Eenvoudige en robuuste In vivo En In vitro Aanpak voor het bestuderen van Virus Vergadering

Summary

Een eenvoudige, efficiënte en robuuste manier om de levering van meerdere virale componenten synchroniseren met plantencellen via

Abstract

In virussen met een positieve-sense RNA genoom pathogeen zijn voor mens, dier en plant, nageslacht ingepakt in volwassen en stabiel virionen is een kardinale fase tijdens de oprichting van de infectie in een bepaalde host. Bijgevolg, studie van inkapseling ontcijfert de informatie met betrekking tot de know-how van het mechanisme reguleren virus assemblage van infectueuze virionen te vormen. Dergelijke informatie is van vitaal belang bij het formuleren van nieuwe methoden voor het terugdringen van het virus verspreiding van ziekten en plagen. Virus inkapseling kan worden bestudeerd in vivo en in vitro. Genoom inkapseling in vivo is een sterk gereguleerde selectief proces, waarbij macromoleculaire interacties en subcellulaire verkokering. Daarom studie die leidt tot ontleden gebeurtenissen omvat virus inkapseling in vivo zou basiskennis te bieden om te begrijpen hoe virussen zich vermenigvuldigen en te monteren. Onlangs in vitro inkapseling is benut voor het onderzoek op het gebied van biomedische imaGing en therapeutische toepassingen. Niet-omhulde plantenvirussen staan ​​ver vooruit in de onderneming van in vitro inkapseling van de negatief geladen vreemd materiaal. Brome mosaic virus (BMV), een niet-omhulde multicomponent RNA virus pathogeen planten werd gebruikt als modelsysteem voor het bestuderen genoom verpakking in vivo en in vitro. Voor encapsidering assays in Nicotiana benthamiana planten Agrobacterium-gemedieerde transiënte expressie, noemen agroinfiltration, is een efficiënte en robuuste techniek voor de gesynchroniseerde leveren en expressie van meerdere componenten dezelfde cel. In deze benadering wordt een schorsing van Agrobacterium tumefaciens cellen die binair plasmide vectoren die cDNA's van desiredviral mRNA's geïnfiltreerd in de intercellulaire ruimte withina blad met niets meer verfijnd dan een 1 ml wegwerpspuit (zonder naald). Dit leidt tot de overdracht van DNA insert in plantencellen, de T-DNAinsert blijft tijdelijk in de kern en wordt getranscribeerd door de gastheer polymerase II, leiden tot de transiënte expressie. De resulterende mRNA transcript (capped en gepolyadenyleerde) wordt vervolgens geëxporteerd naar het cytoplasma voor de vertaling. Na ongeveer 24 tot 48 uur incubatie, kunnen delen van geïnfiltreerde bladeren worden bemonsterd voor microscopyor biochemische analyses. Agroinfiltration maakt grote aantallen (honderden tot duizenden) cellen gelijktijdig getransfecteerd. Voor in vitro encapsideringssignaal gezuiverd virions van BMV worden gescheiden in capside-eiwit door dialyseren tegen dissociatie buffer met calciumchloride gevolgd door verwijdering van RNA en niet-gedissocieerd virions door centrifugeren. Genoom verarmd capside-eiwit subeenheden vervolgens weer met de gewenste virale genoom onderdelen of niet-virale componenten zoals indocyanine kleurstof.

Protocol

1. Plantaardig materiaal

1. Nicotiana benthamiana planten worden in de encapsideringssequenties test moet bij 4 bladeren fase (ongeveer 3-4 weken oude planten).

