Summary
Multiple-Target Tracing er en hjemmelaget algoritme utviklet for sporing individuelt merket molekyler i plasma membran av levende celler. Effektiv oppdage, estimering og sporing molekyler over tid ved høy tetthet gir et brukervennlig, omfattende verktøy for å undersøke nanoskala membran dynamikk.
Abstract
Vårt mål er å oppnå en omfattende beskrivelse av molekylære prosesser skjer på cellemembraner i forskjellige biologiske funksjoner. Vi tar sikte på å karakterisere kompleks organisasjon, og dynamikken i plasmamembranen ved enkelt-molekyl nivå, ved å utvikle analytiske verktøy som er spesielt Single-Particle Tracking (SPT) ved høy tetthet: Multiple-Target Tracing (MTT) 1. Single-molekyl videomicroscopy, tilbyr millisekund og nanometric oppløsning 1-11, gir en detaljert fremstilling av membran organisasjon 12-14 av nøyaktig kartlegging deskriptorer som celle reseptorer lokalisering, mobilitet, innesperring eller interaksjoner.
Vi revisited SPT, både eksperimentelt og algoritmer. Eksperimentelle aspekter inkluderte optimalisere oppsett og celle merking, med særlig vekt på å nå høyest mulig merking tetthet, for å gi en dynamisk øyeblikksbilde av molekylære dynamikk ens det skjer innenfor membranen. Algoritmiske problemer bekymret hvert trinn brukes til ombygging baner: topper deteksjon, estimering og gjenkjenning, løses ved spesifikke verktøy fra bildeanalyse 15,16. Implementering deflasjon etter påvisning lar redde topper opprinnelig skjult av nabolandene, sterkere topper. Av notatet, bedre deteksjon påvirker direkte oppkobling, ved å redusere gap innen baner. Forestillinger har blitt evaluert ved hjelp av Monte-Carlo simuleringer for ulike merking tetthet og støy verdier, som typisk representerer de to store begrensninger for parallelle målinger ved høy spatiotemporal oppløsning.
Den nanometric nøyaktighet 17 innhentet for enkle molekyler, enten ved hjelp påfølgende on / off photoswitching eller ikke-lineær optikk, kan levere grundige observasjoner. Dette er grunnlaget for nanoscopy metoder 17 som 18 STORM, PALM 19,20, RESOLFT 21 eller Sted 22,23, WHIch kan ofte kreve bildebehandlingsprogrammer faste prøver. Den sentrale oppgave er å oppdage og estimering av diffraksjon-begrensede topper kommer fra single-molekyler. Derfor gir tilstrekkelige forutsetninger for eksempel håndtering av en konstant posisjonelle nøyaktighet i stedet for Brownske bevegelser, er MTT oversiktlig egnet for nanoscopic analyser. Videre kan MTT fundamentalt brukes til enhver skala: ikke bare for molekyler, men også for celler eller dyr, for eksempel. Derfor er MTT en kraftig sporing algoritme som finner programmer på molekylære og cellulære skalaer.
Protocol
I denne videoen presenterer vi en full enkelt partikkel sporing eksperiment ved hjelp av kvante-prikker rettet mot en spesifikk membran reseptor. Hovedmålet dette eksperimentet består i diskriminerende ulike typer molekylære diffusjon atferd målt i plasma membran av levende celler. Faktisk kan molekylære bevegelser som oppstår på membranen typisk avvike fra Brownske diffusjon ved å være lineært mot eller innelukket i nanodomains 26-29, for eksempel. Vi tar sikte på samtidig å følge så mange reseptorer som teknisk mulig, for å gi et øyeblikksbilde av sorten som oppstår i dynamikken som oppstår innen membran av en levende celle. Dette er slutt forventes å tillate tyde av de mekanismene som regulerer cellens overflate reseptor signalisering.
1. Cell Culture
- Klargjør den cellulære prøven: bruk heftende COS-7 celler som endogent uttrykker epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) 30. Nårarbeider med levende celler uten antibiotika sørg for å ha noen latent sub-detekterbar forurensning ved hjelp av riktige sterile teknikker hele tiden under forberedelse.
