Summary
我々は、内胚葉とドーパミン（DA）ニューロンへの伝播および胚性幹細胞の分化のための効果的な3Dプラットフォームとしてマイクロカプセル化技術を最適化しました。また、移植時にホストからの細胞の免疫単離するための機会を提供しています。このプラットフォームは、他の細胞型に適応することができます。
Abstract
彼らは無限に培養で増殖し、身体の任意のセルのタイプに区別することができますので、ヒト胚性幹細胞（hESCの）は、細胞補充療法のための魅力的な代替供給源として浮上している。生体の様々なタイプも幹細胞のニッチ1-3模倣 微小環境を提供するために、幹細胞培養に使用されている。後者は、カプセル化などの3次元（3D）環境4を提供することにより、特定の系統だけでなく、組織の組織に細胞間相互作用、細胞増殖、分化を促進するために重要である。細胞のカプセル化の原理は、3D文化2で半透膜の範囲内で生きている細胞の捕捉が含まれます。カプセルの孔径よりも大きくなり、ホストからの抗体および免疫細胞は、5除外されているのに対し、これらの膜は、膜を横切って栄養素、酸素と刺激の交換を可能にします。ここでは、事前に文化へのアプローチを送り、アルギン酸マイクロカプセルを用いた3次元微小でhESCのDAニューロンを区別します。我々は、カプセル化されたhESCの生存率を向上させる培養条件2を変更しました。我々はこれまでに大幅にカプセル化されたhESCの生存率を高め、3DプラットフォームP160-Rhoの関連コイルドコイルキナーゼ（ROCK）阻害剤、Y-27632およびヒト胎児線維芽細胞エアコン血清代替培地（HFF-CM）を加えていることが示されているている細胞は胚体内胚葉マーカー遺伝子1を表明した。我々は今、DAニューロンへのhESCと効率的な分化の伝播のために、この3Dプラットフォームを使用している。タンパク質および遺伝子発現解析は、DA神経分化の最終段階の後にチロシン水酸化酵素の発現の増加（TH）、DAニューロンのマーカーで、2週間後> 100倍を示した。我々は、アルギン酸マイクロカプセルを使用して、我々の3Dプラットフォームは増殖を研究するために有用であるという仮説を立てたとの差別化を指示様々な系統にhESCの。この3Dシステムでは、分化の過程でのhESCからフィーダー細胞を分離することができ、また、将来的には移植時の免疫単離するための可能性を秘めています。
Protocol
以下の手順のすべてがクラスIIバイオセーフティキャビネット内無菌技術を使用して行われている。使用する試薬や機器は、以下の表に記載されています。
1。 1.1％アルギン酸（w / v）の準備
- 滅菌した50mlのチューブにアルギン酸ナトリウム（高グルクロン酸含有量≥60％、粘度> 200メガパスカル秒、エンドトキシン≤100 EU / g）を精製した0.275グラムを追加し、25 mlの滅菌0.1パーセントゼラチン溶液、事前に準備を追加（0.5グラムgelatin/500ミリリットルミリ-Q H 2 O、オートクレーブで溶解したもの）。
- 部分的にアルギン酸塩粉末を溶解するのに約30秒間ボルテックスチューブは一晩、10×gで軌道ミキサー上にチューブを置きます（室温）。
- アルギン酸塩溶液25mlの9％滅菌食塩（NaCl/50ミリリットルミリ-Q H 2 O 4.5 g）の2.778ミリリットルを追加します。 5分95×gで遠心分離し、続いて約30秒間ボルテックスチューブを。
- 4でアルギン酸塩溶液を保存°、短期記憶（1-2ヶ月）または-20℃で長期保管（年程度）のC。
2。 CaCl 2を析出槽の準備
- ミリ-Q H 2 Oの1リットルのCaCl 2の14.7グラム。2H 2 OとHEPESの2.38グラムを溶かす
- 7.4のpHレベルを調整します。
- 0.22μmのフィルターを使用してソリューションを殺菌する。
- 沈殿槽は室温（6-12ヶ月）で保存することができます。
3。カプセル化解除溶液の調製
- ダルベッコのリン酸500mlに生理食塩水（D-PBS）をバッファ、0.5M EDTA 50mlと1M HEPES、5 mlを加える。
- 20分間121℃0.22μmのフィルターまたはオートクレーブ°Cを使用して滅菌する。
