kare üzerinde gerçekleştirilir:
- Sürgülü iki hipotez karşılaştırıldığında arda her piksel etrafında bir alt bölge içinde bir hedef (kuantum nokta), varlığı veya yokluğunun tespiti: PSF ile varlığını ya bir sinyal, bir iki boyutlu bir Gauss pik olarak modelized veya kare başına daha az bir sahte algılama ile, yeterince düşük yanlış alarm sigortalanması bir eşik kullanarak sadece gürültü. Bu tespit bir olasılık haritası yol açar. Her yerel maksimum onun olasılık seviyesinde Yanlış Alarm (PFA) istenen Olasılık göre ayarlanmış bir minimum değer, daha yüksek olduğunu sigortalanması, varsayılan bir hedef olarak kabul edilir. Bu sınır verimli sig ayrımcılık yeterince düşük ayarlıGürültüden nals hala tespit yeterince yüksek bir olasılık verirken teorik olarak tahmin edilen optimum ulaşan 1, en iyi sahte tespitleri (varsayılan olarak 10 -6 PFA, 512 x 512 piksel görüntülerde daha az bir hata sigorta) de kaçınmak. Bir alt-bölge kullanarak şartı görüntü sınırlarının (7 x 7 piksel varsayılan pencere için 3 piksel) değerlendirilemez ima ettiğine dikkat edin.
- Gibi alt-piksel konumu ve sinyal yoğunluğu olarak ilgili parametreler, her tespit edilen hedefin, Tahmin,. Her tespit edilen hedefin, bir en-kare Gauss-Newton uyum yanındaki tespit Gauss pozisyonunu, genişliğini ve yüksekliğini tahmin etmek için yapılır. Bu özellikle boyanın alt-piksel pozisyonlar (tipik SNR değerleri ve hareketsiz veya yavaş difüzyon boyalar için 10 ila 20 nm doğruluğu, 0.1 mikron 2 / s difüzyon boyalar için ~ 100 nm kadar artan) sağlar.
- Ile yeni hedeflerin Reconnectionizleri zaten önceki çerçeve üzerine inşa. Yeni hedeflerin seti önceki izleri seti ile eşleşti. Bu amaç için, bir iz üzere her bir hedef tayin etmek için mümkün olduğunca, algılama adımda elde edilen mevcut tüm istatistiksel bilgi pozisyonu sadece, kullanılabilir, fakat, aynı zamanda yoğunluğu, genişliği, yanıp sönen ve ilişkili istatistikleri edilir. Bu nedenle, hedefler, sadece en yakın iz atanmamış: geçen izleri, yoğunluk, hız, genişlik ve yanıp sönmesi durumunda dikkate alınacaktır. Bu istatistiksel optimum yeniden bağlanma skoru sunar. Yakın komşularına karşı yeniden bağlanma kutuplama mümkün olduğunda, bu strateji, kaçınır.
Tespit zirveleri kendi tahmin veya yeniden bağlanma başarısız olursa reddedilir sonradan olabilir. Özel bir test yeni izleri önerge sunacağını yeni zirveler tespiti, işler. Bu test, daha sıkı PFA (10 -7) kullanan bir iz için bir zirve yeniden bağlamadan yana bir doğrulama o gibi fiili yorumlanabilir f alaka (bu kriter yeni zirveleri için geçerli değildir tanımı olmak üzere).
Yörünge Analizi
Olası geçici doğumdan sonraki ters yerel difüzyon 24-29 ile ilgili bir fonksiyon tarafından değerlendirilir. Bir eşik uygulamak bölüm sınırlı tanımlamak veya olmayan sağlar. Bütün izlerini üzerinden bu yineleme, biz geçici hapsetme açısından / olayları yavaşlatmak, membran dinamikleri eşleyebilirsiniz. Bu alternatif ikili veya doğumdan indeksi ayrık değerler kullanılarak temsil edilebilir.
Varsayılan olarak, MTT otomatik olarak bir metin dosyasına 8 zirve kaydetme parametrelerini, bu görevleri gerçekleştirir: kare sayısı, i ve j konum, sinyal şiddeti, yarıçapı, ofset ve videonun her karesini (7 satır grubu) ve eser (sütun) için, yanıp sönmeye . Örneklendiği gibi bu çıkış parametreleri, Matlab veya Octave fazla yani izleri veya sinyal yoğunlukları analizi için fread_data_spt alfabeyi kullanarak tekrar edilebilir Ekinde "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example komut.
