Summary
Biz endoderm ve dopaminerjik (DA) nöronlara yayılması ve embriyonik kök hücrelerin farklılaşması için etkili bir 3D platform olarak bir mikroenkapsülasyon tekniği optimize etmiş. Ayrıca nakli sırasında ana hücreleri bağışıklık izolasyonu için bir fırsat sağlar. Bu platform, diğer hücre türleri için adapte edilebilir.
Abstract
Süresiz kültüründe genişletilmiş ve vücutta herhangi bir hücre tiplerinin ayırt edilebilir beri İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) hücre replasman tedavisi için cazip bir alternatif kaynak olarak ortaya çıkmaktadır. Biyomateryallerin Çeşitli türleri de kök hücre niş 1-3 taklit eden bir mikro-çevre sağlamak için kök hücre kültürleri kullanılmıştır. İkinci tür kapsülleme gibi bir üç boyutlu (3B) ortamı 4 sağlayarak spesifik soyları gibi doku kuruluş içinde hücre-hücre etkileşim için-, hücre çoğalması, ve farklılaşmasını teşvik edilmesi için önemlidir. Hücre encapsulation prensibi 3D kültürleri 2 yarı geçirgen membranların sınırları içinde yaşayan hücrelerin tuzak içerir. Antikorlar ve kapsül gözenek boyutu daha büyük olan ana bilgisayardan bağışıklık hücreleri 5 dışlanır ise bu membranlar, besin, oksijen ve membranlar boyunca uyaranların değişimini sağlayacak. Burada, öncedenkültürüne bir yaklaşım gönderilen ve aljinat mikrokapsüller kullanarak 3D mikroçevresindeki hESC DA nöronları ayırt. Biz kapsüllü hESC canlılığı geliştirmek için kültür koşullarında 2 değiştirdiniz. Daha önce de göstermiştir ki, önemli ölçüde geliştirilmiş 3D platforma P160-Rho-bağlantılı sarmal-bobin kinaz (ROCK) inhibitörü, Y-27632 ve insan fetal fibroblast-şartlandırılmış serum değiştirilmesi vasatı (HFF-CM) ilavesiyle kapsüllenmiş hESC canlılığı aldığı hücreler, kesin endoderm işaretleyici gen 1 ifade etti. Şimdi DA nöronlara hESC ve verimli farklılaşma yayılması için bu 3D platformu kullandık. Protein ve gen ekspresyon analizleri DA nöronal farklılaşma son aşamasından sonra tirozin hidroksilaz artan bir ifade (TH), DA nöronlar için bir belirteç, 2 hafta sonra> 100 kıvrımlar gösterdi. Biz aljinat mikrokapsüller kullanarak bizim 3D platformu çoğalması incelemek için yararlı olabilir varsaydık ve farklılaşma yönettiÇeşitli soy için hESC arasında. Bu 3D sistemi ayrıca farklılaşma işlemi sırasında hESC gelen besleme hücrelerinin ayrılması sağlar ve aynı zamanda gelecekte transplantasyon esnasında bağışıklık-izolasyon için potansiyeli vardır.
Protocol
Aşağıdaki işlemleri her bir sınıfı II Biyogüvenlik Cabinet içindeki aseptik teknikler kullanılarak yürütülür. Reaktifler ve kullanılan ekipman aşağıdaki tablolarda listelenmektedir.
1. % 1.1 aljinat hazırlanması (w / v)
- Sodyum alginat saflaştırılmış 0,275 g ekleme (yüksek glukuronik asit içeriği ≥% 60, viskozite> 200 mPa s, endotoksin ≤ 100 AB / g), bir steril 50 ml tüp içinde ve (0.5g daha önce hazırlanmış 25 ml steril% 0.1 jelatin solüsyonu ilave gelatin/500 ml mili-Q H 2 O ve otoklav ile çözünmüş).
- Kısmen aljinat Tozun erimesi için yaklaşık 30 saniye boyunca Vortex tüp sonra gece boyunca 10 xg'de orbital karıştırıcıda tüp yeri (oda sıcaklığı).