- 室温（6-12ヶ月）でカプセル化解除ソリューションを保存します。
4。血清代替物（SR）培地の調製
- 前のカプセル化には、DEのように事前にSR培地を調製特定の試薬や機器の表にスクライブ。
5。 ROCK阻害剤の調製（Y-27632）
- ヒトD-PBSで（HSA）血清アルブミン5 mM溶液を作るため0.1％Y-27632の粉末を希釈する。
6。カプセル化のためのhESCの準備
- 37°C（光から保護）で2時間ROCK阻害剤（RI）の10μMを添加した培養培地で細胞を事前に扱います。
- RI処理後、37℃で10分間accutaseで酵素的に二回D-PBSで細胞を洗浄し、培養プレートから細胞を除去する
- 静かにピペットやセルスクレーパーで細胞をこすり、15 mlチューブに収集されます。 1:1の比率でSR培地でaccutaseを中和する。
- 単一細胞懸濁液を調製し、40μmのフィルターを用いて中和し、細胞をフィルタリングし、新鮮な50 mlの遠心チューブに集める。
- 血球計を使用して、ソリューション内のセルの合計数を計算します。 5分間細胞懸濁液を95×gで遠心し、慎重に、その後上清を捨てる。予め温めておいた0.9％のNaClで細胞を洗浄します。 5分95×gで遠心し、上清を捨てる。
7。細胞のカプセル化
- 14G×2 "IVカテーテルの軟質プラスチックチューブに取り付けられた1 mlの注射器を準備します。これは、図1に示すように、シリンジポンプにロードされて細胞懸濁液を吸引するために使用されます。
- 125万細胞/ mlアルギン酸塩の密度で予め温めておいたアルギン酸塩溶液で細胞を再懸濁します。静かに注射器で混ぜて泡を作成することは避けてください。
- 図1に示すように、ビーズジェネレータ、シリンジポンプとエアフローメータを設定します。これらのデバイスの詳細については、特定の試薬や機器の表に記載されています。
- シリンジに吸引し、細胞と、IVカテーテルのプラスチックチューブを廃棄し、カプセルマシンにシリンジを接続します。 10 cmの隙間ががあることを確認してください図1に示すように、カプセル化マシンとコレクションポイントの終了をトゥイーンする。
- 20ミリリットル/時間、8 L / minで、100 kPaの（カプセルのサイズは空気の流量を変えることによって変更することができます）の圧力の空気流量でシリンジポンプを設定することにより、細胞をカプセル化します。
- カプセルを安定させるための7分間予め温めておいた沈殿槽の20mlを充填したペトリ皿（100×15ミリメートル）にカプセル化された細胞を収集します。
- の0.9％NaCl 20mlを充填し50 mlの遠心チューブに穏やかな吸引によってカプセル化されたセルを転送します。
- ゆっくり、上清を捨てるカプセルがチューブの底に沈殿することができます。の0.9％NaClで洗浄プロセスを繰り返します。
- 培養フラスコにRI（10μM）、転送を補充し、37℃/ 5％CO 2でインキュベート予め温めておいた培養培地中にカプセル化された細胞を再懸濁します。
8。 DAニューロンにカプセル化されたhESCの分化
ve_content ">カプセル化されたhESCが分化する前に3日間のRIで処理される。- シードマウス間質細胞株、0.1％ゼラチンコートT75フラスコおよび条件24時間の分化前にDA神経分化培地中のPA6細胞（材料表）で1.0×1cm 2当たり10 4の密度でPA6細胞。
- 50 mlの遠心管にカプセルを転送し、それらがチューブの底に沈殿することができます。
- 上清を捨て、PA6細胞エアコンDA神経分化培地中でカプセルを懸濁します。
- その後4日目のメディアの変化と隔日で28日間培養PA6細胞単層（7.5×10 5 PA6細胞あたり9×10 6ヒトES細胞）とカプセル化のhESC（各時間は培地の半分だけを変更します）。
- PA6細胞と培養中の3週間後、残りの週に100 ng / mlのSHHおよび100 ng / mlのFGF8aでDA神経分化培地を補足するものです。
9。カプセル化されたhESCのカプセル化解除
- 15 mlの遠心管にカプセルを吸引し、それらをチューブの底に沈殿することができます。その後、慎重に上清を捨てる。
