Summary
Wir haben 3D-Kokultur-Modelle für Live-Cell-Imaging entwickelt in Echtzeit von Interaktionen zwischen Brust-Tumor-Zellen und andere Zellen in ihrer Mikroumgebung, die Einfluss auf Progression zu einem invasiven Phänotyp. Diese Modelle können als Bildschirme für präklinische Arzneimittel auf parakrine-induzierte proteolytische, Chemokin / Zytokin-und Kinase-Signalwege in Invasivität-Ziels dienen.
Abstract
Wir haben 3D-Kokultur-Modelle entwickelt, die wir als MAME (m ammary ein rchitecture und m icroenvironment ngineering e), und ihnen werden für Live-Cell-Imaging in Echtzeit von Zell: Zell-Interaktionen. Unser oberstes Ziel war es, Modelle, die die Architektur des präinvasive Brustläsionen ihre Progression zu einem invasiven Phänotyp zu studieren rekapitulieren zu entwickeln. Insbesondere haben wir Modelle der Interaktion zwischen den prä-maligne Zellen Brustepithelzellen Varianten und anderen Zelltypen der Tumor-Mikroumgebung, die in verstärkt oder verringert wird das Fortschreiten der präinvasive Brustepithelzellen invasive duktale Karzinome verwickelt sind zu analysieren. Andere Zelltypen, die bisher untersucht sind Myoepithelzellen, Fibroblasten, Makrophagen und Blut und Lymphe mikrovaskuläre Endothelzellen. Zusätzlich zu den MAME Modelle, die zur zellulären Wechselwirkungen innerhalb der Brust während rekapitulieren werdenTumorprogression, haben wir vergleichbare Modelle für die Progression von Prostatakrebs entwickelt.
Hier veranschaulichen wir die Verfahren für die Festlegung der 3D-Kokulturen zusammen mit der Verwendung von lebenden Zellen und einem funktionellen Proteolyse-Assay, um den Übergang von Co-Kulturen von Brust-duktales Carcinoma in situ (DCIS) und Fibroblasten zu einer invasiven Phänotyp im Laufe der Zeit folgen, in in diesem Fall mehr als 23 Tage in Kultur. Die Co-Kulturen MAME bestehen aus mehreren Schichten. Fibroblasten sind in der unteren Schicht von Kollagen Typ I eingebettet. Auf daß eine Schicht aus rekonstituierte Basalmembran (rBM), auf dem DCIS Zellen geimpft worden. Eine abschließende Deckschicht aus 2% rBM enthalten ist und aufgefüllt mit jedem Wechsel der Medien. Um das Bild Proteolyse mit dem Fortschreiten zu einem invasiven Phänotyp assoziiert, verwenden wir Farbstoff-abgeschreckten (DQ) fluoreszierenden Matrix Proteine (DQ-Kollagen I mit der Schicht aus Kollagen I und Kollagen IV-DQ mit der mittleren Schicht der rB vermischteM) und beobachten lebende Kulturen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Optische Schnitte werden erfasst, verarbeitet und rekonstruiert in 3D mit Endgeschwindigkeit, Visualisierungs-Software. Im Laufe der 23 Tage in MAME Kokulturen, vermehren sich die Zellen DCIS und verbinden sich zu großen invasive Strukturen. Fibroblasten wandern und in diese Strukturen eingebunden invasive geworden. Fluoreszierende proteolytische Fragmente der Kollagene in Verbindung mit der Oberfläche des DCIS Strukturen gefunden, intrazellulär, und auch in der umgebenden Matrix dispergiert. Wirkstoffe, die proteolytische, Chemokin / Cytokin und Kinasen oder Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung des Co-Kulturen der Invasivität reduzieren kann, was darauf hindeutet, dass MAME Modelle vorklinischen Screens für neue therapeutische Ansätze können verwendet werden.
Protocol
1. Bereiten DQ-Substrate
- Erlauben Sie lyophilisiert DQ-Substrate auf Raumtemperatur vor dem Öffnen Fläschchen wärmen, bereiten Stammlösung von 1 mg / ml DQ-Substrat in deionisiertem Wasser, teilen sich in 50 ul Aliquots und lagern bei 4 ° C.
