Summary
Nós otimizamos uma técnica de microencapsulação como uma plataforma eficaz para a propagação 3D e diferenciação de células-tronco embrionárias a endoderme e (DA) dopaminérgicos neurônios. Ele também fornece uma oportunidade para imuno-isolamento de células do hospedeiro durante o transplante. Esta plataforma pode ser adaptado para outros tipos de células.
Abstract
Células estaminais embrionárias (hESC) estão a emergir como uma fonte alternativa atraente para a terapia de substituição de células, uma vez que podem ser expandidas em cultura indefinidamente e diferenciados a quaisquer tipos de células no corpo. Vários tipos de biomateriais também têm sido utilizados em culturas de células estaminais para fornecer um microambiente imitando o nicho de células-tronco 1-3. O último é importante para a promoção da célula-célula interacção, a proliferação celular e diferenciação em linhagens específicas, bem como organização do tecido, proporcionando uma imagem tridimensional ambiente (3D) 4, tais como encapsulação. O princípio de encapsulamento de células envolve o aprisionamento de células vivas dentro dos limites de membranas semi-permeáveis em culturas 3D 2. Estas membranas permitir a troca de nutrientes de oxigénio, e os estímulos através das membranas, enquanto que os anticorpos e células do sistema imunológico do hospedeiro que são maiores do que o tamanho dos poros da cápsula são excluídos 5. Aqui, nós préenviou uma abordagem à cultura e diferenciar neurônios hESC AD em um microambiente 3D usando microcápsulas de alginato. Temos modificado as condições de cultura 2 para aumentar a viabilidade do hESC encapsulado. Nós previamente mostrado que a adição de p160-Rho-associated espiral espiralada quinase inibidor (Rock), Y-27632 e fetal humano fibroblastos condicionado médio de substituição de soro (HFF-CM) para a plataforma de 3D aumentou significativamente a viabilidade de hESC encapsulado em que as células expressavam genes marcadores definitivos endoderme 1. Verificou-se agora utilizada esta plataforma 3D para a propagação de diferenciação hESC e eficiente para os neurónios DA. Análises de expressão de proteínas e do gene após a fase final de DA diferenciação neuronal mostrou um aumento da expressão de tirosina hidroxilase (TH), um marcador para neurónios DA, acima de 100 dobras após 2 semanas. Nós a hipótese de que a nossa plataforma 3D usando microcápsulas de alginato pode ser útil para estudar a proliferação e diferenciação dirigidade hESC para várias linhagens. Este sistema de 3D também permite a separação de células alimentadoras de hESC durante o processo de diferenciação e também tem um potencial para o isolamento-imune durante o transplante no futuro.
Protocol
Todos os procedimentos abaixo são realizados usando técnicas assépticas dentro de um gabinete de Classe II Biossegurança. Reagentes e equipamentos utilizados estão listados nas tabelas abaixo.
1. Preparação de alginato de 1,1% (w / v)
- Adicionar 0,275 g de alginato de sódio purificado (alto teor de ácido glucurónico ≥ 60%, a viscosidade> 200 mPa s, e endotoxina ≤ 100 UE / g) em um tubo ml estéril 50 e adicionar 25 ml de solução 0,1% estéril gelatina preparado anteriormente (0,5 g gelatin/500 ml Milli-Q H2O e dissolvido em autoclave).
- Vórtice do tubo durante aproximadamente 30 segundos para dissolver parcialmente o pó de alginato, em seguida, colocar o tubo sobre um misturador orbital a 10 xg durante a noite (temperatura ambiente).
- Adicionar 2,778 ml de 9% de NaCl estéril (4,5 g de NaCl/50 ml Milli-Q H2O) a 25 ml de solução de alginato. O tubo de vórtice durante cerca de 30 segundos, seguido por centrifugação a 95 xg durante 5 min.
- Armazenar a solução de alginato a 4 °; C para armazenamento de curto prazo (1-2 meses) ou a -20 ° C para armazenamento a longo prazo (cerca de um ano).
2. Preparação de CaCl banho de precipitação 2
- Dissolve-se 14,7 g de CaCl2. 2H 2 O e 2,38 g de HEPES em 1 litro de água Milli-Q H2O
- Ajustar o nível de pH para 7,4.
- Esterilizar a solução utilizando um filtro de 0,22 uM.
- Banho de precipitação pode ser armazenado à temperatura ambiente (6-12 meses).
