Summary
Vi har optimeret en mikroindkapslingsteknik som en effektiv 3D-platform for udbredelse og differentiering af embryonale stamceller til endoderm og dopaminerge (DA) neuroner. Det giver også mulighed for immun-isolering af celler fra værten under transplantation. Platformen kan tilpasses til andre celletyper.
Abstract
Humane embryonale stamceller (embryonale) dukker op som et attraktivt alternativ kilde til celler substitutionsterapi, eftersom de kan ekspanderes i kultur på ubestemt tid og differentieres til alle celletyper i kroppen. Forskellige typer af biomaterialer er også blevet anvendt i stamcellekulturer at tilvejebringe et mikromiljø efterligne stamcelle niche 1-3. Sidstnævnte er vigtigt for at fremme celle-til-celle-interaktion, celleproliferation og differentiering i specifikke cellelinier såvel som væv organisering ved at tilvejebringe en tredimensional (3D) miljø 4, såsom indkapsling. Princippet om celleindkapsling involverer indfangning af levende celler inden for rammerne af semi-permeable membraner i 3D kulturer 2. Disse membraner tillader udveksling af næringsstoffer, oxygen og stimuli gennem membranerne, mens antistoffer og immunceller fra værten, der er større end kapslen porestørrelsen er udelukket 5. Her har vi på forhåndsendte en tilgang til kultur og differentiere embryonale DA neuroner i en 3D-mikromiljø hjælp alginatmikrokapsler. Vi har ændret dyrkningsbetingelser 2 for at øge rentabiliteten af indkapslet embryonale. Vi har tidligere vist, at tilsætning af p160-Rho-associeret coiled-coil-kinase (klippe) inhibitor, Y-27.632 og human føtal fibroblast-konditioneret serum udskiftning medium (HFF-CM) til 3D platformen signifikant forøget overlevelse af indkapslet embryonale hvor cellerne udtrykte endelige endoderm markørgener 1. Vi har nu brugt denne 3D-platform for udbredelsen af embryonale og effektiv differentiering til DA neuroner. Protein og genekspression analyser efter den sidste fase af DA neuronal differentiering viste en forøget ekspression af tyrosinhydroxylase (TH), en markør for DA neuroner,> 100 folds efter 2 uger. Vi antager, at vores 3D-platform ved hjælp af alginatmikrokapsler kan være nyttigt at undersøge spredningen og instrueret differentieringaf embryonale til forskellige afstamninger. Dette 3D Systemet tillader også separation af foderceller fra embryonale under processen differentiering og har også potentiale til immun-isolering under transplantation i fremtiden.
Protocol
Alle de nedenstående procedurer udføres under aseptiske inde i et klasse II biosikkerhed kabinet. Reagenser og udstyr, der anvendes, er anført i nedenstående tabeller.
1. Fremstillinq af 1,1% alginat (w / v)
- Tilsættes 0,275 g renset natriumalginat (højt glucuronsyre indhold ≥ 60%, viskositet> 200 mPa s, og endotoxin ≤ 100 EU / g) i et sterilt 50 ml rør, og der tilsættes 25 ml sterilt 0,1% gelatine-opløsning fremstillet tidligere (0,5 g gelatin/500 ml milli-Q H2O og opløst ved autoklavering).
- Vortex røret i ca 30 sekunder til delvis opløse alginat pulveret derefter placere røret på en orbital blandeapparat ved 10 x g i natten over (stuetemperatur).
- Tilsættes 2,778 ml af en 9% sterilt NaCl (4,5 g NaCI/50 ml milli-Q H2O) til 25 ml af alginat-opløsning. Vortex røret i ca 30 sekunder efterfulgt af centrifugering ved 95 x g i 5 min.
- Opbevares alginatopløsningen ved 4 °; C for kort tids opbevaring (1-2 måneder) eller ved -20 ° C for langtidsopbevaring (ca. et år).
2. Fremstillinq af CaCl2 udfældningsbad
- Opløs 14,7 g CaCl2. 2H 2 O og 2,38 g HEPES i 1 liter milli-Q H2O
- Justere pH-niveau til 7,4.
- Sterilisere opløsningen ved anvendelse af en 0,22 um filter.
- Udfældningsbad kan opbevares ved stuetemperatur (6-12 måneder).
