Summary
פיתחנו מודלים coculture 3D הדמיה חיה תאים בזמן אמת של אינטראקציות בין תאים סרטניים בשד ותאים אחרים microenvironment שלהם המשפיעים על התפתחות פנוטיפ פולשני. מודלים אלה יכולים לשמש מסכי פרה עבור תרופות למיקוד paracrine המושרה, פרוטאוליטים chemokine / ציטוקינים ו קינאז מסלולים מעורבים הפולשנות.
Abstract
פיתחנו מודלים coculture 3D, אשר אנו מיים טווח (מ 'ammary rchitecture ו-M ngineering icroenvironment ה), והשתמשו בהם הדמיה חיה תאים בזמן אמת של התא: אינטראקציות התא. המטרה הכללית שלנו היתה לפתח דגמים לשחזר את הארכיטקטורה של נגעים השד preinvasive ללמוד ההתקדמות שלהם פנוטיפ פולשני. באופן ספציפי, פיתחנו מודלים לניתוח אינטראקציות בין טרום ממאירים בשד האפיתל גרסאות סלולריים סוגי תאים אחרים של microenvironment הגידול כי היו מעורבים שיפור או לצמצם את ההתקדמות של תאים בשד preinvasive אפיתל ל קרצינומות ductal פולשנית. סוגי תאים אחרים שנחקרו עד כה הם תאים myoepithelial, fibroblasts, מקרופאגים דם כלי הדם הלימפה ותאי האנדותל. בנוסף הדגמים מיים, אשר נועדו לשחזר את אינטראקציות הסלולר בתוך השד במהלךהתקדמות סרטן, פיתחנו מודלים דומים להתפתחות של סרטן הערמונית.
כאן אנו מדגימים את ההליכים להקמת cocultures 3D יחד עם שימוש בהדמיה חי תאים ו assay proteolysis תפקודית לבצע את המעבר של cocultures של סרטן השד ductal באתרם (DCIS) תאים פיברובלסטים, פנוטיפ פולשני לאורך זמן, במקרה זה על פני עשרים ושלושה ימים בתרבות. Cocultures מיים כוללים מספר רב של שכבות. Fibroblasts המוטבעים השכבה התחתונה של סוג אני קולגן. על הממוקם שכבה של קרום במרתף המחודשת (RBM) שבו תאים DCIS הם זרע. השכבה העליונה הסופי של RBM 2% כלול מתחדש עם כל שינוי של התקשורת. כדי proteolysis התמונה שמראה את ההתקדמות כדי פנוטיפ פולשני, אנו משתמשים צבען הרווה (DQ) חלבוני ניאון מטריקס (DQ-קולגן ערבבתי עם שכבת קולגן I ו-DQ קולגן IV מעורבב עם השכבה האמצעית של RBז) ולבחון תרבויות חיים באמצעות מיקרוסקופ confocal. חלקים אופטיים נלכדים, עיבוד מחדש ב-3D עם תוכנת ויזואליזציה Volocity. במשך 23 ימים מיים cocultures, התאים מתרבים DCIS ו להתמזג לתוך מבנים גדולים פולשניים. Fibroblasts להעביר ו המוטמעים מבנים אלה פולשניים. שברי פרוטאוליטים הניאון של collagens נמצאות בקשר עם השטח של מבנים DCIS, intracellularly, והתפזרו ברחבי גם מטריקס שמסביב. תרופות פרוטאוליטים היעד, chemokine / ציטוקינים ו קינאז מסלולים או שינויים בהרכב הסלולר של cocultures יכול להפחית את הפולשנות, טוען כי מודלים מיים יכול לשמש מסכי פרה של גישות טיפוליות חדשות.
Protocol
1. הכן DQ-מצעים
- אפשר lyophilized DQ-מצעים לחמם לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה בקבוקונים, להכין פתרון מלאי של 1 מ"ג / מ"ל של מצע-DQ במים deionized, ומחלקים ל -50 aliquots μl ו חנות ב 4 ° C.