3. Preparação de Solução decapsulating
- Em 500 ml de fosfato de Dulbecco tamponado salino (D-PBS), adicionar 50 ml de EDTA 0,5 M e 5 ml de HEPES 1M.
- Esterilizar usando um filtro de 0,22 uM ou autoclave a 121 ° C durante 20 min.
- Armazenar a solução decapsulating à temperatura ambiente (6-12 meses).
4. Preparação de Soro de substituição médio (SR)
- Antes de encapsulamento, preparar médio SR com antecedência, decrito na Tabela de reagentes específicos e equipamentos.
5. Preparação de Inibidor ROCK (Y-27632)
- Diluir Y-27.632 em pó em 0,1% de albumina de soro humano (HSA) em D-PBS para fazer uma solução 5 mM.
6. Preparação de hESC para encapsulamento
- Pré-tratar as células com meio de cultura suplementado com 10 mM de inibidor ROCHA (RI), durante duas horas a 37 ° C (proteger da luz).
- Após o tratamento RI, lavar as células com D-PBS duas vezes e desalojar as células a partir de placas de cultura de enzimaticamente com accutase durante 10 min a 37 ° C.
- Raspar suavemente as células com o raspador pipeta ou célula e recolher em um tubo de 15 ml. Neutralizar o accutase com SR média na relação de 1:1.
- Para preparar uma suspensão de células individuais, filtrar as células neutralizada usando um filtro de 40 uM e recolher num fresco tubo de centrífuga de 50 ml.
- Calcular o número total de células na solução usando um hemacitómetro. Centrifugar a suspensão de células 95 xg durante 5 min e cuidadosamente descartar o sobrenadante depois. Lavar as células com pré-aquecida de NaCl 0,9%. Centrifugar 95 xg durante 5 min e descartar o sobrenadante.
7. A encapsulação de células
- Prepara-se uma seringa de 1 ml ligada a um tubo de plástico macio de 14G x 2 cateter IV ". Isto é usado para aspirar a suspensão de células a ser carregado para a bomba de seringa, como mostrado na Figura 1.
- Ressuspender as células com pré-aquecida solução de alginato a uma densidade de 1,25 milhões de células / ml de alginato. Misturar cuidadosamente com a seringa e evitar a criação de bolhas.
- Configurar o gerador de grânulo, bomba de seringa e do medidor de fluxo de ar, como mostrado na Figura 1. Mais detalhes destes dispositivos estão listados na Tabela de reagentes específicos e equipamentos.
- Com as células aspirados para dentro da seringa, descartar o tubo de plástico de cateter IV e anexar a seringa para a máquina de encapsulamento. Assegure-se que há uma distância de 10 cm ser interpolação o fim da máquina de encapsulamento e no ponto de recolha, como mostrado na Figura 1.
- Encapsular as células, definindo a bomba de seringa a taxa de fluxo 20 ml / hr, de ar a 8 L / min e uma pressão de 100 kPa (o tamanho de cápsulas pode ser alterado através da alteração da taxa de fluxo de ar).
- Recolher as células encapsuladas em uma placa de Petri (100 x 15 mm) cheia com 20 ml de pré-aquecida banho de precipitação durante 7 min para estabilizar as cápsulas.
- Transferir as células encapsuladas por aspiração suave em 50 tubos de centrífuga ml cheios com 20 ml de NaCl 0,9%.
- Permitir que as cápsulas para se adaptar à parte inferior do tubo depois suavemente descartar o sobrenadante. Repetir o processo de lavagem com NaCl 0,9%.
- Ressuspender as células encapsuladas em pré-aquecido meio de cultura suplementado com RI (10 uM), a transferência para um balão de cultura e incubadas a 37 ° C / 5% de CO 2.
8. Diferenciação de hESC Encapsulated para DA Neurônios
ve_content "> O hESC encapsulado são tratados com RI, durante 3 dias antes da diferenciação.- Semente o rato linha de células do estroma, PA6 células a uma densidade de 1,0 x 10 4 por cm 2 em 0,1% de gelatina revestido balão T75 e condição dos PA6 células em meio DA diferenciação neuronal (Tabela Materiais) 24 horas antes da diferenciação.
- Transferir as cápsulas para um tubo de centrífuga de 50 ml e permitir-lhes resolver em parte inferior do tubo.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender as cápsulas em PA6-célula meio condicionado diferenciação DA neural.