Es kann notwendig sein, DQ-Substrat in einer Ultraschall-Wasserbad für ~ 5 min und Wärme auf 50 ° C, um die Dispersion zu erleichtern bewegen.
- Auftauen rBM auf Eis über Nacht bei 4 ° C; rBM sollte auf Eis zu allen Zeiten behandelt werden.
- 10X Phosphat zu Kochsalzlösung (PBS), 80 g NaCl gelöst (1,37 M), 2 g KCl (0,027 M), 14,4 g Na 2 HPO 4 (1 M) und 2,4 g KH 2 PO 4 (0,02 M) in 800 ml Reinstwasser. Der pH-Wert von PBS-Puffer-Lösung auf 7,4 mit 1,0 M HCl. Bringen auf 1 Liter, durch Filtration sterilisiert.
- Bereiten Kollagen I-Lösung auf Eis: 8 Teile gekühlt Kollagen I zu 1 Teil 10X PBS gekühlt. Der pH-Wertder Mischung auf 7,2 bis 7,6 unter Verwendung von sterilen 0,1 M NaOH. Überprüfen Sie pH-Wert mit pH-Streifen und auf das Endvolumen auf 10 Teile mit sterilem Wasser.
- Bereiten DQ-Kollagen I: Kollagen I Matrix durch Verdünnen von DQ-Kollagen I in Kollagen I-Lösung in einem vorgekühlten Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 25 ug / ml und 2,4 mg / ml.
- Planen DQ-Kollagen IV: rekonstituierte Basalmembran (rBM)-Matrix durch Verdünnen DQ-Kollagen IV in rBM (Cultrex oder Matrigel) in einer vorgekühlten Rohr bis zu einer Endkonzentration von 25 ug / ml und 12-15 mg / ml. Auf Eis mit sanften Pipettieren zu vermeiden Blasen zu erzeugen.
2. Bereiten Sie MAME Kokulturen
Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung Kokulturen.
- Platz zwei rechteckige Kunststoff-Deckgläschen (sterilisiert in 70% Alkohol für 10 min und luftgetrocknet) in einem 35-mm-Kulturschale oder verwenden Sie eine ibiTreat Oberfläche 35-mm-μ-Dish. Anfahrt Hier sind für beide Deckgläser und μ-Gerichte, die wir für Studierende nutzenstirbt auf einem aufrechten Mikroskop. Für Untersuchungen an einem inversen Mikroskop, verwenden wir nur μ-Dishes.
- Mischen Sie die gewünschte Anzahl von Fibroblasten mit DQ-Kollagen I: Kollagen I-Matrix. Für die Langzeit-Co-Kulturen in den Abbildungen 2 und 3 dargestellt, verwenden wir 500 Fibroblasten in 10 ul 60 ul MEDIA Plus von DQ-Kollagen I: Kollagen I-Matrix.
- Unter Verwendung eines 100-ul Mikropipette sorgfältig Pipette und verteilt 70 ul von Fibroblasten: DQ-Kollagen I: Kollagen I-Matrix über die gesamte Oberfläche jedes Deckglas und lassen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator ohne CO 2 für 30 min zu verfestigen.
- Transfer-35-mm-Schalen mit Deckgläsern bis 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 für 10 min ins Gleichgewicht kommen.
- Entfernen von Inkubator und lassen Sie die 35 mm-Schalen unter der Haube, bis sie auf Raumtemperatur kommen.
- In 60 ul von DQ-Kollagen IV: RBM-Matrix auf der Oberseite des erstarrten DQ-Kollagen I: Kollagen I Matrix mit eingebetteten Fibroblasten. Mit Pipettenspitze, ca.refully verbreiten DQ-Kollagen IV: RBM Matrix gleichmäßig und vermeidet Kratzer auf der Fibroblasten: DQ-Kollagen I: Kollagen I-Matrix.