Ayrıca analizler her hücrenin üzerinde izleri eşlemek için (Şekil 1C & 3) ve ilgili parametreleri (örneğin pik şiddetlerini, SNR veya yerel difüzyon değerleri gibi) için histogram dağılımını sağlamak için yol. Her dosya için, ortalama ve her parametrenin standart sapma histogramlarının bir görüntü ile birlikte, bir metin dosyasına kaydedilir. Böyle r 2 kare yer değiştirme gibi Logaritmik dağılımları, geometrik ortalama yol açar. Difüzyon katsayısı D MSD eğrisinin ilk beş puan üzerinden bir doğrusallaştırma hesaplanır. Bu değerler, hücresel reaksiyonlar veya membran organizasyonu etkileyen ilaç / enzimatik tedavilerin örneğin kinetiği için içeren bir deney genel bir bakış sağlar. MTT bir açık kaynak kodu olduğu için, bu yönü kolayca herhangi bir özel soruşturma adapte edilebilir.
599fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
Şekil 1.. MTT ile membran reseptörleri dinamikleri izlenmesi. Gibi EGFR (A) Membran bileşenleri, olan biyotinile Fab parçaları (her molekülün yaklaşık olarak doğru ölçeklendirme ile şematik çizim) ile birleştiğinde kuantum nokta ile etiketlenmiş. (B) Tipik floresan görüntüyü tek tek etiketli reseptör karşılık kırınım-sınırlı zirveleri gösteren, 36-ms pozlama süresi ile, canlı bir COS-7 hücre elde. (C) MTT analiz çıktısı hücrenin aydınlık görüntü üzerinde kaplanmış reseptörlerinin rekonstitüe yörüngeleri, görüntülenmesi.
Şekil 2. MTT giriş parametreleri. MTT23i Koşu olarak bizim daha önceki yayın 1 açıklanan tüm giriş parametreleri, adları ve varsayılan değerleri listeleyen bir grafik kullanıcı arayüzü açılır. Algoritması, uzay ve zaman parametreleri (arama pencereler, tepe çapı, maksimum difüzyon ve yanıp sönen) boyutsuz standart birimleri, piksel ve çerçeveler bulunmaktadır. Kalibrasyon çıkış sonuçlar dönüştürmek için sonradan uygulanabilir. 156 nm / pxl ve çerçeve gecikmesi: 36 ms / çerçeve 100x büyütme ile Cascade 512BFT karşılık Varsayılan değerler, piksel boyutu vardır.
Müfettişler bu beklenen maksimum difüzyon katsayısı ("Fark max") ve maksimum yanıp yok ("T kapalı") gibi birkaç kritik parametreleri, optimize gerekir. Bu iki uzay ve zaman sınırları hemen hemen belli bir deneysel durum için, diğerleri sağlam varsayılan değerlerine ayarlı yeniden ele alınması gereken tek olanlardır. Örneğin, yanlış alarm sayısını doğrudan çoğu durumda tatmin edici kare başına bir daha dolayısıyla daha az milyon piksel başına daha az bir hata sağlamak için ayarlanır. Tüm parametreler kullanıcılar analiz için kullanılan hangi ayarları daha sonra doğrulamak için izin çıktı klasöründe bir metin dosyasına kaydedilir.
s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" Şekil 3 "/>
Şekil 3. MTT analizi önemli adımlar atıldı. Floresans görüntülerin deneysel bir yığın başlayarak, zirveleri sırayla ve otomatik olarak algılandı, bir Gauss uyum ve çerçeveler üzerinden yeniden (operasyonlarının ilk aralığı, akış şeması üst kısmı) tarafından tahmin edilmektedir. Izleri daha sonuçta ilgili tanımlayıcıları (operasyonların saniye aralığında, alt kısım) ile dinamik bir haritası yol açan, örneğin olası sınırlandırıcı için analiz edilebilir.