- Cultura a hESC encapsulado com a monocamada de células PA6 (9 x 10 6 hESCs por 7,5 x 10 5 PA6 células) durante 28 dias com uma mudança de mídia no dia 4 e todos os outros dias depois (alterar apenas a metade do meio de cada vez).
- Após 3 semanas em cultura com células PA6, suplementar o meio de diferenciação DA neural com 100 ng / ml SHH e 100 ng / ml FGF8a para a semana restante.
9. Decapsulation de hESC Encapsulated
- Aspirar as cápsulas para um tubo de centrífuga de 15 ml e permitir-lhes se depositam no fundo do tubo. Em seguida, descartar o sobrenadante cuidadosamente.
- Lave as cápsulas com D-PBS duas vezes. Deixar que as cápsulas se depositam no fundo do tubo, em seguida, remover o sobrenadante.
- Adicionar 5 ml de solução decapsulating para as cápsulas. Misturar a suspensão através de aspiração cuidadosamente antes da incubação à temperatura ambiente durante 4-5 min.
- Centrifugar as células Decapsulated a 95 xg durante 3 min e descartar o sobrenadante.
- Lava-se a pelete de células com D-PBS, seguido por centrifugação a 95 xg durante 3 min. Repita.
- As células podem ser ainda mais Decapsulated cultivadas como uma monocamada ou utilizadas para análise de jusante.
10. Os resultados representativos
O diâmetro das microcápsulas de alginato é iM 400-500. O número de células no interior da cápsula foi estimadoed através do cálculo do número total de células dividido pelo número total de cápsulas por execução. Portanto, aproximadamente 5,0 x 10 4 células por cápsula foi estimado. A partir desta, presumimos que o número máximo de células da cápsula pode conter é aproximadamente 1,0 x 10 5. A viabilidade das hESC encapsulado é> 80% (Figura 2), tal como determinado usando usando diacetato de carboxifluoresceína succinimidly éster (CFDA) / iodeto de propídio (PI) do ensaio. Nós otimizamos as condições de encapsulamento hESC pela diminuição da concentração de alginato de 2,2% até 1,1% e alterando o banho de precipitação a partir de cloreto de bário para cloreto de cálcio. De estas condições, mostrou que apenas as células que foram encapsuladas com alginato de cálcio 1,1% poderia sobreviver, proliferam e formar EBs in vitro 1. Para otimizar ainda mais a situação, os efeitos da mídia e cultura do RI, Y-27632 foram investigados. Os dados, apresentados na Figura 2 e 3 demonstram que prevente RId apoptose dissociação induzida e mantida a viabilidade celular e formação de cluster promovido 1,6. Além disso, a viabilidade das hESC encapsulado cultivadas em HFF-CM + RI foi significativamente mais elevada do que outros grupos sem suplementação RI, no entanto isto não foi significativamente diferente para hESC encapsulado cultivadas em SR RI +. Da mesma forma, a proliferação de células utilizando o ensaio BrdU aumentou de 25% a 75% como células individuais desenvolvidos em grupos (Figura 3). Ensaio de apoptose por TUNEL revelou que as células individuais em microcápsulas cultivadas em meio de SR foram apoptótico (dados não mostrados), enquanto que os aglomerados obtidos a partir da HFF CM-eram principalmente negativo para TUNEL. Até um certo ponto, HFF-CM suplementadas com bFGF também promoveu a sobrevivência e proliferação de hESCs encapsuladas na ausência de Y-27632. No entanto, o tratamento com Y-27632 antes (2 horas) e depois de encapsulação (por um período adicional de 4 dias) marcadamente melhorada viabilidade, proliferação e formação de aglomerados de hESC encapsuladoem microcápsulas de alginato de 1,1% de cálcio.