3. Fremstillinq af afkapsler opløsning
- I 500 ml Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (D-PBS), og der tilsættes 50 ml 0,5 M EDTA og 5 ml 1 M HEPES.
- Sterilisere anvendelse af et 0,22 um filter eller autoklav ved 121 ° C i 20 min.
- Opbevares afkapsler opløsningen ved stuetemperatur (6-12 måneder).
4. Udarbejdelse af Serum Replacement (SR) Medium
- Forud for indkapsling, forberede SR mediet i forvejen, som devet i tabel specifikke reagenser og udstyr.
5. Udarbejdelse af ROCK Inhibitor (Y-27632)
- Fortyndes Y-27.632 pulver i 0,1% humant serumalbumin (HSA) i D-PBS til fremstilling af en 5 mM opløsning.
6. Fremstillinq af embryonale til indkapsling
- Præ-behandling af cellerne med dyrkning medium suppleret med 10 pM ROCK-inhibitor (RI) i to timer ved 37 ° C (beskyttet mod lys).
- Efter RI behandling vaskes cellerne med D-PBS gange og fjerne cellerne fra dyrkningspladerne enzymatisk med accutase i 10 minutter ved 37 ° C.
- Forsigtigt skrabe cellerne med pipette eller celleskraber og opsamles i et 15 ml rør. Neutraliser accutase med SR medium i forholdet 1:1.
- At fremstille en enkelt cellesuspension, filtreres neutraliserede cellerne under anvendelse af en 40 um filter og opsamles i en frisk 50 ml-centrifugerør.
- Beregn den totale antal af celler i opløsningen ved hjælp af et hæmacytometer. Centrifugeres cellesuspensionen 95 x g i 5 minutter og omhyggeligt supernatanten efterfølgende. Vask cellerne med forvarmet 0,9% NaCl. Centrifuger 95 xg i 5 minutter og kassér supernatanten.
7. Indkapsling af celler
- Der fremstilles en 1 ml sprøjte fastgøres til en blød plastslange af 14G x 2 "IV kateter. Dette anvendes til at opsuge cellesuspensionen, der skal lastes på sprøjtepumpen som vist i figur 1.
- Resuspender cellerne med forvarmet alginat-opløsning med en densitet på 1,25 millioner celler / ml alginat. Forsigtigt blandes med sprøjten, og undgå at bobler.
- Nedsat perlen generator, sprøjtepumpe og luften strømningsmåler, som vist i figur 1. Flere detaljer om disse indretninger er anført i tabel specifikke reagenser og udstyr.
- Med cellerne aspireres ind i sprøjten, kasseres plastslangen af IV kateteret og fastgøre sprøjten til indkapslingsmaskine. Sikre, at der er en 10 cm mellemrum være Tween enden af indkapslingen maskinen og opsamlingspunkt som vist i figur 1.
- Indkapsler cellerne ved at sætte sprøjtepumpe med 20 ml / time, luftstrømningshastighed på 8 l / min og et tryk på 100 kPa (størrelsen af kapsler kan ændres ved at ændre luft-strømningshastighed).
- Indsamle de indkapslede celler i en petriskål (100 x 15 mm) fyldt med 20 ml forvarmet udfældningsbad i 7 min for at stabilisere kapslerne.
- Overføre de indkapslede celler ved at suge i 50 ml centrifugerør fyldt med 20 ml 0,9% NaCl.
- Tillader kapslerne at falde til bunden af røret derefter forsigtigt supernatanten. Gentage vaskeprocessen med 0,9% NaCl.
- Resuspender de indkapslede celler i foropvarmede dyrkningsmedium suppleret med RI (10 uM), overføres til en dyrkningskolbe og inkuberet ved 37 ° C / 5% CO2.
8. Differentiering af Indkapslet embryonale til DA neuroner
ve_content "> Det indkapslede embryonale behandles med RI i 3 dage forud for differentiering.- Frø muse stromal cellelinie, PA6-celler ved en densitet på 1,0 x 10 4 per cm2 i 0,1% gelatine-overtrukne T75-kolbe og tilstand af PA6 cellerne i DA neural differentiering medium (Materialer tabel) 24 timer før differentiering.
- Overfør kapsler til et 50 ml centrifugerør og tillader dem at sætte sig i bunden af røret.
- Bortkast supernatanten og resuspender kapslerne i PA6 celle-konditioneret DA neural differentiering medium.
