Summary
培養筋細胞は、神経支配のある筋を再現するために不十分なモデルである
Abstract
神経成分の存在下で、細胞の分化が制限されており、運動ニューロンの刺激は、1が欠落している自発的に、ためにヒト初代筋細胞は単層でaneurallyまれに契約を培養した。これらの制限は、培養筋細胞の多くの神経疾患のin vitroでの研究を妨げる。重要なのは、単層、培養筋細胞の実験的な制約は、共培養における脊髄外植片と筋線維の機能的神経支配によって克服することができます。
ここでは、Askanas 2によって開発された方法に従って、差別化と繊維の収縮を完了するには、リード、ヒト初代筋細胞の効率的、適切な神経支配を達成するために必要な様々なステップを示しています。これを行うには、筋細胞はまだ脊髄スライスに接続された後根神経節で、ED 13.5でラット胎児の脊髄外植片と共培養されています。数日後、筋肉のfibers契約を開始し、最終的には筋細胞への接続という脊髄外植片から突出した機能的な神経によって支配によって横紋になる。この構造は、単に培養液の定期的な交換によって、多くのヶ月間維持することができます。
それは人間の筋肉の発達と神経支配の学際的な分析のための機能モデルを表して、この非常に貴重なツールのアプリケーションは、たくさんあります。実際には、完全なde novoの神経筋接合部のインストールは、基本的および生理学的文脈では、各ステップで多くのパラメータを簡単に測定できるように、培養皿で発生します。
ほんの一例、ゲノムおよび/またはプロテオミクス研究を引用する共培養上で直接実行することができます。両方のコンポーネントが別の種から来るので、さらに、プリ·ポストシナプスの効果が具体的かつ個別に、神経筋接合部で評価することができ、ラットとヒトであった。神経筋の共培養はまた、筋肉や神経筋疾患3から患っている患者から単離されたヒト筋細胞で行うことができるため、候補薬剤のスクリーニングツールとして使用することができます。最後に、特別な機器が、通常のBSL2施設は、培養皿の中で機能的なモータユニットを再現する必要はありません。このメソッドは、このように、正常および疾患のコンテキストで、筋肉だけでなく、神経筋機能の生理学的および機構の研究のための神経の研究コミュニティの両方の価値があります。
Protocol
1。初代ヒト筋細胞培養の準備
- 植-RE-植技術を4に記載のヒト筋細胞の培養を確立します。最初に、生検から非筋肉組織を除去する。その後、線維芽細胞は外植片から出てくることができ、プラズマの凝塊で1 mm 3で 、筋肉の外植片を、埋め込 むことができます。
- 埋め込まれた外植片は、プラズマゼラチンコートしたディッシュに移し、それらを通常の成長培地（MEM、25％の培地199、10％ウシ胎児血清[FBS]、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、10μg/ mlのインスリンを補足に成長させてい単分子層では10 ng / mlのヒト上皮成長因子[EGF]、12.5 ng / mlのヒト線維芽細胞成長因子[FGF]）。これらの条件の下で外植片から出てくる細胞は筋肉細胞である。これらの細胞は、外植片を除去した後、単層で成長していきます。
- 文化aneurally通常の成長培地に0.1％ゼラチンコートプレート上で細胞。細胞はすることができますaneurally培養し、必要に応じて増幅した。これは、共培養を行うために3と8の間の通路で筋細胞を使用することをお勧めします。それは若い筋管を支配することが重要であり、このポイントの後、共培養は失敗のリスクが高い。さらに、筋管が大きすぎると厚すぎてはいけません。
- 神経支配が予定されている2日前、プレート、通常の増殖培地中皿当たり500,000個の細胞の密度で35mmの組織培養皿（または6ウェルプレート）の筋細胞。その密度で、細胞は次の日に核融合を開始するための適切なコンフルエントに、その後の神経支配でその翌日である。これらの条件を使用して、筋管では、最適な支配、したがって、その後の繊維の収縮のために右の段階にある。
- 次の日に、25％の培地199、5％FBS、10μg/ mlのインスリンおよびペニシリン/ストレプトマイシン、1％を添加したMEMで構成される融合培地で通常の成長培地を交換してください。