2. Levering en expressie van functionele virale genoom componenten naar de cellen te planten door agroinfiltration

1. Dag 1: Agrobacterium-stam (bijv. EH 105 of GV 3101) herbergen de pCass-BMV RNA 1, BMV RNA 2 en BMV RNA 3 ^1,2 gekweekt op LB-agarplaten aangevuld met 50 mg / ml kanamycine (selecteert voor de pCASS vector) en 100mg/ml van rifampicine (kiest voor de Agrobacterium). De incubatie wordt uitgevoerd bij 28 ° C voor twee dagen.
2. Dag 3: Inoculatie enkele kolonie van de LB-agar plaat in 2 ml LB-bouillon met daarin 50 mg / ml kanamycine en 100 mg / ml rifampicine voor 1 dag bij 28 ° C in rondschudapparaat bij 250 RPM.
3. Dag 4: Inoculeer 50 ml van de LB-bouillon supplemented met 50 mg / ml kanamycine en 100 mg / ml rifampicine, 10 mM MES pH 5,6 en 100 mM acetosyringoon met een ml van de cultuur in een 250 ml Erlenmeyer gedurende 16 uur bij 28 ° C orbitale schudder bij 250 RPM .
4. Dag 5: Breng de cultuur (bij OD ₆₀₀ 1,0 bereikt) om een Oak Ridge buis of steriele Falcon buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 5000 rpm bij 4 ° C.
5. Los de pellet in 10 ml 10 mM _MgCl2 en centrifugeer 10 minuten bij 5000 rpm bij 4 ° C, Herhaal stap een keer een volledige verwijdering van het antibioticum waarborgen.
6. Suspendeer de pellet in 10 ml buffer die 10 mM _MgCl2 en 10 mM MES (pH 5.6).
7. Meet de OD ₆₀₀ voor elke kweek van BMV RNA 1, RNA 2 en RNA 3 en tot aan 0,1 OD ₆₀₀ met 10 mM _MgCl2 en 10 mM MES (pH 5.6).
8. Meng 1 ml elk alle drie 0,1 OD ₆₀₀ cultuur suspensies.
9. Voeg 100 mM acetosyringoon, mix gently en dit mengsel ongestoord bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
10. Teken de cultuur schorsing in 1 ml. injectiespuit zonder naald.
11. Infiltreren bovengenoemde cultuur suspensie in abaxiale zijde van 2-3 goed geëxpandeerde bladeren N. benthamiana (5 bladeren fase van 3-4 weken oude planten) zachtjes op de spuit de helft van de abaxiale oppervlak van het blad.
12. Herhaal infiltratie procedure andere bladeren.
13. Houd geïnfiltreerde planten in de kas met 24 ° C.
14. Oogst de bladeren 3 geïnfiltreerd tot 4 dagen na infiltratie (dpi).

3. Zuivering van BMV virionen

1. Verzamel N. benthamiana laat agroinfiltrated met een mengsel dat alle drie de wild-type BMV agrotransformants.
2. Malen bladeren in een steriele vijzel met een gelijk volume (w / v) BMV extractiebuffer (0,5 M NaAc, 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 en 1/100 volume van β-mercapto-ethanol die wordt toegevoegd onmiddellijk voor gebruik) ^3. Om virus opbrengst te maximaliseren, is het raadzaam om zuur gewassen zand (~ 0,5-1 g) die gemakkelijk slijpen en efficiënte cel verstoring vergemakkelijkt toe te voegen.
3. Filtreer het extract door middel van 2-3 lagen van mousseline doek en het verzamelen van de vlaag.
4. Opnieuw malen de ingehouden gedeelte op mousseline doek met gelijk volume van BMV extractiebuffer van het gewicht van bladmateriaal.
5. Herhaal de procedure met behulp van filtratie mousseline doek. Deze stappen worden uitgevoerd bij 4 ° C.
6. Breng het filtraat oplossing een centrifugebuis en voeg gelijk volume van pre-gekoelde chloroform en vortex (of schud) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur tot de kleur van de suspensie wordt lichtgroen.
7. Centrifugeer de geëmulgeerde oplossing gedurende 15 minuten bij 12.000 rpm bij 4 ° C.
8. Verzamelen van de waterfase en roer 30 minuten magneetroerder om eventuele chloroform verwijderen.
9. Doe de suspensie in een steriele ultracentrifuge buis.
3.
10. Centrifugeer bij 30.000 tpm gedurende 3 uur in een Beekman ultracentrifuge bij 4 ° C.
11. Verwijder het supernatant en schorten pellet in gewenste volume van de BMV suspensie buffer (tot opschorting buffer verdunde BMV extractiebuffer voor te bereiden tot 1/10 met steriel gedestilleerd water).
12. De gedeeltelijk gezuiverd virion bereiding van bovenaf wordt onderworpen aan 10-40% sucrose gradiënt centrifugatie dichtheid van 150 min bij 28.000 rpm bij 4 ° C.
13. Verzamel het virus band met de hand of door een fractioneerinrichting. Het virus band zal verschijnen blauw onder wit licht verlichting.
14. Verdun de sucrose-oplossing met virus monster ten minste 50% met virussuspensie buffer.
15. Centrifugeer verdunde virus sucrose-oplossing gedurende 3 uur bij 30.000 rpm in een Beekman ultracentrifuge bij 4 ° C.
16. Tot slot schort de sterk gezuiverde virus pellet in een gewenste volume van virons schorsing buffer.
17. Concentratie van de virion (mg / ml) met spectrofotometer bij OD _260.