- Kultur den indkapslede embryonale med PA6 cellemonolaget (9 x 10 6 hESCs pr 7,5 x 10 5 PA6 celler) i 28 dage med en medierne forandring på dag 4 og hver anden dag derefter (ændrer kun halvdelen af mediet hver gang).
- Efter 3 uger i kultur med PA6 celler supplere DA neural differentiering medium med 100 ng / ml Shh og 100 ng / ml FGF8a for den resterende uger.
9. Decapsulation af Indkapslet embryonale
- Aspirer kapslerne i et 15 ml centrifugerør og tillade dem at sætte sig på bunden af røret. Så supernatanten omhyggeligt.
- Vask kapsler med D-PBS to gange. Lad kapslerne sig på bunden af røret og fjern supernatanten.
- Tilsæt 5 ml afkapsler opløsning til kapslerne. Bland suspensionen grundigt via aspiration før inkubation ved stuetemperatur i 4-5 min.
- Centrifuger decapsulated cellerne ved 95 x g i 3 minutter og kassér supernatanten.
- Vask cellepelleten med D-PBS efterfulgt af centrifugering ved 95 x g i 3 min. Gentag.
- De decapsulated Cellerne kan være yderligere dyrket som et monolag eller anvendes til nedstrøms analyse.
10. Repræsentative resultater
Diameteren af alginat mikrokapsler er 400-500 um. Antallet af celler i kapslen var estimated ved at beregne det totale antal celler divideret med det samlede antal kapsler pr løb. Derfor blev ca 5,0 x 10 4 celler pr kapsel estimeres. Fra dette, formoder vi, at det maksimale antal celler kapslen kan indeholde ca 1,0 x 10 5. Levedygtigheden af indkapslede embryonale er> 80% (figur 2) som bestemt ved hjælp af anvendelse af carboxyfluorescein diacetat succinimidly ester (CFDA) / propidiumiodid (PI)-assay. Vi har optimeret forhold embryonale indkapsling ved at sænke alginat koncentration fra 2,2% ned til 1,1%, og ved at ændre udfældningsbad fra bariumchlorid til calciumchlorid. Fra disse betingelser viste vi, at kun de celler, som blev indkapslet med 1,1% calciumalginat kan overleve, prolifererer og danner EB in vitro 1. For yderligere at optimere tilstand virkningerne af dyrkning medier og RI, blev Y-27.632 undersøgt. De data, som præsenteret i figur 2 og 3 viser, at RI prevented dissociation-induceret apoptose og vedligeholdes celleviabilitet og fremmes klyngedannelsen 1,6. Endvidere levedygtighed af indkapslede embryonale dyrket i HFF-CM + RI var betydeligt højere end andre grupper uden RI kosttilskud, men dette var ikke signifikant forskellig indkapslet embryonale dyrket i SR + RI. Tilsvarende celleproliferation ved hjælp af BrdU assay steg fra 25% til 75% som enkelte celler, udviklede i klynger (figur 3). Apoptose assay ved TUNEL afslørede, at de enkelte celler i mikrokapsler dyrket i SR medium var apoptotiske (data ikke vist), hvorimod de hentede klynger fra HFF-CM var for det meste negative for TUNEL. Til en vis grad også HFF-CM suppleret med bFGF fremmet overlevelse og proliferation af indkapslede hESCs i fravær af Y-27.632. Behandling med Y-27.632 før (2 timer) og efter indkapsling (i yderligere 4 dage) markant forøget levedygtighed, proliferation og klyngedannelse af indkapslet embryonalei 1,1% calcium alginat mikrokapsler.