- Aljinat çözelti 25 ml steril% 9 NaCl (NaCl/50 ml Milli-Q H2O 4.5 g) ve 2,778 ml ilave edilir. 5 dakika süreyle 95 x g'de santrifüj ile takip yaklaşık 30 saniye boyunca vorteks tüp.
- 4 de aljinat çözüm Mağaza °; Kısa vadeli depolama (1-2 ay) veya -20 ° C'de uzun süreli depolama (bir yıl) C.
2. CaCI2 Yağış Banyo hazırlanması
- Mili-Q H 2 O 1 litre CaCI2 14.7 g. 2H 2 O ve HEPES 2.38 g eritilir
- 7.4 pH seviyesini ayarlayın.
- 0.22 um bir filtreden kullanarak sterilize çözeltisi.
- Yağış banyo oda sıcaklığında (6-12 ay) saklanabilir.
3. Çözelti Decapsulating hazırlanması
- Dulbecco fosfat, 500 ml tuzlu (D-PBS) Tamponlu, 0.5 M EDTA ve 50 ml ve 1M HEPES 5 ml ilave edilir.
- 20 dakika boyunca 121 az bir 0.22 um bir filtreden ya ° C'de otoklavda kullanarak sterilize.
- Oda sıcaklığında (6-12 ay) decapsulating çözüm saklayın.
4. Serum Replacement (SR) Orta hazırlanması
- Önce kapsülleme için de olarak önceden SR orta hazırlamaközel reaktifler ve ekipman Tablo kayıtsız kalamayız.
5.. ROCK İnhibitörü hazırlanması (Y-27632)
- Insan D-PBS (HSA) serum albümin, 5 mM çözümü için% 0.1 Y-27.632 tozu sulandırınız.
6. Kapsül için hESC hazırlanması
- 37 ° C (ışıktan korumak) iki saat için ROCK inhibitörü (RI) 10 uM ile desteklenmiş kültür ortamı ile ön-muamele hücreleri.
- RI tedaviden sonra, 37 ° C'de 10 dakika süreyle accutase ile enzimatik olarak iki kez PBS ile D-hücreleri yıkanması ve kültür plakaları ile hücreleri çıkarmak
- Yavaşça pipetle veya hücre sıyırıcı ile hücreleri sıyırmak ve bir 15 ml tüp içinde toplamak. 1:1 oranında SR ortam ile nötralize accutase.
- Tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak için, bir 40 um bir filtreden kullanılarak nötralize hücreleri filtre ve yeni bir 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne toplayabilir.
- Bir hemasitometre ile çözelti içinde hücrelerin sayısını hesaplamak. Hücre süspansiyonu 5 dakika süreyle 95 x g'de santrifüje ve dikkatli bir şekilde sonradan Süpernatan atılır. Önceden ısıtılmış% 0.9 NaCI ile yıkanır hücreleri. 5 dakika süreyle 95 x g santrifüj ve süpernatant atılır.
7. Hücre Kapsülleme
- 14G x 2 "IV kateterin yumuşak bir plastik boru bağlı bir 1 ml şırınga hazırlayın. Bu Şekil 1 'de gösterildiği gibi şırınga pompası yüklenecek hücre süspansiyonu aspire için kullanılır.
- 1.250.000 hücre / ml aljinat bir yoğunlukta önceden ısıtılmış aljinat çözeltisi ile tekrar süspansiyon hücreleri. Yavaşça şırınga ile karıştırın ve hava kabarcıkları oluşturarak kaçının.
- Şekil 1 'de gösterildiği gibi boncuk jeneratörü, şırınga pompası ve hava akış ölçer ayarlayın. Bu cihazların daha fazla ayrıntı özel reaktifler ve ekipman Tablo listelenmiştir.
- Enjektöre aspire hücreleri ile, IV kateter plastik boru atmak ve kapsülleme makineye şırınga takın. 10 cm boşluk olacak olmadığından emin olun tween kapsülleme makinenin uç ve toplama merkezine Şekil 1 'de gösterildiği gibi.