זה עשוי להיות נחוץ כדי להתסיס DQ-המצע באמבט מים קולי עבור ~ 5 דקות וחום עד 50 ° C כדי להקל על פיזור.
- RBM הפשרה על קרח בן לילה על 4 מעלות צלזיוס; RBM צריכים להיות מטופלים על הקרח כל הזמן.
- כדי להפוך פוספט 10X בופר סליין (PBS), להמיס 80 גרם NaCl (1.37 מ '), 2 גרם KCl (0.027 מ'), 14.4 גרם Na 2 HPO 4 (1 מ '), ו -2.4 גרם KH 2 PO 4 (0.02 מ') 800 מ"ל מים ultrapure. התאם את ה-pH של תמיסת חיץ PBS ל 7.4 עם 1.0 מ 'HCl. להביא נפח 1 ליטר, לעקר על ידי סינון.
- הכן קולגן אני פתרון קרח: 8 חלקים של קולגן מצונן אני לחלק 1 של PBS 10X צונן. התאם את ה-pHשל התערובת 7.2-7.6 שימוש סטרילי 0.1 מ 'NaOH. בדוק pH עם רצועות ה-pH ולהתאים את עוצמת הקול הסופי ל -10 חלקים עם מים סטריליים.
- הכן DQ-קולגן אני: קולגן אני מטריקס על ידי דילול DQ-קולגן אני בתמיסה קולגן אני בצינור prechilled לריכוז סופי של 25 מיקרוגרם / מ"ל ו - 2.4 מ"ג / מ"ל, בהתאמה.
- הכן DQ-קולגן IV: קרום במרתף המחודשת (RBM) מטריקס על ידי דילול DQ-קולגן IV ב RBM (Cultrex או Matrigel) בצינור prechilled לריכוז סופי של 25 מיקרוגרם / מ"ל ו - 12-15 מ"ג / מ"ל, בהתאמה. מערבבים על הקרח באמצעות pipetting עדין, כדי למנוע יצירת בועות.
2. הכן מיים cocultures
ראה איור 1 עבור תרשים סכמטי של cocultures.
- מקום שני coverslips פלסטיק מלבני (עיקור באלכוהול 70% ל 10 דקות אוויר יבש) במנה 35 מ"מ תרבות או להשתמש IbiTreat 35 מ"מ μ-Dish. הכיוונים כאן הם עבור שני coverslips ו μ של שטיפת הכלים, שבו אנו משתמשים עבור סטומת על מיקרוסקופ זקוף. למחקרים על מיקרוסקופ הפוכה, אנו משתמשים רק μ של שטיפת הכלים.
- מערבבים את המספר הרצוי של fibroblasts עם DQ-קולגן אני: קולגן אני מטריקס. עבור לטווח ארוך cocultures מאוירים באיורים 2 ו -3, אנו משתמשים ב -500 fibroblasts μl 10 של מדיה פלוס 60 μl של DQ, אני קולגן: קולגן אני מטריקס.
- שימוש micropipettor 100-μl, בזהירות פיפטה ולהתפשט 70 μl של פיברובלסטים: DQ-קולגן אני: קולגן אני מטריקס על פני השטח של כל coverslip ולהשאיר על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified ללא CO 2 למשך 30 דקות כדי לחזק.
- העברת 35 מ"מ מאכלים המכילים coverslips ל 37 מעלות צלזיוס חממה עם CO 5% 2 במשך 10 דקות כדי לאזן.
- הסר חממה ולהשאיר את 35 מ"מ מנות תחת מכסה המנוע עד שיגיעו לטמפרטורת החדר.
- הוסף 60 μl של DQ, קולגן IV: RBM מטריקס על גבי הקרושה DQ-קולגן אני: קולגן אני מטריקס עם fibroblasts משובצים. עם פיפטה עצה, CAלהפיץ refully DQ-קולגן IV: RBM מטריקס באופן שווה, הימנעות מגרד פיברובלסטים: DQ-קולגן אני: קולגן אני מטריקס.
- העברת 35 מ"מ מאכלים המכילים coverslips ל 37 מעלות צלזיוס חממה עם CO 5% 2 במשך 10 דקות כדי לחזק. בעוד DQ-קולגן IV: RBM מטריצת לחיזוק, trypsinize ולספור לתאי האפיתל.