Opmerking: Op basis van RNA-inhoud, de extinctiecoëfficiënt voor BMV is 5 ^4.

19. Controleer of de zuiverheid van virionen door het bekijken van onder TEM (afb. A)

4. Bereiding van capside-eiwit subeenheden in vitro assemblage

1. Bereid 1 Liter van 1x virus dissociatie buffer (0,5 M _CaCl2, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 mM EDTA, 1,0 mM DTT en 0,5 mM PMSF) ^5.
2. Bereid dialysemembraan volgens Sambrook et al. ^6.
3. Breng benodigde concentratie van gezuiverd virus in een dialysezak.
4. Plaats het virus met dialyse tas in een bekerglas met 1x virus dissociatie buffer.
5. Dialyze 24 uur bij 4 ° C while roeren.
6. Verzamelen oplossing uit de dialysezak na 24 uur en centrifugeer bij 12.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C. Dit zal scheiden van de BMV RNA uit de gedissocieerde virions.
7. Gebruik de bovenstaande vloeistof en centrifugeer bij 35.000 toeren per minuut in Beckman centrifuge gedurende 3 uur bij 4 ° C tot pellet alle VN-gesplitste virusdeeltje.
8. Gebruik de bovenstaande vloeistof.
9. In dit stadium is het noodzakelijk om eventuele besmetting van virion RNA te verwijderen van los capside-eiwit subeenheden. Hiertoe dient het supernatans van stap 8 worden onderworpen aan een ronde overnacht montage van capside-eiwit subeenheden zonder toevoeging RNA (RNA in 1x montage buffer, zie hieronder) gevolgd door een snelle centrifugatie (30.000 rpm gedurende 3 uur bij 4 ° C) tot pellet een samengesteld virions. Na deze montage stap zou de supernatant bevattende manteleiwit subeenheden vrij zijn van contaminerende resterende RNA. Echter, dit te waarborgen is het raadzaam om een ​​extra voeren in vitro montage slechts manteleiwit subeenheden met RNA 1x montage buffer. Na meer dan 's nachts opnieuw monteren, moet de voorbereiding vrij van geassembleerde virionen (te controleren met behulp van TEM).
10. Het gehalte aan capside-eiwit subeenheden door meting bij OD 254 en 280 nm of door andere methoden zoals Bradford-test.
11. Voer 12-15% SDS-PAGE, gevolgd door western blot om de integriteit van het gedissocieerde capside eiwitsubeenheden bepalen.

5. In vitro samenstel van RNA die virionen

1. Bereid RNA-transcripten opnieuw worden geassembleerd in virions en bereken de concentratie ^7.
2. Meng capside-eiwit subeenheden en RNA transcript in een verhouding van 1:5 (gew / gew) ^5.
3. Breng het bovengenoemde mengsel een dialysezak en goed vast te zetten lekkage te voorkomen.
4. Bereid 1000 ml. RNA 1x samenstel buffer (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM KCl, 5 mM _MgCl2, 1,0 mM DTT) ^5.
5. Plaats de dialyse zak met het reactiemengsel tegen 1x montage buffer in de beker en roer.
6. Dialyze de hermontage reactie bij 4 ° C gedurende 24 uur zacht roeren.
7. Verzamelen het mengsel uit de dialysezak na 24 uur en voeg 1,5 ml RNA samenstel buffer.
8. Stuur dit mengsel door een Centricon-100 kolom door centrifugeren op lage snelheid (2000 xg) gedurende 30 minuten.
9. Ze wast de kolom met 1,5 ml buffer samenstel bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
10. Twee keer Herhaal bovenstaande wasstap.
11. Tenslotte elueren het opnieuw geassembleerde virions door centrifugatie bij 10000 g bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
12. Schat de virion concentratie bij OD 260 nm.