- Transfer-35-mm-Schalen mit Deckgläsern bis 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 für 10 min zu verfestigen. Während die DQ-Kollagen IV: RBM Matrix wird Erstarren trypsinieren und zählen Epithelzellen.
- RBM Matrix: Platz 50 ul einer epithelialen / Tumor Zellsuspension auf Deckgläsern mit DQ-Kollagen IV beschichtet. Platz 35-mm-Schalen mit den Deckgläschen in eine 37 ° C Inkubator. Erlauben Sie 40 bis 60 min für die Zellen, um zu DQ-Kollagen IV anhängen: RBM-Matrix. Für die langfristige Kokulturen in den 2 und 3 dargestellt, verwenden wir 2500 Epithel oder Tumorzellen.
- 2 ml Kulturmedium mit 2% rBM zu jedem 35-mm-Schale. Wenn Sie jegliche medikamentöse Behandlungen, sollten die Medikamente in dieser Zeit hinzugefügt werden.
- Inkubieren gewünschten Zeit vor der Bildgebung. Für die langfristige Kulturen, Medien sollten alle 3-4 Tage gewechselt werden. Die Zellen aufrechterhalten werden kannin ihrer normalen Kulturmedium. Für MAME Kokulturen von Brust-Zelllinien verwenden wir Epithelial Basal Medium (MEBM-PRF) mit MEGM SingleQuots ergänzt.
3. Führen 4D (3D + Zeit) Imaging an lebenden MAME Kokulturen durch konfokale Mikroskopie
- Für den Proof-of-Prinzip Studien dargestellt, wurden MAME Kokulturen mit einem fluoreszierenden Farbstoff Zelle Tracking gemäß unserer öffentlichen Verfahren 1 bezeichnet. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Co-Kulturen mit 5 uM CellTracker Orange MEGM Weg für 45 min bei 37 ° C-Inkubator inkubiert, gewaschen mit PBS gewaschen und mit vorgewärmtem MEGMmedium für 30 min bei 37 ° C mit 5% CO 2-Inkubator vor dem Belichten .
- Bild MAME Kokulturen leben bei niedriger Vergrößerung (10X, Wasser Eintauchen Linse) auf einem Zeiss LSM 510 META-konfokalen Mikroskop.
- Optische Schnitte in Intervallen in der gesamten Tiefe der Struktur erfasst. Für unsere Studien, erfassen wir optische Schnitte bei 10um Intervalle.
- Verwenden Sie optische Schnitte, um Bilder in 3D zu rekonstruieren. Wir verwenden Endgeschwindigkeit, Software, um 3D-Rekonstruktionen zu erzeugen.
- Machen Sie Filme von den 3D-Rekonstruktionen, so dass Strukturen, Zell: Zell-Interaktionen und Wechselwirkungen mit der umgebenden Matrix visualisiert werden können. Wir haben Filme mit Quiktime Player 7.
4. Repräsentative Ergebnisse
Das MAME Kokulturen, die wir entwickelt sind eine gefügig experimentelles Modell für Live-Cell-Imaging in Echtzeit von Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen zellulären Bestandteilen, die eine Brust-Tumor und dessen Mikroumgebung umfassen. Hier zeigen wir die Fähigkeit des MAME Modelle zu Zelle rekapitulieren: Zell-Interaktionen während der Brustkrebs-Progression und von lebenden Zellen, um diese Interaktionen über die Zeit zu folgen. Wir zeigen die Fähigkeit, Bild-Wechselwirkungen zwischen einem präinvasive MCF10.DCIS menschlichen Brust-Zelllinie und eine menschliche Brustkrebs-assoziierten Fibroblasten-Linie, WS-12TI, überein Zeitraum von mehr als drei Wochen in Kultur. Die Co-Kulturen wurden bei 3, 16 und 23 Tage abgebildet. Optische Schnitte durch das gesamte Volumen der Co-Kulturen wurden in 3D und repräsentative Beispiele rekonstruiert werden für jede der drei Zeitpunkten in 2 gezeigt. Die rote Fluoreszenz in 2 stellt den MCF10.DCIS und WS-12TI Zellen. Um zwischen den beiden Zelltypen und für die langfristige Kokulturen zu diskriminieren, kann man transfizieren oder transduzieren einzelnen Zelltypen mit fluoreszierenden Proteinen vor der Gründung der Kulturen. Ein MAME Kokultur MCF10.DCIS und WS-12TI Zellen, die unterschiedlich mit fluoreszierenden Proteinen für die Identifikation markiert ist in 3 dargestellt.