2。 Isolatiラット胚脊髄外植片の上に
脊髄外植片を分離するために全体の手順は、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むハンクス平衡塩溶液（HBSS、GIBCO / Invitrogen社REF 14170）で、双眼顕微鏡下で実行されます。
- さまざまな開発段階では全体の手順を危うくするとして、それは、ラットの胚はED 13と14の間にあることが重要です。 CO 2を妊娠女性を犠牲にしてHBSS培地中の全胚チェーンを収集します。それぞれの胚を分離し、安楽死のためにそれらを首をはねる。
- ワンピースの身体の残りの部分から胚脊髄の解剖とその周辺の筋肉や結合組織を除去します。機能的な神経支配を確保するため、脊髄に接続された後根神経節（DRGS）を保つために非常に注意してください。
- 各植は、少なくとも2 DRG（1 mm 3の外植片）それに接続が含まれている方法で、横方向に各脊髄のスライス。
- 単層上に媒体の微細な層を残して、筋肉の細胞培養に融合培地を除去します。
- 、筋細胞層の上に慎重に35mm皿あたり5つ等間隔に植片を外植片を配置します。
- 非常にゆっくりと追加し、各植に賢明な、融合培地をドロップします。それは植が最初に付着し、細胞と接触するのを許容する生き残るために筋細胞用培地を追加する必要がありますが、あまりにも多くはありません。媒体が（あまりにも強く、またはあまりにも多くのメディア）が正しく追加されていない場合、外植片をフロートされ、筋細胞を支配するために失敗します。
- 外植片が付着し始めたら、35 mmディッシュあたり2 mlに融合培地を上回ると、インキュベーターに戻す非常に慎重に皿を置く。
4。異種神経筋共培養のメンテナンス
- 週二回の融合培地を変更します。
できるだけ早く二日として支配した後は、各外植片から新興国やボタンのような構造（ 図1）で表される筋細胞との接触を確立する突起を見ることができます。
早くも支配した後4-6日として、いくつかの個々の繊維は、契約を開始します。
収縮は週二回培地を変更するだけで維持され、何ヶ月も持続する。
約2週間後、脊髄片自体が退化したが、神経支配が保存されている。これは正常です。神経成分の微細な層は、筋細胞の層の表面にとどまります。この神経ネットワークは、モータユニットの機能を維持するのに十分である。
外植片は、神経支配の翌日培地に浮遊した場合、それらが付着することはありません。筋細胞の層がある場合にこの現象が発生した十分にコンフルエント場合、またはメディアがあまりにも大まかに追加されません。時には、植付着がない突起が出現します。これはおそらくそれに接続されているDRGの欠如によるものである。その場合においても、神経支配は確立されません。外植片は、まだ簡単に切り離すことができますように、最初の週は非常に慎重に料理を操作します。融合メディアを交換するために、細胞の剥離を避けるために最小限の速度で液滴を追加します。
図1脊髄外植片筋細胞共培養1日目から15日まで。
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Discussion
筋細胞の培養は、通常、複数の細胞および細胞型接続の重要性を再現していないため、正常および病理学的文脈において筋細胞の機能を研究する生理学的なin vitroのツールは 、myologistsの最重要である。筋細胞に運動ニューロンの精製加えてシュワン細胞の存在は、5効率的に神経支配のために必要とされ、それに関連するプロトコルがここで説明する（3D +特殊なディストリビューション）を位相的にしていないので、機能的なモータユニットを達成するために十分ではありませんin vitroでかつ容易に評価することができ、完全なNMJの成熟の結果で神経支配筋細胞を確立するために首尾よく使用されてきました。