- 二回D-PBSでカプセルを洗浄します。その後、上清を除去するカプセルがチューブの底に沈殿しましょう。
- カプセルへの解決策をdecapsulating 5ミリリットルを追加します。 4から5分間室温でインキュベーションする前に吸引を介して完全に懸濁液を混ぜる。
- 3分95 xgでカプセル化が解除された細胞を遠心し、上清を捨てる。
- 3分95×gで遠心分離し、続いてD-PBSで細胞ペレットを洗浄します。繰り返します。
- カプセル化が解除された細胞はさらに、単層として培養されたまたは下流の分析に使用することができます。
10。代表的な結果
アルギン酸マイクロカプセルの直径は400から500μmである。カプセル内の細胞の数はestimatでした一回のカプセルの総数で割った細胞の総数を計算することによってED。したがって、カプセル当たり約5.0×10 4個の細胞を推定した。このことから、我々はカプセルに含めることができるセルの最大数は、約1.0×10 5であることを想定しています。カプセル化されたhESCの生存率はカルボキシフルオレセインジアセテートsuccinimidlyエステル（CFDA）/ヨウ化プロピジウム（PI）アッセイを用いて使用することにより決定> 80％（図2）のとおりです。我々は1.1％に2.2％からアルギン酸塩濃度を減少させることによってと塩化バリウムの塩化カルシウムを沈殿槽を変更することにより、hESCのカプセル化の条件を最適化しました。これらの条件から、我々は1.1％アルギン酸カルシウムでカプセル化された細胞のみが生き残ることができることを示した、増殖し、in vitroで 1 に EBを形成しています。さらに条件を最適化するために、培養媒体とRIの効果は、Y-27632を調べた。図2および3に示すように、データは、RIのpreventeを実証D解離誘導アポトーシスと細胞の生存と昇格クラスター形成1,6を維持した 。さらに、HFF-CM + RIで培養したカプセル化されたhESCの生存率は、RIの補充せずに他のグループよりも有意に高かった。しかしながら、これはSR + RIで培養されたカプセル化されたhESCに有意差はなかった。同様に、BrdUアッセイを使用して、細胞増殖は、クラスタ（図3）へと発展して、単一の細胞として25％から75％に増加した。 TUNELによるアポトーシスアッセイは、HFF-CMから取得したクラスタでは、TUNELのために主に陰性であったのに対し、SR培地で培養したマイクロカプセル内の単一の細胞（データは示さず）アポトーシスであることを明らかにした。ある程度までは、bFGFを添加したHFF-CMには、Y-27632が存在しない場合にカプセル化されたヒトES細胞の生存と増殖を促進した。しかし、Y-27632による治療カプセル化の前に（2時間）と後（追加の4日間）が著しく強化された生存率、増殖およびカプセル化されたhESCのクラスター形成1.1％アルギン酸カルシウムマイクロカプセルインチ
以前に我々は、カプセル化されたhESCのが正常胚体内胚葉1に分化させることができることを実証した。ここでは、DAニューロンにカプセル化されたのhESCを区別するために、3Dのプラットフォームとして、細胞カプセル化の応用を検討した。カプセル中の胚様体（EB）が分化した直接的、記載の条件下でカプセル化解除に形成されたhESCのは、90％以上の生存率との文化の2-3日後に進行性の神経細胞の形態（図4）を示した。 neuroprogenitorマーカー、PAX6およびDA神経マーカー、THは、分化の7日間（図5A）の後にアップレギュレートされている間の遺伝子発現解析では、多能性マーカーのダウンレギュレーション、OCT4を示した。免疫蛍光染色は、分化したhESCは、7日目にPAX6陽性（> 80％）が、OCT4陰性であったことを明らかにした。さらに分化hESCの21日後のTH陽性（> 90％）ニューロン（図5B）を示した。ウェスタンブロット解析でも示された14日からTH発現のアップレギュレーション（図5C）PAX6発現は、21日後のダウンレギュレーションであった。比較では、同様の条件下で2次元（2D）の環境下で培養した細胞（例えば、前の分化〜3日2時間RI後処理のためにRIの前処理）PAX6陽性細胞（の割合が高いの> 80を維持して％）、分化期間中およびカプセル化（図5AおよびC）が提供する3D環境のようにTH陽性細胞（<60％）に分化のように効率的ではありませんでした。