- Grow celler i full medium (DMEM med 10% kalv serum, 1% glutamin, 1% HEPES og 1% natrium pyruvat, se tabell over spesifikke reagenser nedenfor), ved 37 ° C med 7% CO 2, ta vare å ha dem i sub-konfluent, eksponentiell vekst før spre dem i Lab-Tek.
- På dagen før forsøket, spre 5.000 celler / brønn i 8-brønn kammer (Lab-Tek) og inkuber natten. Telle celler sikrer en konstant celle tetthet, derav en reproduserbar forholdet Quantum-punkter per celle.
2. Cell Merking
Forbered Quantum-punkter med en bestemt belegg. Quantum-prikker er fluorescerende nanopartikler består av halvledere. Disse nanopartikler presentere en høy rente fordi de er veldig lyse og photostable forhold til klassiskfluorescerende prober 31,32, noe som gjør oppnåelse av en passende signal til støy-forhold (SNR) for enkelt molekyl bildebehandling.
- Før eksperimentet, produsere Fab fragmenter mot EGFR fra hybridoma cellelinje (MAB 108, ATCC HB-9764), ved fordøyelsen med papain som tidligere beskrevet 21.
- Konjugat Fab med biotin, som per produsentens instruksjoner (EZ-link sulfo-NHS-LC-biotinylation Kit, Thermo Scientific, Fig. 1a.).
- Bruk kvante-prikker functionalized med streptavidin (Invitrogen) og utslipp på 605 nm (optimal utslipp bølgelengde for glans, deteksjon og atskillelse fra mobilnettet autofluorescens).
- Klargjør merking løsningen i full medium (se tabell over spesifikke reagenser), for å mette de streptavidins stede rundt Quantum-punkter, samt å hindre aggregering og ikke-spesifikk binding til cellene og til dekkglass.
- Forbered to mellomlandinger løsninger:en med kvante-prikker-streptavidin og en annen med biotinylated Fab, hver på 20 nm.
- Bland en tilsvarende volum av disse to løsningene: blande Quantum-prikkene med Fab i forholdet 1:1 for å oppnå en endelig jobbe konsentrasjon på 10 nM Fab: Quantum-prikker kompleks. Bruke en equimolar ratio favoriserer dannelsen av mono-functionalized komplekser sammensatt av en kvante-dot og en biotinylated Fab fragment. Dette favoriserer monovalent merking, begrenser Artifact observasjoner grunn reseptor tverrbindinger 33,34.
- Inkuber i 15 minutter ved 25 ° C med en shaker med 1200 omdreininger i minuttet for å hindre aggregering. Blandingen er så klar til bruk på levende celler.
- Inkuber cellene i 100 mL av blandingen i 5 minutter ved 37 ° C med 7% CO 2.
- Vask celler med ikke-autofluorescent bildebehandling medium (HBSS buffer, 1% HEPES, se tabell over spesifikke reagenser) forvarmes ved 37 ° C.
- Fjern forsiktig overskudd av etiketter for å forhindre unnødvendig å ødelegge SNR ved ubundet, ute av fokus kvante-prikker, med mye vask hver brønn med bildebehandling medium, vanligvis 5 ganger ved romtemperatur, med minst 5 minutter før den siste vask.
3. Optisk oppsett
Videoen-mikroskopi oppsett består av fire hoveddeler:
- En invertert mikroskop med en spesifikk fluorescens kube (FF01-457/50 eksitasjon, FF495-Di02 dichroic, og FF01-617/73 utslipp filtre, Semrock) og en høy numerisk apertur (1.3 eller 1.49) olje-immersion 100x objektiv.
- En 100 W kvikksølv lampe (koblet til mikroskopet gjennom en optisk fiber, unngå å forstyrre termoregulering).
- Et 512 x 512 piksler høy følsomhet EMCCD kamera for å oppnå en tilstrekkelig SNR.
- En inkubator for å holde biologiske prøver ved 37 ° C under forsøket.
4. Oppkjøp
- Velg isolerte og godt spredning celler. Dettefavoriserer forlengelse av fin, flat lamellipodia, best tilpasset for å lete etter planar bevegelse av membran molekyler.
- Vurdere mobilnettet fysiologiske status ved sin opptreden både i overført lys og i fluorescens: intens vesikulært trafikk, fravær av nekrotisk eller apoptotisk skilt, lav autofluorescens og gjennomsnittlig sterk kvante-dot merking (typisk opp til 1000 Quantum-punkter per celle, se fig. 1B, C).