Şekil 4. Etiketleme değerlik MTT etkilemez. Artefactual multivalan etiketleme ile getirilen olası yanıltıcı değerlendirmek için, MTT analizi yörüngeleri haritaları oluşturmak ve analiz etmek için, 2 farklı şemaları kullanarak tagged endojen EGFR izlemek için yapıldı. Protokolü açıklandığı gibi (A) Reseptör, biyotin Fab ve kuantum-dots605-streptavidin etiketlenen.Bu durumda, kuantum-noktalar ve streptavidins bir çok-değerliği tek bir boya için birçok reseptör birleştirme ile sonuçlanabilir. (B) reseptörleri doğrudan organik bir boya, Atto647N akuple Fab etiketlenmiş edildi. Bu durumda, bir Fab, dolayısıyla bir reseptörü, birden fazla boyası ile bağlanabilmektedir. (C) kare yer değiştirme (MSD) eğrisi kuantum nokta veya ATTO boyalar (sol ve sağ grafikler, sırasıyla) ile ya etiketli, her hücre için tüm izleri için hesaplanmıştır ortalama. Difüzyon katsayıları MSD (kırmızı noktalı çizgi) beş ilk puan üzerinden doğrusallaştırma tarafından hesaplanmıştır. Benzer difüzyon değerleri (merkez grafik) neden etiketleme Her düzen. Qdot: kuantum dots605 (n = 5 hücreleri), ATTO: Atto647N (n = 7 hücreleri), ns: anlamlı değildi (Student t-testi p> 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek parçacık izleme, hücre ve mikroskop yönleri yanında, analiz çalışmalarının önemli bir bölümünü temsil eder. , Tespit tahmin ve her kare üzerinde zirve reconnecting: Bu üç ana görevleri gerçekleştirmek için kullanılan algoritma giderir. Ama bu işin sonucu yönü son, ekstra adımlar (örneğin, hareket tarzları, etkileşimleri veya stokiyometri deşifre gibi) için aslında herhangi bir yeni özel soruşturma için adapte edilmesi gerekebilir algoritması kendisi, tertipleyerek bulunur.
Ancak, bir kez algoritması tam olarak biz minimum (Şekil 3) giriş parametreleri sayısı tutmayı dikkat, özellikle de, geliştirilen bu basit çalışıyor. Bu MTT çok sağlam ve uygulanması kolay hale getirir. MTT tertipleyerek, biz tamamen her görev için kullanılan analitik seçenekleri yeniden ele amaçlanmıştır. Biz iki zorlu eksen boyunca sürecini optimize etmek istedim:
- Zekâ İşlemetiketleme h yüksek yoğunlukta hücre yüzey örnekleme vadede detaylı mekansal bilgi sağlar. İdeal olan, bir kapsamlı bir gözlem elde etmek için, aynı anda neredeyse tam moleküler nüfus takip etmeye çalışırdı. Tüm etiketleri güçlü kırınımı nedeniyle üst üste beri Ancak, bu tür ayrıntılı etiketleme, tek-molekül bir çözüm olmadan, klasik immünofloresan tarafından elde edilene benzer bir görüntüye neden olur. Tipik bir molekül sayısı için (yani ~ 10 5 hücre 30 reseptörleri) ve hücre boyutunu (yani ~ 30 mikron), biz homojen dağılım varsayarsak, ortalama arası molekülü mesafe ~ 100 nm. 30 ms sırasında genelde ~ 0,1 mikron 2 / s Brown hareketi için 100 nm: edinimi sırasında Difüzyon da karşılaştırılabilir ölçüde PSF yayılmasına katkıda bulunmaktadır. Kayda Değer, bu yayılan ortalama izotropik ve böylece hala bir Gauss benzeri PSF üretir. Bu lea zira Dolayısıyla nüfusun% 10'a kadar teorik, sezilebilirkırınım ve hareket limitleri ile uyumlu ~ 300 nm, ortalama mesafe d. Ancak, bu, (örneğin sterik kısıtlamalar, epitop erişilebilirlik, vb gibi) sınırlamalar etiketleme artan ve geçen yörüngeleri ve genel algılama verimliliği nedeniyle bile çözülemeyen çatışmalar, mekansal dağılımı homojen için muhasebe tarafından modüle olması gerekir. 80 mikron genişliğinde bir görüş alanı içinde ~ 1000 etiket yoğunlukları ile, genel nüfusun önemli bir kısmını deneysel, biz ulaşabilir ve doğru bir şekilde izleyebilir. Bireysel tespitlerde ihtiyaç ve ayrıntılı bir mekansal ölçümü (bkz. Şek. 1C hücre yüzeyinde uzaysal örnekleme takdir) hedefi arasında bir uzlaşma ile bu üst limit sonuçları.