Durch die Integration von Substraten, in diesem Fall DQ-Kollagen, in die MAME Kokulturen, können wir bewerten und zu quantifizieren Veränderungen über die Zeit bei der Proteolyse mit Übergang in einem invasiven Phänotyp assoziiert. Wir haben Methoden zur Quantifizierung der fluoreszierenden Spaltprodukte nachgewiesen, dass Ergebnisvon DQ-Kollagenabbau 2,3. Wir normalisieren Abbauprodukte in der gesamten 3D-Volumen des MAME Kokulturen auf einer Basis pro Zelle durch Markierung und Zählung Zellkerne. Darüber hinaus können wir lokalisieren den Abbau der extrazellulären und intrazellulären Kompartimenten und Quantifizierung der gesamten, intra-und extrazellulären Abbauprodukten wie wir zuvor 2 beschrieben. Die grüne Fluoreszenz in den 2 und 3 für Spaltprodukte der beiden DQ-Kollagen Substrate. Zu diesem Zeitpunkt sind differentiell-markierten Kollagene nicht zur Verfügung, würde uns erlauben, zwischen Abbau von Kollagen Typ IV und dem Abbau von Kollagen Typ I zu unterscheiden.
Die Interaktionen in der MAME Kokulturen sind dynamisch und können im Laufe der Zeit ändern. Um zeitliche und dynamische Informationen zu erhalten, kann die gleiche Sichtfeld bebilderten und optische Schnitte durch die gesamte Probe des Volumens wiederholt über einen Zeitraum von Minuten bis zu Wochen verabreicht werden,somit das Sammeln von Daten in 4-D. In Abbildung 2 zeigen wir ziemlich dramatischen Veränderungen, die mehr als 23 Tagen auftreten: Veränderungen in der Zellzahl, Zellmigration und Zell-Interaktionen, Struktur Bände, Struktur Formen, Abweichungen der Strukturen von der Kugelgestalt, invasive Auswüchse und Proteolyse. Darüber hinaus demonstrieren wir auch eine allgemeine Veränderung des Volumens aufgrund der MAME Kokulturen Beeinträchtigung der umgebenden extrazellulären Matrix in diesem Zeitraum. An drei Tagen in 2A dargestellt, ist das Volumen um 110.000 3. Im Gegensatz dazu ist das Volumen des MAME Kokulturen bei 16 und 23 Tage nur 46.250 um 3, wie in den 2B und C dargestellt
Abbildung 1. Schematische Darstellung der MAME Kokulturen. Kunststoff-Deckglas wird mit Kollagen I überzogen, mit einem DQ-Kollagen I und Fibroblasten (Magenta). Eine zweite Schicht aus rekonstituierten Basalmembran (rBM) mit DQ-collagen IV wird angefügt. Tumorzellen (rot) sind auf der Oberseite ausplattiert und 2% RBM in Kulturmedien ist überlagert (weiße Punkte) mit jedem Wechsel der Medien. Grün steht für die fluoreszierenden Spaltprodukte des DQ-Kollagen I und IV.