- Velg en høy merking tetthet, som er kritisk for samtidig å overvåke så mange reseptorer som mulig. Dette er faktisk begrenset både av fysiologiske (overflate uttrykk, epitop tilgjengelighet, lateral bevegelse) og algoritmiske parametre (ikke-overlappende punkt-spredning funksjoner (PSF), selv hensyntatt uskarphet på grunn av bevegelse, slik at riktig deteksjon og gjeninnkobling).
- For hver celle, først anskaffe en lysfelt felt bilde (fortrinnsvis ved hjelp av DIC, hvis tilgjengelig) som kan videre tillate sjekke for cellen aspektetog romlige grensene for lamellipodia.
- Lagre dette bildet med samme navn som video-stack (som cell1.tif & cell1.stk for eksempel), i en undermappe kalt dic, siden, med disse konvensjonene, kan algoritmen automatisk finne tilbake matchende bildet for hver bunke.
- Tilegne 1 til 3 videoer per celle, kontinuerlig, typisk ved 36-ms rate, den raskeste hastigheten som kan oppnås i fullformat med dette kameraet. Men en kan skaffe seg ved høyere frekvenser, opptil 1-ms rente, med dedikerte CCD med økt følsomhet og / eller mindre piksler. Rammen-transfer teknologi gir ubetydelig forsinkelse mellom rammer.
- Electron formere ekstrautstyr bør alltid settes til maksimum (rett under metning, hvis relevant) å tillate nå enkelt molekyl følsomhet, med en tilstrekkelig SNR, minst over 20 dB (for effektiv toppdeteksjon 1), vanligvis rundt 25-30 dB.
- Vanligvis erverve 300 rammer per video, syndce baner er bygget opp igjen ~ 100 rammer i gjennomsnitt, for det meste begrenset av lange blinkende hendelser. Video hyppighet og lengde kan tilpasses for et gitt tiltak, som kan kreve lengre spor for eksempel.
5. MTT Analyse
- Velg stien til katalogen som inneholder videofiler å vurdere et gitt datasett med Matlab eller Octave.
- Slik starter den fullt automatisert analyse 1,35, skriv kommandoen detect_reconnex23 i Octave, eller MTT23i i Matlab. Dette programmet står for "versjon 2.3, med brukergrensesnitt" og er tilgjengelig for nedlasting, sammen med den forrige versjonen 2.2. Den viser først en grafisk grensesnitt liste over alle parametre brukt, som vist i fig. 2.
6. Representative Resultater
MTT analyserer automatisk hver opptaker video, for å levere spor av påviste og estimerte mål, supplert med videre ivestigations, for eksempel innesperring deteksjon. Dette gjør slutt kartlegging spor enn celle bilder (Fig. 1C og 3).
MTT Beskrivelse
Kjernen MTT Analysen er utført over hver ramme, påkalle 3 hovedoppgaver (Fig. 3):
- Påvisning av tilstedeværelse eller fravær av et mål (kvante-dot), innenfor en glidende sub-regionen suksessivt sentrert rundt hver piksel, der to hypoteser er sammenlignet: tilstedeværelse enten av et signal, med PSF modelized som en bi-dimensjonal Gaussisk peak , eller bare støy, ved hjelp av en terskel sikrer lav nok falsk alarm, med mindre enn en falsk deteksjon per ramme. Dette fører til et kart over deteksjon sannsynlighet. Hvert lokalt maksimum regnes som en antatt mål, forsikrer at den sannsynligheten er høyere enn en minimumsverdi, angitt i henhold til ønsket Probability of False Alarm (PFA). Denne grensen er satt lavt nok til å effektivt diskriminere SIGNals fra støy, unngå på best falske deteksjoner (PFA av 10 -6 som standard, for å sikre mindre enn én feil i 512 x 512 piksler), som samtidig gir en tilstrekkelig høy sannsynlighet for deteksjon, nå teoretisk spådd optimal ett. Merk at kravet om å bruke en sub-regionen innebærer at bildet grenser (3 piksler, for en standard vindu på 7 x 7 piksler) ikke kan evalueres.