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Discussion
マウス胚性幹細胞とのhESCを使用して、いくつかの研究は、生体材料と組織工学2,3の3D培養システムの利点を実証した。我々は、アルギン酸バリウムよりもアルギン酸カルシウムでカプセル化されたときのhESCが有意に高い生存率を示したので、アルギン酸バリウムと比較してhESCの増殖と分化を研究するのに適した3Dプラットフォームとしてアルギン酸カルシウムマイクロカプセルを使用していました。この培養系は、また、膜7を越えて栄養分と酸素の高密度細胞培養と交換することができます。カプセル内で自発的な分化が以前に観察されている、それが未分化hESCのようにカプセル内で増殖し続けることが想定される、細胞がカプセルとフォーム奇形腫の1最終的にはブレイクアウトになります。カプセル化のもう一つの臨床応用は、ホストの受信者からの移植細胞の免疫防御を提供することです。それが予想されているのhESCと目の移植EIR誘導体は、未分化hESCのMHCクラスI抗原の発現の低レベル以来、免疫学的拒絶反応につながる可能性があります分化8の後に増加しています。また、移植は通常、免疫拒絶のプロセス2,9を回避するために、アルギン酸塩の高濃度を利用している文書化されています。我々の研究は、hESCのin vitroでの培養および分化に適しているアルギン酸の低濃度（1.1％）を使用します。それは我々が以前にレポートと同様に細胞の生存を維持するような違法な類似した免疫応答は、免疫のホストでこれらのカプセル化のhESCを移植しなければならないだろうを使用しているアルギン酸の低濃度かどうかまだ決定されています。
のhESCをカプセル化するための私達の最適化されたカプセル化プロトコルは、400から500μmの直径のカプセルのサイズを生成します。が400μmよりも小さいカプセルが少ない細胞を持っている傾向がある一方、大きなカプセル（> 500μM）resul細胞の過剰のt。 hESCのカプセル化は、細胞のアポトーシスを促進する6つの細胞形成を必要とします。我々は、カプセル化されたhESCのが生き残るために続けることができるここに示されて増殖し、EBを形成しています。これは> 80％のhESCが実行可能であることに、その結果、カプセル化する前に、RIとのhESCを事前に処理することによって強化されています。したがって、我々は、3Dの培養条件で培養hESCのにモデルを確立しているとDAニューロンへの分化の指示のためにこれらの研究を拡張しました。細胞のカプセル化技術が広く、これらの条件下で細胞培養と内胚葉の分化、神経分化のためによく知られているが徹底的に10,11検討されていない。我々は、3D環境では、多能性の状態からより良いDA神経系統を促進することを示唆している、2D分化システムと比較して7日後に遺伝子とタンパク質の発現解析を用いたPAX6およびTHの発現増加があることをここに示されている。しかしながら、さらなる分析が成功ドーパミン分泌のテストおよび移植アッセイとしてhは完全に分化した細胞を特徴づけるために必要とされています。パーキンソン病の細胞療法が現実になることであれば効率的に堅牢な機能のDAニューロンを生成することが不可欠の要件です。 DA神経誘導細胞、PA6細胞とカプセル化を介したDAニューロンの分化したhESCの高密度細胞培養システムとの共培養することについて提案された当社の3Dプラットフォームは、その方向に向かって努力です。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、医学のNHMRCプログラムグラント＃568969（PSS）と学部、ニューサウスウェールズ大学、幹細胞イニシアティブ（KSS）によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. Orive, G. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