- 20 ml / saat, hava akışı 8 L / dak oranı ve 100 kPa (kapsül boyutu havanın akış hızı değiştirilerek edilebilir) arasında bir basınçta şırınga pompası ayarlayarak hücreleri saklanması.
- Kapsüller stabilize etmek 7 dakika boyunca önceden ısıtılmış çöktürme banyosunda 20 ml ile doldurulmuş bir petri çanağı (100 x 15 mm) içine kapsüllenmiş hücreler toplanır.
- % 0.9 NaCl 20 ml ile dolu 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine nazik bir aspirasyon kapsüllenmiş hücreleri transfer edin.
- Kapsül tüpün dibine yerleşmesine izin yavaşça süpernatant atın. % 0.9 NaCl ile yıkama işlemi tekrarlayın.
- Bir kültür balona RI (10 uM), transfer ile desteklenmiş ve 37 ° C /% 5 CO2 inkübe önceden ısıtılmış kültür ortamı içinde kapsüllenmiş hücreleri tekrar süspansiyon.
8. DA Nöronlar için Encapsulated hESC Farklılaşma
ve_content "> kapsüllü hESC farklılaşma önce 3 gün boyunca RI ile tedavi edilirler.- Tohum fare stromal hücre hattı, 1,0 x 10 4 cm 2 başına% 0.1 jelatin kaplı T75 şişesi ve durumu 24 saat önce farklılaşma DA nöral farklılaşma orta (Malzeme Tablo) PA6 hücreler. Bir yoğunlukta PA6 hücreleri
- 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarılır ve bunların kapsüller borusunun alt kısmını çözmek için olanak sağlar.
- Süpernatant atın ve PA6 hücre klimalı DA nöral farklılaşması orta kapsül tekrar süspansiyon.
- Kültür 4. günde bir medya değişim ve her gün ile 28 gün boyunca PA6 hücre tek tabakalı (7.5 x 10 5 PA6 hücre başına 9 x 10 6 hESC) ile kapsüllü hESC sonra (orta her zaman sadece yarısı değiştirin).
- PA6 hücreleri kültürüne 3 hafta sonra, 100 ng / ml SHH ve kalan hafta için 100 ng / ml FGF8a ile DA sinir farklılaşma orta tamamlar.
9. Encapsulated hESC ve decapsulation
- Bir 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne kapsüller aspire ve tüpün altında getirilmesi için olanak sağlar. Sonra dikkatle süpernatant atın.
- Iki kez D-PBS ile kapsül yıkayın. Daha sonra süpernatan kaldırmak kapsüller borusunun alt kısmında dinlendiriniz.
- Kapsülleri 5 ml decapsulating çözüm ekleyin. 4-5 dakika için oda sıcaklığında önceden inkübasyonu ile aspirasyon yoluyla iyice süspansiyon karıştırılır.
- 3 dakika süreyle 95 x g'de santrifüje decapsulated hücreleri ve süpernatant atılır.
- 3 dakika süreyle 95 x g'de santrifüj ile takip D-PBS ile hücre peleti yıkanır. Tekrarlayın.
- Decapsulated hücreler daha bir tek tabaka olarak kültür veya alt analiz için kullanılan olabilir.