- Estimering, for hver oppdaget mål, av de relevante parametere, slik som sub-pixel posisjon og signal intensitet. For hver oppdaget målet, er en minste kvadraters Gauss-Newton passform neste utføres for å estimere posisjon, bredde og høyde oppdaget Gaussian. Dette gir særlig sub-pixel stilling fargestoff (10 til 20 nm nøyaktighet for typiske SNR verdier og immobile eller langsomt diffuserende fargestoffer, økende opp til ~ 100 nm for fargestoffer spre til 0,1 mikrometer 2 / s).
- Reconnection av de nye målene medspor allerede bygget over tidligere rammer. Settet med nye mål sammenstilles med sett av tidligere spor. For dette formålet, for å tildele hvert mål til et spor, om mulig, er all tilgjengelig statistisk informasjon innhentet fra deteksjon trinnet brukes, ikke bare stilling, men også intensitet, bredde, blinker og tilhørende statistikk. Derfor er målene ikke bare tildelt til nærmeste spor: i tilfelle av kryssende spor, intensitet, hastighet, bredde og blinkende vil bli vurdert. Dette gir statistisk optimal gjeninnkobling score. Denne strategien unngår, når det er mulig, biasing den gjeninnkobling mot de nærmeste naboene.
Oppdagede topper kan være en posteriori avvist hvis deres estimering eller gjeninnkobling mislykkes. En spesiell test håndterer påvisning av nye topper, som ville sette i gang nye spor. Denne testen bruker en strengere PFA (10 -7), ettersom koble en topp til et spor kan tolkes de facto som en validering o f sin relevans (dette kriteriet er per definisjon ikke gjeldende for nye topper).
Banen Analyse
Mulig forbigående innesperring er neste evaluert av en funksjon omvendt forhold til lokal spredning 24-29. Bruke en terskel gjør det mulig å definere innestengt eller ikke episoder. Ved gjentar disse over alle spor, kan vi kartlegge membran dynamikk, i form av forbigående innesperring / tregere hendelser. Dette kan alternativt representeres ved hjelp av enten binære eller diskrete verdier av dette innesperring indeksen.
Som standard utfører MTT automatisk disse oppgavene, sparer 8 topp parametere i en tekstfil: ramme nummer, i og j posisjon, signal intensitet, radius, offset og blunke, for hver videobildet (gruppe 7 rader) og trace (kolonne) . Disse utdataparametre kan lastes i Matlab eller Octave bruke fread_data_spt script for videre analyse dvs. spor eller signal intensiteter, som eksemplifisert i "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example script i vedlegg.
Videre analyser føre til kartlegge spor over hver celle (Fig. 1C og 3) og for å gi histogram distribusjon for relevante parametere (for eksempel peak intensitet, SNR eller lokale spredning verdier). For hver fil, gjennomsnitt og standardavvik for hver parameter lagres i en tekstfil, sammen med et bilde av histogrammene. Logaritmiske distribusjoner, slik som for firkantede forskyvninger r 2, føre til geometrisk gjennomsnitt. Spredningen koeffisient D er beregnet fra en lineær tilpasning over de fem første punktene i MSD kurven. Disse verdiene gir en oversikt over et eksperiment som involverer for eksempel kinetikk cellulære reaksjoner eller farmasøytiske / enzymatisk behandling påvirker membran organisasjon. Siden MTT er en åpen-kildekode, kan dette aspektet bli lett tilpasses alle dedikert etterforskning.
599fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Overvåking membran reseptorer dynamikk ved MTT. (A) Membran komponenter, for eksempel EGFR, er merket med Quantum-prikker koblet til biotinylated Fab fragmenter (skjematisk tegning med tilnærmet riktig skalering av hvert molekyl). (B) Typisk fluorescerende bilde ervervet fra en live COS-7 celler, med 36-ms eksponeringstid, som skildrer diffraksjon-begrenset topper tilsvarende individuelt merket reseptoren. (C) Utgang av MTT analysen viser de rekonstituerte baner av reseptorer, som er lagt på lysfelt bildet av cellen.