- מקום 50 μl של השעיה תא אפיתל / גידול על coverslips מצופה DQ-קולגן IV: RBM מטריקס. 35 מ"מ מקום מאכלים המכילים את coverslips תוך 37 ° C חממה. אפשר 40-60 דק 'עבור התאים לצרף DQ-קולגן IV: RBM מטריקס. עבור לטווח ארוך cocultures מאוירים באיורים 2 ו -3, אנו משתמשים בתאי אפיתל 2500 או גידול.
- הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות RBM המכיל 2% מנה 35 מ"מ כל אחד. אם עושים את כל הטיפולים התרופתיים, התרופות יש להוסיף בשלב זה.
- דגירה לתקופה הרצויה של זמן עד הדמיה. לטווח הארוך התרבויות, התקשורת צריכה להיות שונה כל 3-4 ימים. התאים יכולים להישמרבתווך התרבות הרגילה. עבור מיים cocultures של שורות תאים בשד, אנו משתמשים בינוני בסל אפיתל (MEBM-PRF) השלימו עם SingleQuots MEGM.
3. בצע 4D (3D בזמן +) הדמיה של חיים מיים cocultures על ידי מיקרוסקופ confocal
- על הוכחה של עקרון מחקרים מאוירים, מיים cocultures תויגו עם צבע תא ניאון מעקב על פי נוהל שפורסם שלנו 1. אחרי כביסה עם PBS, cocultures היו מודגרות עם אורנג' 5 מיקרומטר CellTracker במדיום MEGM 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה, שטפתי שוב עם PBS ו מודגרות עם MEGMmedium prewarmed למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 באינקובטור לפני הדמיה .
- תמונה מיים חיים cocultures בהגדלה נמוכה (עדשת 10X, טובלים במים) על המיקרוסקופ LSM-510 META Zeiss confocal.
- חלקים אופטיים נלכדים מדי פעם במהלך לעומק כל המבנים. ללימודים שלנו, אנחנו ללכוד חלקים אופטיים ב 10מיקרומטר במרווחים.
- השתמש חלקים אופטיים לשחזר תמונות ב-3D. אנו משתמשים בתוכנה Volocity לייצר שחזורים 3D.
- לעשות סרטים של שחזורים 3D, כך מבנים, תאים: תא אינטראקציות ויחסי גומלין עם הסובבים מטריצות ניתן דמיינו. עשינו סרטים עם נגן QuikTime 7.
4. נציג תוצאות
Cocultures מיים שפיתחנו הם מודל ניסיוני צייתן הדמיה חיה תאים בזמן אמת של אינטראקציות בין המרכיבים הסלולר השונות המרכיבות הגידול השד microenvironment שלה. כאן אנחנו מראים את היכולת של מודלים מיים לשחזר תאים: תא אינטראקציות במהלך התקדמות סרטן השד של הדמיה חיה תאים אלה כדי לעקוב אחר אינטראקציות לאורך זמן. אנחנו מדגימים את היכולת אינטראקציות בין התמונה קו preinvasive MCF10.DCIS התא האנושי השד סרטן השד האנושי הקשורים קו פיברובלסטים, WS-12Ti, עלתקופה של יותר משלושה שבועות בתרבות. Cocultures היו צילמו ב 3, 16 ו - 23 ימים. חלקים אופטיים דרך כל נפח cocultures שוחזרו בדוגמאות 3D ונציג מוצגים עבור כל אחד משלושת timepoints באיור 2. פלואורסצנטי אדום באיור 2 מייצג את MCF10.DCIS ו WS-12Ti תאים. להבחין בין שני סוגי התאים ועל לטווח ארוך cocultures, אפשר transfect או transduce סוגי תאים בודדים עם חלבונים ניאון לפני הקמת התרבויות. Coculture מיים של תאים MCF10.DCIS ו WS-12Ti המוגדרים באופן דיפרנציאלי עם חלבונים ניאון לזיהוי מתוארת באיור 3.