10. Temsilcisi Sonuçlar
Aljinat mikrokapsüller çapı 400-500 mikron olduğunu. Kapsül içerisinde hücre sayısı estimat idiçalıştırma başına kapsül toplam sayısı ile bölünür hücrelerin sayısı hesaplayarak ed. Bu nedenle, kapsül başına yaklaşık 5,0 x 10 4 hücre tahmin edilmiştir. Bu, biz kapsül içerebilir hücrelerin sayısı yaklaşık 1.0 x 10 5 olduğunu tahmin. Kapsüllenmiş hESC yaşayabilirliği carboxyfluorescein diasetat succinimidly ester (CFDA) / propidium iyodür (PG) testi kullanılarak kullanılarak belirlenir>% 80 (Şekil 2) gibidir. Biz% 1.1 aşağı 2,2 'den% aljinat konsantrasyonu azaltarak ve baryum klorür kalsiyum klorür yağış banyo değiştirerek hESC encapsulation koşulları optimize etmiş. Bu koşullar, biz% 1.1 kalsiyum aljinat ile kapsüllü, sadece hücrelerin hayatta kaldığını göstermektedir, çoğalmalı ve in vitro 1 EBS oluştururlar. Daha da durumun optimize etmek için, kültür ortamı ve RI etkileri, Y-27.632 incelenmiştir. Şekil 2 ve 3'te gösterildiği gibi veriler, RI prevente göstermekd ayrışma bağlı apoptoz ve hücre canlılığı ve terfi kümelenme oluşumu 1,6 sürdürdü. Ayrıca, HFF-CM + RI kültüre kapsüllü hESC canlılığı RI takviyesi olmadan diğer gruplara göre anlamlı derecede yüksek olduğu, ancak bu SR + RI kültüre kapsüllü hESC önemli ölçüde farklı değildi. Benzer şekilde, BrdU testi kullanılarak hücre çoğalması kümeler (Şekil 3) haline tek hücre olarak% 25 den% 75 e yükselmiştir. TUNEL ile Apopitoz testi HFF-CM alınan kümeleri TUNEL çoğunlukla negatif ise SR besiyerine mikrokapsüller içinde tek hücre (veriler gösterilmemiştir) apoptotik olduğunu ortaya koydu. Belli bir dereceye kadar, bFGF ile takviye HFF-CM ayrıca Y-27.632 yokluğunda hayatta kalma ve kapsüllü hESC proliferasyonu terfi. Ancak, Y-27632 ile tedavi kapsüllenmesinden önce (2 saat) ve sonrasında (ek 4 gün boyunca) belirgin gelişmiş canlılığında, çoğalmasında ve kapsüllü hESC küme oluşumu% 1.1 kalsiyum aljinat mikrokapsüller içinde.
Daha önce, kapsüllü hESC başarıyla kesin endoderm 1 ile ayırt edilebileceğini göstermiştir. Burada, DA nöronlarının içine kapsüllü hESC ayırt etmek için bir 3D platform olarak hücre encapsulation uygulamasını inceledi. kapsüller içinde embriyoid organları (EB) oluşan hESC, farklılaşmış doğrudan vardı ve belirtilen koşullarda decapsulation fazla% 90 canlılık ile kültür 2-3 gün sonra (Şekil 4) ilerleyici bir nöronal morfoloji gösterdi. Neuroprogenitor işaretleyici, PAX6 ve DA nöronal marker, TH farklılaşma 7 gün (Şekil 5A) sonra up-regüle iken gen ekspresyon analizi pluripotent marker bir yük atma, OCT4 gösterdi. Immünofloresan boyama farklılaştırılmış hESC gün 7'de PAX6-pozitif (>% 80) ama OCT4-negatif olduğu gözlendi. Ayrıca farklılaştırılmış hESC 21 gün sonra TH-pozitif (>% 90) nöronların (Şekil 5B) gösterdi. Western Blot analizi de gösterdiPAX6 ifadesi iken günde 14 TH ifade bir up-regülasyon (Şekil 5C) 21. gün sonra aşağı düzenlenir. Karşılaştırma olarak, hücre (önceden farklılaşma örneğin RI 3 gün için 2 saat ve RI post-tedavisi için ön-muamele) (> 80 PAX6-pozitif hücreleri arasında yüksek bir oranda muhafaza benzer koşullar altında (2B) iki boyutlu bir ortamda kültüre %) farklılaşma dönemi boyunca ve kapsülleme (Şekil 5A ve C) tarafından sağlanan 3D ortamında olduğu gibi TH-pozitif hücrelerin (<60%) ile ayırmada olarak etkili değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare embriyonik