- Zayıf mümkün SNR İşleme hücreleri canlılığını ve / veya daha iyi zamansal bilgi sağlar, yüksek hızlı, az faydalıdır düşük aydınlatma, az ya da görüntüleme sağlar. Ancak, bu daha düşük sinyalleri imaToplanan fotonların daha düşük sayısı nedeniyle her resim. EMCCD kameraları (1 ms) tarafından ulaşılabilir en kısa zamanlama MTT ile uygun algılama ve tahmini için en düşük kabul edilebilir SNR (20 dB) karşılık göründüğünü unutmayın.
Değerlik Etiketleme tek bir molekül çalışmalarda tekrarlayan bir sorundur. Gerçekten de, boya / hedef oran doğrudan ölçü derece 34 zordur. Ancak, artefactual multivalan etiketleme ile getirilen olası önyargı araştırmak için alternatif bir yol kuantum nokta etiketleri (boya başına varsay çeşitli hedefleri, artefactual çapraz uyararak) veya organik boya etiketleri ile (tersine de, varsay çeşitli boyalar ile ya tedbirler karşılaştırarak oluşur Hedef başına,) sadece sinyal yoğunluğu kutuplama ve özellikleri kasar. Kuantum noktalar veya organik boyalar (bizim durumumuzda atto647N, Şek. 4) ya kullanırken Biz ve diğerleri 6,36,37 ay arasında difüzyon ve geçiş açısından, benzer davranışlar gözlemledikHareket des. İki koşullar arasında difüzyon değerleri varyasyon hücre-hücre eşitsizlik ile (Şekil 4C) göre düşüktür. Bu etiketleme değerliği, hatta katı monovalent değilse, önemli ölçüde CPT sonuçlar etkilemez göstermektedir.
Tutuklama ve Moleküler Etkileşimler
Geçici veya sabit hapsi tercihli yakınlığı veya etkileşim 24-29 imza olarak yorumlanabilir. Biyomembranlar gibi hidrofobik özellik, transmembran boyutu ve ara yüzey gerilimi gibi yapısal özellikleri tarafından dikte yerel meclislerde ile gerçekten güçlü homojen olmayan vardır. Bu itici güçler yani sinyalizasyon, yapışıklık veya ticareti için kritik rolleri ile fonksiyonel meclislerinin zamanmekansal yeniden yol. Haritalanması ve bu tür olayların rakamsal büyüklüğünü bir hücre sürekli sunulan uyaranlara nasıl entegre çözmek için bir anahtar sağlaması bekleniyor. Gerçekten de, bir hücre için, doğru bir yanıt req yoluyla yeterli bir uyum sergileyenuires sinyalizasyon ortakları ve çevreleri arasındaki etkileşimler ayarlanması. Membran reseptörleri örneğin etki sinyalizasyon dahil alt membran iskeletinin çitler gibi endositik çukurları veya fokal yapışıklıklar gibi membran yapılar, ya da proteic / lipid ortakları ile ya da etkileşime girebilir. Bizim temsili olarak, bu tür olaylar lohusalık güç ve uzay ve zaman içinde değişmeler yoluyla incelenebilir. Bu da yukarıda bahsedildiği gibi, akılda kısa zamanlara ve yüksek yoğunluğu ile ilişkili kısıtlamalar tutarak, en yüksek ulaşılabilir uzay-zaman çözünürlükte çalışmanın önemini güçlendirir.