6. Fabricage van optische Viral Ghosts (OVGs)

1. Voeg indocyaninegroen (ICG) ⁸ van het gezuiverde capside-eiwit in de gewenste concentratie ratio (de gewichtsverhouding van indocyaninegroen en capside-eiwit in dit rapport 01:10) een d meng goed door pipetteren.
2. Dialyze de capside eiwitten en ICG oplossing tegen de OVG samenstel buffer (1 M NaCl, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA en 1 mM DTT, pH4.8) bij 4 ° C gedurende 24 uur.
3. Na 24 uur verzameld oplossing uit de dialysezak (12 kDa poriegrootte) en gecentrifugeerd bij 90.000 rpm gedurende 1 uur bij 4 ° C (Fig. B)
4. Verwijder de bovenstaande vloeistof en hang de pellet in BMV suspensie buffer en door vortexen of deze op door zelf te schorten BMV suspensie buffer overnacht bij 4 ° C.
5. Controleer of de morfologie van OVGs door TEM (afb. C).
6. Meet de absorptie van 240 nm tot 950 nm met behulp van spectrofotometer (Cary 50, Varian Inc), de aanwezigheid van ICG wordt bevestigd door ondertekening absorptie pieken rond de 700 nm en 790 nm ^8. (Afb. D)
7. De typische ICG fluorescentie pieken op ~ 700 nm en ~ 800 nm te zien is bij de 620 nm excitatie van OVG-oplossing (afb. D) met behulp van spectrofluorometer (Fluorolog 3, Jobin-Yvon).

_title "> 7. representatieve resultaten

Figuur A. TEM beeld van negatief gekleurde BMV virionen gezuiverd van N. benthamiana planten agroinfiltrated met een mengsel van alle drie de wild-type BMV agroconstructs (schaal bar = 100 nm).

Figuur B. Pellet van in vitro-geassembleerde ICG bevattende OVGs na hoge snelheid centrifugeren.

Figuur C. TEM beeld van negatief gekleurde ICG met OVGs (schaal bar = 100 nm).

Figuur D. Absorptie (Top) en fluorescentie (onder) spectra van OVGs. De golflengte voor OVG emissie wals 620 nm.

Discussion

Agroinfiltration hier gepresenteerde benadering op grote schaal kunnen worden toegepast op een breed scala van plantenvirussen. Een kenmerk kenmerk van deze benadering is gesynchroniseerd levering van meerdere agroconstruct naar dezelfde cel-een groot nadeel vaak geassocieerd met routinematig mechanische inoculatie van plantenvirussen. In vivo en in vitro studies montage met broom mosaic virus als model kan doelmatig worden uitgevoerd door volgen enkele tips. (i) Voor een succesvolle infiltratie van N. benthamiana vertrekt, niet de planten water voor 24 uur voor infiltratie, (ii) Agrobacterium schorsing cultuur zou in de intracellulaire ruimtes verspreid met gemak, als infiltratie werden uitgevoerd tussen 4-5 uur; (iii) De optische dichtheid van de cultuur moet groter zijn dan niet 1.0 bij OD _600. Infiltratie van agrocultures met een hogere celdichtheid is bekend dat het cel toxiciteit en bladsenescentie ^9,10 die sterk van invloed kunnen zijn virale replicatie en de daaropvolgende virion veroorzakenvorming, (iv) Tijdens infiltratie zachte druk moet worden aangebracht op de abaxiale zijde van het blad te grote schade aan het blad, dat immuunrespons bij planten kunnen veroorzaken te voorkomen; (v) sucrose dichtheid gradiënt van 10% tot 40% kan worden gemaakt in een buis door 25% sucrose in BMV suspensie buffer (door toevoeging de hoogste concentratie en laagste concentratie, gedeeld door 2 di 10% + 40% / 2 = 25%) en onmiddellijk bij -80 ° C gedurende 2 bevriezen -4 uur en verder het sucrose langzaam ontdooien door hem overnacht bij 4 ° C in een rechte stand.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES Sodium salts	Sigma-Aldrich	M2993
Indocyanine green	Sigma-Aldrich	I2633
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	Model: L8-70M
Centricon-100 column	EMD Millipore	YM-100
Spectrophotometer	Varian, Inc.	Part number 10068900
Spectrofluorometer	Fluorolog 3, Jobin-Yvon.	Part number FL3-21