על ידי שילוב מצעים, במקרה זה DQ-collagens, אל cocultures מיים, אנחנו יכולים להעריך ולכמת את השינויים לאורך זמן proteolysis קשור המעבר פנוטיפ פולשני. הקמנו שיטות לכימות המוצרים מחשוף ניאון כי התוצאהמ-DQ קולגן השפלה 2,3. אנחנו לנרמל מוצרים פגומים לאורך נפח 3D כל cocultures מיים על בסיס לכל תא על ידי תיוג ספירת גרעיני תאים. יתר על כן, אנחנו יכולים למקם את ההשפלה על תאים תאיים ו תאיים ולכמת את הכל, מוצרים פגומים ו תאיים תאי כפי שתיארנו קודם לכן 2. פלואורסצנטי ירוק איורים 2 ו -3 מייצג מוצרי ביקוע של שתי DQ-קולגן מצעים. בשלב זה, collagens דיפרנציאלי, שכותרתו אינם זמינים שיאפשר לנו להבדיל בין ירידה של קולגן IV סוג והשפלה מסוג אני קולגן.
יחסי הגומלין ב cocultures מיים הם דינמיים ויכולים להשתנות עם הזמן. כדי להשיג מידע הזמני ודינמי, אותו שדה הראייה יכול להיות חלקים וצילמו אופטיות שצולמו באמצעות הדגימה כולו מנפח שוב ושוב בין דקות שבועות על פני תקופה של זמן,כך איסוף נתונים 4-D. באיור 2, אנו מדגימים שינויים דרמטיים למדי המתרחשות על פני 23 ימים: שינויים במספר תאים, נדידת תאים ויחסי הגומלין סלולריים, אמצעי אחסון מבנה, צורות מבנה, סטיות של המבנים של הכדוריות, בצמחים פולשניים או proteolysis. יתר על כן, יש לנו גם להפגין את השינוי הכולל בנפח בשל cocultures מיים משפיל שלהם סביב תאי מטריקס במהלך פרק זמן זה. בשלושה ימים כפי שמודגם באיור 2 א, כרך הוא 110,000 מיקרומטר 3. לעומת זאת, נפח cocultures מיים ב 16 ו 23 ימים הוא רק 46,250 מיקרומטר 3, כפי שמודגם בתרשימים 2B ו-C
באיור 1. תרשים סכמטי של מיים cocultures. Coverslip פלסטיק מצופה קולגן I, קולגן המכיל DQ-I ו fibroblasts (מג'נטה). שכבה 2 של קרום במרתף המחודשת (RBM) המכיל DQ-collagen IV הוא הוסיף. תאים סרטניים (אדום) הם מצופה מלמעלה RBM 2% בתרבות התקשורת המאוחסן (נקודות לבנות) עם כל שינוי של התקשורת. הירוק מייצג את המוצרים מחשוף ניאון של DQ, קולגן I ו-IV.
איור 2. מיים cocultures של תאים MCF10.DCIS השד אדם WS-12Ti fibroblasts השד אנושיים. Fibroblasts היו מוטבע קולגן I / DQ-קולגן אני ומצופה עם RBM המכיל קולגן DQ-IV. התאים היו DCIS זרע ואילך RBM ומצופה עם התקשורת המכילים RBM 2%. במשך 23 ימים coculture מאוירים כאן, היה התפשטות תאים, השפלה של DQ, קולגן IV ואני (ירוק) ו מטריצות קולגן כפי שצוין על ידי הפחתת נפח cocultures. התאים היו נקודתיים על ידי סימון כתום CellTracker באתרו לפני הדמיה (אדום). Cocultures מתגוררים אותם נצפו במשך 23 ימים עם תמונות שנתפסו על ידי גמיקרוסקופיה onfocal ב 3, 16 ו - 23 ימי coculture. הפרוסות אופטיים כתוצאה שוחזרו ב-3D עם תוכנת Volocity. הגדלה, 10X.