Figur 2. MTT inndataparametere. Kjøre MTT23i åpner en grafisk brukergrensesnitt liste over alle inndataparameterne, navn og standardverdier, som beskrevet i vår tidligere publikasjon 1. I algoritmen, rom og tid parametere (søk vinduer, topp radius, maksimalt diffusjon og blinkende) er i dimensjonsløse standard enheter, piksler og rammer. Kalibreringer kan påføres en posteriori å konvertere utgang resultater. Standardverdier, tilsvarende en Cascade 512BFT med 100x forstørrelse, er pixel størrelse: 156 nm / pxl og ramme forsinkelse: 36 ms / ramme.
Etterforskerne skal optimalisere noen kritiske parametere, slik som maksimal forventet diffusjon koeffisient ("Diff max") og maksimal blinker forsvinning ("T off"). Disse to rom og tid grensene er nesten de eneste som må revurderes etter en gitt eksperimentell tilstand, blir de andre satt til robuste standardverdier. For eksempel er antallet falske alarmer direkte satt for å sikre mindre enn én feil per million piksler, og dermed mindre enn en per ramme, noe som er tilfredsstillende i de fleste tilfeller. Alle parametere lagres i en tekstfil i output-mappen, slik at brukerne kan kontrollere etterpå hvilke innstillinger ble brukt for analyse.
s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" Figur 3 "/>
Figur 3. Store trinnene i MTT analysen. Start fra en eksperimentell stabel med fluorescens bilder, topper sekvensielt og automatisk oppdaget, anslått av en Gaussian passform og koplet om rammer (første rekke operasjoner, øvre del av flytskjemaet). Spor kan videre bli analysert for utlagde innesperring, for eksempel, til slutt fører til en dynamisk kart over relevante beskrivelser (andre rekke operasjoner, nedre del).
Figur 4. Merking valens berører ikke MTT. Å vurdere mulige skjevhet introdusert ved artefactual multivalent merking, ble MTT analyse utført for å spore endogent EGFR tagget bruke 2 ulike ordninger, til å generere og analysere kart baner. (A) reseptorer ble merket med biotinylated Fab og kvante-dots605-streptavidin, som beskrevet i protokollen.I dette tilfellet kan multi-valens av kvante-prikker og streptavidins resultere i kopling flere reseptorer for en enkelt fargestoff. (B) reseptorer ble merket med Fab direkte koblet til en organisk fargestoff, Atto647N. I dette tilfellet kan en Fab, derav en reseptor, kobles til mer enn ett fargestoff. (C) Mean square forskyvning (MSD) kurve ble beregnet for alle spor for hver celle, merket enten med kvante-dot eller Atto fargestoffer (venstre og høyre grafer, henholdsvis). Diffusion koeffisienter ble beregnet ved lineær tilpasning over de fem første punktene i MSD (rød stiplet linje). Hver ordningen med merking førte til lignende diffusjon verdier (sentral graf). Qdot: kvante-dots605 (n = 5 celler), Atto: Atto647N (n = 7 celler), ns: ikke signifikant (Student t-test p-verdi> 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I single-partikkel sporing, ved siden av cellen og mikroskopi aspekter, representerer analysen en vesentlig del av arbeidet. Dette løser algoritmen som brukes til å utføre de tre hovedoppgaver: å oppdage, estimering og koble topper over hver ramme. Men påfølgende del av dette arbeidet ligger i å utarbeide algoritmen selv, som kanskje må være tilrettelagt for eventuell ny dedikert etterforskning, i hovedsak for de siste, ekstra trinn (for eksempel tyde moduser bevegelse, interaksjoner eller støkiometri).