kök hücreleri ve hESC kullanıldığı çeşitli çalışmalar biyomalzeme ve doku mühendisliği 2,3 3D kültür sisteminin faydalarını göstermiştir. Biz baryum aljinat fazla kalsiyum aljinat kapsüllenmiş zaman hESC anlamlı düzeyde daha canlılık gösterdi beri baryum aljinat göre hESC yayılması ve farklılaşmayı çalışmak için uygun bir 3D platform olarak kalsiyum aljinat mikrokapsüller kullanılır. Bu kültür sistemi, aynı zamanda yüksek yoğunluklu bir hücre kültürü ve besin ve membran 7 boyunca oksijen değişimini sağlar. Kapsül içinde spontan farklılaşma daha önce gözlenmiştir ve bu gibi farklılaşmamış hESC kapsüller içinde çoğalmaya devam ettiği varsayılır, hücreleri kapsüller ve form teratom 1 sonunda koparma olur. Kapsülleme başka bir klinik uygulamada ana alıcıdan nakledilen hücrelerin immün koruma temin etmektir. Bu tahmin edilmektedir ki hESC ve th nakliMHC sınıf ifade düşük seviyede Ben farklılaşmamış hESC antijenlerine farklılaşma 8 sonra arttığından dolayı EIR türevleri immünolojik reddedilmesine neden olabilir. Ayrıca, genellikle nakli immün red işlemi 2,9 kaçınmak amacıyla aljinat daha yüksek konsantrasyonlar kullanmaktadır ortaya konmuştur. Bizim çalışmamızda in vitro kültür ve hESC ayrımında için daha uygundur aljinat daha düşük bir konsantrasyonda (% 1.1) kullanır. Bu tespit, henüz biz kullandık aljinat düşük konsantrasyonda daha önce raporlar yanı sıra hücre canlılığı muhafaza immünkompetan konak bu kapsüllü hESC transplant edilmesi gibi yasadışı benzer bir bağışıklık yanıtı isteyip istemediğinizi.
HESC encapsulating Bizim için optimize kapsülleme protokol 400-500 mikron çaplı kapsül boyutu üretir. 400 mikron daha küçük kapsüller daha az hücre sahip olma eğilimi ise daha büyük kapsül (> 500 mikron) resulhücrelerin bir aşırı nüfus t. hESC kapsülleme de 6 apoptoz hücre destekleyen tek bir hücre oluşumu, gerektirir. Biz kapsüllü hESC hayatta devam edebilmesi için buraya göstermiştir, çoğalırlar ve EB oluştururlar. Bu,>% 80 hESC uygulanabilir olması ile sonuçlanan, kapsülleme öncesinde RI ile hESC ön-muamele ile sağlanır. Böylece, 3D kültür koşullarında kültürü hESC bir model kurduk ve DA nöronlara yönettiği farklılaşması için bu çalışmaları artırdık. Hücre kapsülleme tekniği yaygın olarak bu şartlar altında hücre kültürü ve endodermal farklılaşma, nöral farklılaşması için iyi bilinmesine rağmen iyice 10,11 çalışılmamıştır. Biz 3D çevre pluripotent devletten daha iyi DA nöronal soy teşvik düşündüren, 2D farklılaşma sistemine göre 7 gün sonra gen ve protein ekspresyon analizi kullanarak artan bir PAX6 ifade ve TH olduğunu burada göstermiştir. Ancak, daha fazla analiz sucdopamin salgılamasına test ve tahlil nakli gibi h tamamen farklılaşmış hücre karakterize etmek gereklidir. Parkinson hastalığı için hücre tedavisi bir gerçeklik haline ise sağlam fonksiyonel DA nöronlarının oluşturuluyor verimli önemli bir şarttır. DA sinir hücreleri uyaran, PA6 hücreleri ve kapsülleme aracılığı DA nöronal farklılaşmış hESC yüksek yoğunluklu hücre kültür sistemi ile co-kültür ile ilgili önerilen Bizim 3D platformu olduğu yönünde bir çabadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Tıp NHMRC Programı Hibe # 568969 (PSS) ve Fakülte, New South Wales Üniversitesi, Kök Hücre Girişimi (KSS) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. Orive, G. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