איור 3. מיים 16 יום cocultures של תאים MCF10.DCIS השד אדם WS-12Ti fibroblasts השד האדם אקספרס RFP (אדום) YFP (לבן), בהתאמה. Cocultures הוקמו וניתח כמו באיור 2. שני סוגי התאים המוצגים כאן היה, עם זאת, כבר מסומן באופן דיפרנציאלי כדי שיוכלו להבחין בין זה לזה. התמונות הגדלה גבוהות יותר נתון זה, בהשוואה לאלה באיור 2, להמחיש proteolysis של DQ, קולגן IV על פני השטח של התאים DCIS ו proteolysis מפוזר של DQ-קולגן אני באזורים הסמוכים fibroblasts את. הגדלה, 20X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שתואר, cocultures מיים יכול לשמש הדמיה חיה תאים בזמן אמת של אינטראקציות בין המרכיבים הסלולר השונות המרכיבות הגידול השד microenvironment שלה. בשנת הלימודים השוטפת במעבדה שלנו, השתמשנו מיים cocultures לזהות מסלולים פרוטאוליטים הקשורים המעבר DCIS כדי קרצינומה ductal פולשנית, כמו גם את האינטראקציות בין מסלולים ושבילים פרוטאוליטים אחרים הכרוכים במעבר זה כמו chemokine / ציטוקינים / צמיחה המסלולים גורם . בנוסף, אנו הראו כי מודלים מיים יכול לשמש ככלי לסינון ההשפעות של מעכבי מולקולה קטנה, חוסם נוגדנים או shRNAs כי לווסת פרוטאוליטים / chemokine / ציטוקינים / צמיחה המסלולים גורם 3-5. מודלים המרן יכול לשמש עבור דימות תאים חיים של צמיחה הפלישה הגידול, proteolysis על פי החל דקות ושעות, כפי שהראינו לעיל 6,7, עד שבועות כפי שמודגם כאן איורים 2 ו -3.אינטראקציות הנצפה הם בין התאים של מין אחד, כלומר, תאים סרטניים אנושיים הגידול הקשורים תאים, ולא בין תאים סרטניים ותאים אנושיים עכבר סטרומה כמו הדמיה intravital 8. הדגמים מיים הם מערכת צייתן. מולקולות של עניין יכול להיות downregulated עם shRNAs של סוגי תאים בודדים לפני coculturing כך תרומתם סוג התא לזילות של DQ-collagens ניתן הדמיה לכמת ב 3D 2. התקשורת מותנית מודלים מיים ניתן לדגום כדי למדוד שינויים בהפרשת של פרוטאזות, ציטוקינים וכו 'מידע שהתקבל מספק בסיס ניסוי לבדיקת ההשפעות של מעכבי מולקולה קטנה, חוסם נוגדנים, וכו'
ההרכב התאי של מיים cocultures ניתן להשפיע בקלות, כך ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את התרומה של סוגי תאים אחרים המצויים microenvironment הגידול (למשל, תאים myoepithelial, ומונוציטים, תאים אנדותל של דםכלי ומוצא הלימפה) להתפתחות ממאירה 6,7. מספר סוגים שונים בתא seeded, יחס של סוג תא אחד למשנהו משך הזמן בתרבות יהיה תלוי בסוגי תאים מסוימים משומשים שאלה ניסיונית. מודלים מיים יכול להיות גם המורחבת כדי להעריך את ההשפעות של שינויים microenvironment סביב גידולים בשד, כגון pH, מתח חמצן. למשל, הראינו כי כאשר תרבויות מיים נשמרים ב-pH חומצי מעט, כלומר, pH 6.8, יש עלייה proteolysis ואת הפולשנות. בנוסף, הראינו כי גם אנו יכולים להשתמש cocultures בדומה למודל סרטן אחרים כמו סרטן הערמונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 CA131990 (BFS ו RRM). חי תאים הדמיה בוצעה Core משאבים, מיקרוסקופיה הדמיה Cytometry נתמך, בין השאר, על ידי NIH מרכז מענק p30 CA22453 כדי סרטן Karmanos המכון, וויין סטייט ועל ידי אגף המחקר Perinatology של המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות , וויין סטייט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | Phenol red-free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