Tidligere har vi demonstreret, at indkapslet embryonale held kan differentieres til definitiv endoderm 1. Her har vi undersøgt anvendelsen af celleindkapsling som et 3D platform til at differentiere indkapslet embryonale i DA-neuroner. embryonale, der dannes embryoide legemer (EB) i kapslerne var direkte differentieret og decapsulation under de beskrevne betingelser viste en gradvis neuronal morfologi (fig. 4) efter 2-3 dages dyrkning med mere end 90% levedygtighed. Genekspression analyse viste en nedregulering af pluripotente markør, OCT4 medens neuroprogenitor markør Pax6 og DA neuronal markør, TH blev opreguleret efter 7 dages differentiering (fig. 5A). Immunofluorescent farvning viste, at differentieret embryonale var Pax6-positive (> 80%), men OCT4-negative på dag 7. Yderligere differentieret embryonale viste TH-positive (> 90%) neuroner efter 21 dage (figur 5B). Western blot-analyse viste også, aten opregulering af TH-ekspression fra dag 14 (figur 5C), mens Pax6-ekspression blev nedreguleret efter dag 21. Til sammenligning dyrket cellerne i todimensionale (2D) miljø under lignende betingelser (f.eks RI forbehandling i 2 timer og RI efterbehandling i 3 dage forud for differentiering) opretholdt en høj procentdel af Pax6-positive celler (> 80 %) under hele differentiering periode og ikke var så effektiv til differentiering til TH-positive celler (<60%) som i 3D miljø tilvejebragt ved indkapsling (figur 5A og C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere undersøgelser ved hjælp af musen embryonale stamceller og embryonale har vist fordelene ved 3D kultur system i biomaterialer og vævsmanipulering 2,3. Vi anvendte calciumalginatperler mikrokapsler som en egnet 3D platform til at studere embryonale formering og differentiering i sammenligning med barium alginat, idet embryonale signifikant højere levedygtighed, når indkapslet i calciumalginat end barium alginat. Denne kultur Systemet tillader også en høj densitet cellekultur og udveksling af næringsstoffer og oxygen gennem membranen 7. Spontan differentiering i kapslerne er tidligere blevet observeret, og det antages, at som udifferentierede embryonale fortsætter med at proliferere i kapslerne, cellerne med tiden ville breakout af kapslerne og form, teratom 1. En anden klinisk anvendelse af indkapsling er at tilvejebringe immunbeskyttelse af transplanterede celler fra værten modtageren. Det forventes, at transplantation af embryonale og thEIR derivater kan føre til immunologisk afstødning idet det lave niveau af ekspression af MHC klasse I-antigener af udifferentierede embryonale forøges efter differentiering 8. Det er også blevet dokumenteret, at transplantation normalt anvender højere koncentrationer af alginat for at omgå immunafstødning processen 2,9. Vores undersøgelse anvender en lavere koncentration af alginat (1,1%), som er mere egnet til in vitro-kultur og differentiering af embryonale. Det er endnu ikke fastlagt, om den lavere koncentration af alginat, vi har brugt ville ulovlig lignende immunrespons som tidligere rapporter samt opretholdelse af cellernes levedygtighed bør disse indkapslet embryonale blive transplanteret i en immunkompetent vært.
Vores optimeret indkapsling protokol til indkapsling embryonale producerer kapsler størrelse på 400-500 um diameter. Kapsler som er mindre end 400 um tendens til at have færre celler, mens større kapsler (> 500 um) result en overbefolkning af celler. embryonale indkapsling kræver en enkelt celle formation, som også fremmer celleapoptose 6. Vi har vist her, at indkapslede embryonale kan overleve, proliferere og danne EB. Dette forstærkes ved præ-behandling af embryonale med RI forud for indkapsling, hvilket resulterer i> 80% embryonale være levedygtige. Således har vi etableret en model til kultur embryonale i 3D dyrkningsbetingelser, og har udvidet disse undersøgelser for rettet differentiering i DA neuroner. Selv celleindkapsling teknik er blevet bredt kendt for celledyrkning og endodermal differentiering, neural differentiering under disse betingelser er ikke blevet undersøgt grundigt 10,11. Vi har vist her, at der er en forøget ekspression af Pax6 og TH anvendelse gen og proteinekspression analyser efter 7 dage i forhold til 2D differentiering system, hvilket antyder, at 3D-miljøet fremmer bedre DA neuronal afstamning fra pluripotente tilstand. Men yderligere analyser succesh som dopamin sekretion test og transplantation analyse er forpligtet til fuldt ud at karakterisere de differentierede celler. Generering af robuste funktionelle DA neuroner effektivt er et væsentligt krav, hvis celleterapi til Parkinsons sygdom er at blive en realitet. Vores 3D-platform, som foreslået om co-dyrkning med DA neurale inducerende celler, PA6 celler og high-density cellekultur systemet med DA neuronal differentieret embryonale via indkapsling er en indsats i den retning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af NHMRC Program Grant # 568.969 (PSS) og Faculty of Medicine, University of New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. Orive, G. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