マウスモデルは、多くの神経筋疾患で利用可能になりました。残念ながら、これらのモデルの多くは、脊髄性筋萎縮症のマウスモデルでは、デュシェンヌ型、例えば、ヒト患者の病気への翻訳の面で制限されています筋ジストロフィーや筋萎縮性側索硬化症。脊髄性筋萎縮症は、部分的にヒトゲノム6の第二SMN遺伝子の存在によって軽減することができますSMN1遺伝子の突然変異によって引き起こされます。対照的に、マウスのゲノムは、SMNのための唯一つの遺伝子が含まれており、その欠失は7 embryonically致命的である。したがって、マウス脊髄性筋萎縮症のモデルを開発するために、人間のSMN2コピーが人為的にSMNノックアウトマウス8,9に導入した。これらの動物は、まだ人間の病理学に最も近い遺伝的モデルを表しますが、これらのマウスで観察された表現型は、マウスは通常10を発現しないことSMN2遺伝子の発現によるものである。デュシェンヌ型筋ジストロフィーの場合には、mdxマウスは、ヒト患者への同様の変異ジストロフィン遺伝子を持っていますが、結果は、患者11に観察される症状に比べてはるかに少ない厳しいです。 amyotrophiのために最も広く使用されているマウスモデルC側索硬化症、SOD1マウスは、これまでのところ、病気のメカニズムと治療的アプローチ12,13洞察を明らかに失望。機能を研究するため、脊髄の外植片筋細胞の共培養、完全に生理的な設定では、患者からの筋肉のゲノムとプロテオームの特性、そのような複雑な疾患を研究する貴重なツールを表しています。さらに、このヘテロ種のモデルは、神経と筋の病理学的メカニズムを区別するのに役立ちます。3,14,15
ここで紹介する共培養はまた、いくつかの制限があります。植により具現神経終末がシナプス後NMJ装置をカバーするので、たとえば、筋肉細胞の免疫組織化学の実験では、この構造上で実行することは困難です。このシステムは、統合された、比較的成熟した培養系での薬物の神経や筋緊張の影響を評価するために使用することができますが、それは許可されていません、ハイスループットスクリーニングは、ボリュームがあまりにも大きいだろうと。不思議なことに、相同神経筋神経と筋肉の両方のコンポーネントだけで、マウスまたはラットから来るとの共培養は機能しませんし、筋肉の収縮につながることが失敗します。しかし、最近、マウスの衛星筋細胞とマウスの脊髄外植片の間の相同神経支配が正常胚の収穫の日付変更（Callizot、Steinschneiderら、未発表結果）によって実行されています。相同性を共培養するためのルーチンのプロトコルを確立するための更なる進展は、今日、この技術に存在する種の制限を克服するために役立つかもしれない。
これらの制限にもかかわらず、ここでは、筋肉や運動ニューロン生理学の多くの側面の研究を可能にする方法を説明し、実行することは困難ではありません技術は、安定した脊髄の外植片筋の共同で特別な材料とその結果を必要としません簡単に維持することができ、文化やstudie何ヶ月ものD。
プロトコルの特定の側面は特に重要であると適切な神経支配を確保するために特別な注意が必要です。まず、ラットの胚は、年齢13〜14 EDである必要があります。第二に、35 mmディッシュあたり500,000細胞は細胞融合の起動時にすぐに筋肉細胞に追加された外植片の付着を容易にするために、セルの合流点の適切なレベルを保証します。最後に、プロトコルで強調し、筋肉細胞の外植片の堆積後の培地の添加は、この手順の中で最も難しい部分であり、細心の注意を払って行う必要があります。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちの仕事は、スイス国立科学財団（SNF）、システム生物学（SystemsX.ch）、筋ジストロフィー協会アメリカ（MDA）、協会·フランセーズcontreレミオパシー（AFM）、米国ミトコンドリア病財団、スイスのイニシアティブによってサポートされています（UMDF）、ゲーベルト-RUF財団まれな疾患プログラム（GRF）、筋疾患（SSEM / FSRMM）、スイスライフ "JubiläumsstiftungエリーゼVolksgesundheitウントmedizinische Forschung"、ロシュ研究財団と大学の研究のためのスイス社会バーゼルの。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
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