Anteriormente foi demonstrado que hESC encapsulado pode ser diferenciado com sucesso para endoderma definitiva 1. Aqui, nós examinamos a aplicação de encapsulamento de células como uma plataforma 3D para diferenciar hESC encapsulado em neurónios DA. hESC, que se formou corpos embrióides (EB) em cápsulas foram directa diferenciada e em decapsulation sob as condições descritas mostrou uma morfologia neuronal progressiva (Figura 4) após 2-3 dias de cultura, com mais de 90% de viabilidade. Análise de expressão gênica mostrou uma regulação do marcador pluripotentes, enquanto Oct4 marcador neuroprogenitor, PAX6 e DA marcador neuronal, TH eram up-regulada após 7 dias de diferenciação (Figura 5A). Coloração imunofluorescente revelou que hESC diferenciada foram PAX6-positivo (> 80%), mas Oct4-negativa no dia 7. HESC diferenciada adicionais mostraram TH-positivo (> 90%) neurónios após 21 dias (Figura 5B). Análise de mancha de western também mostrouuma sobre-regulação da expressão de TH dia 14 (Figura 5C), enquanto PAX6 expressão era regulada negativamente após o dia 21. Em comparação, as células cultivadas sob ambiente bidimensional (2D) sob condições semelhantes (por exemplo, RI pré-tratamento durante 2 horas e RI pós-tratamento durante 3 dias antes da diferenciação) mantida uma elevada percentagem de células positivas PAX6-(> 80 %) durante todo o período de diferenciação e não eram tão eficiente na diferenciação de células positivas para TH-(<60%) como no ambiente 3D fornecido por encapsulação (Figura 5A e C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vários estudos com células-tronco embrionárias de rato e células estaminais embrionárias humanas têm demonstrado os benefícios do sistema de cultura 3D em biomateriais e engenharia de tecidos 2,3. Utilizou-se microcápsulas de alginato de cálcio como uma plataforma adequada 3D para estudar a propagação de hESC e diferenciação em comparação com alginato de bário desde hESC mostrou maior viabilidade significativa quando encapsulados em alginato de cálcio do que alginato de bário. Este sistema de cultura também permite que uma cultura de células de alta densidade e de troca de nutrientes e de oxigénio através da membrana 7. Diferenciação espontânea dentro das cápsulas foi anteriormente observado e é assumido que, como hESC indiferenciado continuam a proliferar dentro das cápsulas, as células acabaria por rompimento das cápsulas e teratoma forma 1. Outra aplicação clínica de encapsulamento é o de proporcionar protecção imunitária das células transplantadas a partir do receptor de acolhimento. Prevê-se que o transplante de hESC e thderivados de EIE podem levar à rejeição imunológica uma vez que o baixo nível de expressão de MHC de classe I antigénios de hESC indiferenciado é aumentada após a diferenciação 8. Também tem sido documentado que o transplante geralmente utiliza concentrações mais elevadas de alginato, a fim de contornar o processo de rejeição imunitária 2,9. O nosso estudo utiliza uma menor concentração de alginato (1,1%) que é mais adequado para a cultura in vitro e diferenciação de hESC. É ainda a ser determinado se a menor concentração de alginato temos usado seria uma resposta imune semelhante ilícito como anteriormente relatórios, bem como manter a viabilidade celular, caso estes hESC encapsulado ser transplantados em um hospedeiro imunocompetente.
Nosso protocolo de encapsulamento otimizado para encapsular hESC produz cápsulas de tamanho de diâmetro mM 400-500. Cápsulas que são menores do que 400 m tendem a ter menos células enquanto cápsulas maiores (> 500 mm) result em uma superpopulação de células. encapsulamento hESC requer uma formação única célula, que também promove a apoptose de células 6. Nós mostramos aqui que hESC encapsulado pode continuar a sobreviver, proliferar e formar EB. Isto é reforçado pelo pré-tratamento da hESC com RI antes da encapsulação, resultando em> hESC 80%, sendo viável. Assim, criamos um modelo para hESC cultura em condições de cultura 3D e estenderam esses estudos para a diferenciação dirigida em neurônios de DA. Embora a técnica de encapsulação de células tem sido amplamente conhecido por cultura de células e endodermal diferenciação diferenciação, neural sob estas condições não foi estudado exaustivamente 10,11. Nós mostramos aqui que há um aumento da expressão de PAX6 e TH utilizando análises de expressão de genes e proteínas após 7 dias em comparação com o sistema de diferenciação 2D, sugerindo que o ambiente 3D promove melhor linhagem neuronal DA de estado pluripotentes. No entanto, suc análises posterioresh como teste de secreção de dopamina e doseamento transplante são necessários para caracterizar completamente as células diferenciadas. Gerando robustos neurônios funcionais DA eficiente é um requisito essencial para que a terapia celular para doença de Parkinson é se tornar uma realidade. Nossa plataforma 3D, tal como proposto sobre co-cultura com células indutoras DA neurais, PA6 células e de alta densidade do sistema de cultura de células de DA hESC neuronal diferenciada através de encapsulamento é um esforço nessa direção.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo Programa Bolsa NHMRC # 568969 (PSS) e Faculdade de Medicina da Universidade de New South Wales, Stem Iniciativa Cell (KSS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. Orive, G. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