Men når algoritmen er fullt utviklet, kjører den er grei, spesielt siden vi betalte oppmerksomhet ved å holde antall inndataparametere på minimum (Fig. 3). Dette gjør MTT meget robust og enkel å implementere. Når utarbeide MTT, rettet vi på helt revurdere de analytiske alternativene som brukes for hver oppgave. Vi ønsket å optimalisere prosessen langs to akser utfordrende:
- Dealing viddh høye tettheter av merking gir detaljert romlig informasjon på sikt av celleoverflaten prøvetaking. Ideelt sett ville man prøve å følge en nesten komplett molekylær befolkning samtidig, for å få en helhetlig observasjon. Imidlertid ville en slik uttømmende merking føre til et bilde som ligner på det klassisk fremstilt ved immunfluorescens, uten single-molekyl oppløsning, siden alle etikettene sterkt overlapper pga diffraksjon. For typisk molekylær nummer (dvs ~ 10 5 reseptorer av celle 30) og celle størrelse (dvs. ~ 30 mikrometer), dersom vi antar homogen fordeling, er den gjennomsnittlige inter-molekylet avstand ~ 100 nm. Diffusjon under oppkjøpet bidrar også til å spre PSF til en sammenlignbar grad: typisk ~ 100 nm for Brownske bevegelser på 0,1 mikrometer 2 / S under 30 ms. Bemerkelsesverdig, er dette sprer isotropt i gjennomsnitt, og dermed fortsatt genererer en Gaussian-lignende PSF. Derfor opptil 10% av befolkningen kunne teoretisk oppdaget, ettersom dette ville lead til en gjennomsnittlig avstand på ~ 300 nm, kompatible med diffraksjon og bevegelse grenser. Imidlertid må dette være modulert av regnskap for inhomogeneity i den romlige fordelingen, merking begrensninger (som steric begrensninger, epitop tilgjengelighet, etc.), øker til og med uløselige konflikter på grunn av kryssende baner og generell deteksjon effektivitet. Eksperimentelt, kunne vi nå og nøyaktig overvåke en betydelig del av den generelle befolkningen, med tettheter på ~ 1000 etiketter innenfor et synsfelt på 80 mikrometer bredde. Dette øvre grense resultater fra et kompromiss mellom behovet for individuelle oppdagelser og målet om en uttømmende romlig måling (se fig. 1C å verdsette den romlige prøvetaking av celleoverflaten).
- Håndtering den svakeste mulig SNR tillater avbildning enten ved lav belysning, noe som er gunstig for cellene levedyktighet, og / eller ved høy hastighet, som gir bedre timelig informasjon. Men innebærer dette lavere signalerper bilde, på grunn av lavere antall innsamlede fotoner. Merk at den korteste timing oppnåelig ved EMCCD kameraer (1 ms) synes å tilsvare den laveste akseptable SNR (20 dB) for korrekt påvisning og estimering av MTT.
Merking valens er en tilbakevendende problem i ett molekyl studier. Faktisk er direkte mål av fargestoff / target ratio svært utfordrende 34. Men består en alternativ måte for å undersøke den antatte skjevhet introdusert ved artefactual multivalent merking i sammenlikne tiltak med enten kvante-dot tags (med putatively flere mål per fargestoff, indusere artefactual crosslinking) eller organiske fargestoffer tags (med på tvert, putatively flere fargestoffer per mål, biasing bare signal intensitet og bleking egenskaper). Vi og andre 6,36,37 har observert tilsvarende atferd ved bruk av enten kvante-prikker eller organiske fargestoffer (atto647N i vårt tilfelle, fig. 4), i forhold til utbredelse og overgang mellom modes av bevegelse. Variasjon i diffusjon verdier mellom de to forholdene er lavere enn celle-til-celle misforhold (Fig. 4C). Dette viser at merking valens, selv om det ikke strengt monovalent, påvirker ikke vesentlig SPT resultater.
Innesperring og molekylære interaksjoner
Forbigående eller stabilt innesperring kan tolkes som signaturen fortrinnsrett affinitet eller samspillet 24-29. Biomembranes er faktisk sterkt inhomogene, med lokale forsamlinger diktert av strukturelle funksjoner som hydrofobisitet, transmembrane størrelse og overflate spenningen. Disse drivkreftene fører til spatiotemporal ombygging av funksjonelle enheter med kritiske roller for eksempel signalering, heft eller trafficking. Kartlegging og kvantifisering av slike hendelser forventes å gi en nøkkel for å dechiffrere hvordan en celle integrerer fortløpende presentert stimuli. Faktisk, for en celle, viser en tilstrekkelig tilpasning gjennom en presis respons requires tuning samspill mellom signalanlegg partnere og deres omgivelser. Membran reseptorer kan samhandle enten med sub-membran cytoskjelett gjerder, membran strukturer som endocytic groper eller fokale adhesjon, eller også proteic / lipid partnere involvert i signalering domener for eksempel. I representasjon vår, kan slike hendelser bli undersøkt gjennom innesperring styrke og dens variasjoner over tid og rom. Dette styrker viktigheten av å arbeide på det høyeste oppnåelige plass tidsoppløsning, med tanke på begrensninger knyttet til korte timings og høye tettheter, som omtalt ovenfor.