Tamamlayıcı Teknikleri
Diğer yaklaşımlar ile bu dinamik ölçümler karşılaştırmak için iyi bir uygulamadır. Örneğin diğer dinamik mikroskopi teknikleri, FRAP ve FCS gibi tamamlayıcı hassasiyet ve çözünürlük 4,38,39 sağlar. FCS s ulaşabilirsiniz ederken FRAP, moleküler difüzyon bir topluluk ölçüm sağlarçok iyi bir zaman çözünürlüğü ile yüksek hassasiyet ocak ateşi-molekül. Ancak, her iki yöntem doğası gereği yerel bir ölçü (genellikle bir konfokal nokta içinde) kısıtlanır. Bu bize yararlanmak ve sınırları SPT mekansal olanakları itmek için motive: yerel olarak ilgili zamanmekansal doğruluğu ile birlikte, bir seferde bir hücre kapsayacak görünümü geniş bir alan araştırıyor.
Daha Gelişmeler ve Araştırmalar
Tek-molekül ölçümleri kullanılarak ele alınabilir biyolojik soruların aralığına göre MTT her düzeyde çeşitli yönleri boyunca uzatılabilir: algılama, tahmin, yeniden bağlanma ve ileri analizler. Örneğin, bir çok renkli algılama çağrısı, birden fazla moleküler nüfusu ile ilgili düşünebilirsiniz - adanmış optik veya analitik planlarından kullanılarak yapılabilir gibi. Tahmin Konuyla ilgili yeni gibi herhangi bir spektral veya polarizasyon bilgileri gibi tanıtıcı, ya da eksenel içerebilir3D 40 içine izleme uzatmak için z konumunu,.
Yeniden bağlanma için, Brownian ve yanıp sönen varsayımlar tam olarak belirli bir problem için yeniden değerlendirilebilir. İlginçtir ki, tek-molekül ölçümleri sözde Ortaölçek rejimi 17,22,23 için son on yılda uzatılmıştır. MTT doğrudan tek-molekül yerelleştirme hitap ediyor olsa da, bir molekül nüfusun kapsamlı bir yerelleştirme için güvenli bir çözüm sağlar sabit bir örnek durumunda, dikkate almak önem taşır. Bununla birlikte, böyle bir durumda, Brown varsayımı geçerlidir artık. Doğru sadece SNR sınırlı bir Ortaölçek tedbir, taşıma tarafından değiştirilmesi iyi nanometrik çözüme ulaşma açısından kritik önem taşımaktadır.
Çok renkli, 3D ve / veya kapsamlı önlemler ya göre bu tür gelişmelerin, birlikte, gelecekteki çalışmalar moleküler dinamik ve statik verileri kapsamlı bir görünümünü vermesi bekleniyor. Bu, doğrudan bir relev sahip olacakBöyle bir ilave ve hücre içi sinyal düzenleyen ince yöntemleri deşifre olarak hücre biyolojisi çalışmaları için ance.
MTT indiriliyor
MTT kaynak kodunu akademik araştırma için açık kaynak yazılım olarak kullanılabilir. Bu da, web sayfasından indirilebilir ciml.univ-mrs.fr takımımızın sayfaya geçerek, O & Marguet'e Lab, yazılım tanımı ve indirme için bir bağlantı sağlayan. Biz daha fazla işbirliği halinde örneğin, sadece bilgi için adınız ve kurum için sizden veya yeni bir sürümü ya da güncelleme hakkında bilgilendirmek için lütfen unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Onların destek ve verimli tartışmalar için, ekibimizin üyeleri, teknik yardım için özellikle MC Blache yanı sıra M Irla ve B Imhof teşekkür ederiz. Deflasyon ve lohusalık ile ilgili rakamlar Doğa Yöntemleri izniyle çoğaltılamaz. Bu proje, CNRS, İNSERM ve Marseille Üniversitesi, ve Région Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Kanser, Agence Nationale de la Recherche (belirli hibe tarafından kurumsal hibelerle desteklenmektedir ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 blan 1214 01) ve Fondation pour la Recherche medicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR Ligue Nationale Contre le Kanser bir burs ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
|||
| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
|||
| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
|||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
|||
| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
|||
| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
|||
| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
|||
References
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H.
- Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
- Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
- Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
- Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
- Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
- Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
- Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
- Saffman, P. G., Delbruck, M.
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
- Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
- Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
- Andrew, S. M.
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
- Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).
- Saxton, M. J.
- Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
- Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
- Jacobson, K., Dietrich, C.
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
- Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
- Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
- Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
- Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
- Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
- Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
- Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
- Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).