Komplementære teknikker
Det er en god praksis å sammenligne slike dynamiske målinger med andre tilnærminger. For eksempel andre dynamiske mikroskopi-teknikker, som FRAP og FCS, gi utfyllende følsomhet og oppløsning 4,38,39. FRAP gir et ensemble måling av molekylær diffusjon, mens FCS kan nå sInglés-molekyl følsomhet, med en meget god tidsoppløsning. Imidlertid er begge metodene iboende begrenset til et lokalt tiltak (vanligvis innen en confocal spot). Dette motiverte oss til å utnytte og presse grensene de romlige mulighetene for SPT: Gransker et stort synsfelt, for å omfatte en hel celle på en gang, sammen med en lokalt relevant spatiotemporal nøyaktighet.
Ytterligere Utviklingen og Undersøkelser
Ifølge spekter av biologiske spørsmål som kan løses ved hjelp av enkelt-molekyl målinger, kan MTT forlenges langs ulike retninger, på hvert nivå: deteksjon, estimering, oppkobling og videre analyser. For eksempel kan en vurdere å håndtere mer enn en molekylær befolkning, ringer for flerfarget gjenkjenning - som kan utføres ved hjelp av dedikerte optiske eller analytisk ordninger. Beregninger kan inkludere nye relevante beskrivelser, slik som en spektral eller polarisering informasjon, eller aksialez posisjon, for å forlenge sporingen inn i 3D 40.
For omkobling, kan de Brownske og blinkende forutsetninger være fullt revurdert for et bestemt problem. Interessant nok, enkelt-molekyl målingene har blitt utvidet de siste ti årene til den såkalte nanoscopic regime 17,22,23. Selv MTT er direkte adressering single-molekyl lokalisering, er det av avgjørende betydning for å vurdere saken på en fast prøve, som gir en trygg løsning for en uttømmende lokalisering av en molekylær befolkning. Men i et slikt tilfelle, er den Brownske forutsetningen ikke lenger er gyldig. Erstatte den med nøyaktig håndtere en nanoscopic mål, kun begrenset av SNR, er avgjørende for å nå den beste nanometric oppløsning.
Langs en slik utvikling, basert på enten flerfarget, 3D og / eller uttømmende tiltak, er det videre arbeidet forventes å levere et helhetlig syn på molekylære statiske og dynamiske data. Dette vil ha en direkte relevance for cellebiologi studier, som forklaring på de subtile modaliteter regulerer ekstra og intracellulær signalering.
Nedlasting MTT
Kildekoden til MTT er tilgjengelig som åpen kildekode programvare for akademisk forskning. Den kan lastes ned fra vår nettside, ved ciml.univ-mrs.fr , ved å navigere til vår lagets side, Han & Marguet Lab, som gir en kobling for programvare beskrivelse og nedlasting. Vær oppmerksom på at vi ber deg om ditt navn og institusjon bare for informasjon, for eksempel i tilfelle ytterligere samarbeid eller for å informere deg om en ny utgivelse eller oppdatering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker medlemmene av teamet vårt, særlig MC Blaché for teknisk assistanse, samt M Irla og B Imhof, for deres støtte og fruktbare diskusjoner. Tall for deflasjon og innesperring reprodusert courtesy of Nature Methods. Dette prosjektet er støttet av institusjonelle tilskudd fra CNRS og INSERM og Marseille universitet, og ved spesielle tilskudd fra regionen Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, 2010 ANR BLAN 1214 01) og Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR er støttet av et fellesskap fra Ligue Nationale Contre le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
|||
| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
|||
| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
|||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
|||
| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
|||
| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
|||
| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
|||
References
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H.
- Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
- Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
- Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
- Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
- Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
- Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
- Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
- Saffman, P. G., Delbruck, M.
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
- Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
- Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
- Andrew, S. M.
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
- Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).
- Saxton, M. J.
- Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
- Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
- Jacobson, K., Dietrich, C.
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
- Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
- Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
- Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
- Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
- Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
- Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
- Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
- Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).