Abbildung 2. MAME Kokulturen von MCF10.DCIS menschlichen Brust Zellen und WS-12TI menschlichen Brust Fibroblasten. Die Fibroblasten wurden in Kollagen I / DQ-Kollagen I und überlagert mit RBM mit DQ-Kollagen IV eingebettet. Die DCIS Zellen wurden dann auf der rBM überlagert und mit Medien, die 2% rBM ausgesät. In den 23 Tage in Kokultur hier dargestellten es Zellproliferation, die Degradation der DQ-Kollagen IV und I (grün) und Kollagen-Matrices wie durch die Reduzierung des Volumens des Co-Kulturen angegeben. Die Zellen wurden durch Markierung mit CellTracker Orange in situ vor der Bildgebung (rot) lokalisiert. Die gleichen Live-Co-Kulturen wurden im Laufe der 23 Tage mit Bildern von C eingefangen beobachtetonfocal Mikroskopie bei 3, 16 und 23 Tagen der Kokultur. Die sich daraus ergebenden optischen Scheiben wurden in 3D mit Endgeschwindigkeit, Software rekonstruiert. Vergrößerung, 10X.
Abbildung 3. MAME 16 Tage Kokulturen von MCF10.DCIS menschlichen Brust Zellen und WS-12TI menschlichen Brust, dass Fibroblasten Express RFP (rot) und YFP (weiß) sind. Kokulturen wurden hergestellt und analysiert wie in 2. Die beiden Zelltypen hier gezeigt hatte, wurden jedoch unterschiedlich, so dass sie voneinander unterschieden werden könnten beschriftet. Die Bilder mit höherer Vergrößerung in dieser Figur, um den in 2 verglichen, zeigen Proteolyse von DQ-Kollagen IV an der Oberfläche der Zellen und DCIS diffuse Proteolyse von DQ-Kollagen I in Bereichen nahe den Fibroblasten. Vergrößerung, 20X.
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Discussion
Wie gezeigt, kann die MAME Kokulturen für Live-Cell-Imaging in Echtzeit von Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen zellulären Bestandteilen, die eine Brust-Tumor und dessen Mikroumgebung umfassen verwendet werden. In laufenden Studien in unserem Labor haben wir MAME Kokulturen verwendet werden, um proteolytische Stoffwechselwege mit Übergang von DCIS zu einem invasiven duktalen Karzinoms verbunden sind, sowie die Wechselwirkungen zwischen proteolytische Stoffwechselwege und andere Wege in diesem Übergang, wie Chemokin / Zytokin / growth factor Signalwege beteiligt sind . Weiterhin konnte gezeigt werden, dass MAME Modelle als Werkzeug zum Screenen der Auswirkungen von niedermolekularen Inhibitoren, blockierende Antikörper oder shRNAs die proteolytische / Chemokin / Cytokin / Wachstumsfaktor Wege 3-5 modulieren könnten verwendet werden. Das MAME-Modelle können für Live-Cell-Imaging von Tumorwachstum, Invasion und Proteolyse über Zeiten im Bereich von Minuten und Stunden verwendet werden, wie wir zuvor 6,7 haben gezeigt, zu Woche, wie hier dargestellt in den Abbildungen 2 und 3. DieWechselwirkungen beobachtet werden zwischen den Zellen einer Spezies, dh der menschlichen Tumorzellen und Tumor-assoziierte Zellen, anstatt zwischen menschlichen Tumorzellen und Maus Stromazellen nach intravitales Imaging 8. Das MAME-Modelle sind ein System handhabbar. Moleküle von Interesse kann herunterreguliert mit shRNAs in einzelnen Zelltypen vor Cokultivierung so dass ihr Beitrag in diesem Zelltyp zu einer Verschlechterung der DQ-Kollagen abgebildet und quantifiziert werden 3D 2. Konditionierten Medien von MAME-Modelle können Proben entnommen, um Veränderungen in der Sekretion von Proteasen, Zytokine, etc. zu messen Die erhaltenen Informationen stellt eine experimentelle Grundlage für die Prüfung der Auswirkungen von niedermolekularen Inhibitoren, blockierende Antikörper, etc.
Die zelluläre Zusammensetzung der MAME Kokulturen können leicht manipuliert werden, so dass man sie verwenden kann, um den Beitrag der anderen Zelltypen in der Tumor-Mikroumgebung (z. B. Myoepithelzellen, Monozyten, Endothelzellen der Blut gefunden zu bewertenGefäß-und Lymphsystem Herkunft) zur malignen Progression 6,7. Die Anzahl der verschiedenen Zelltypen entkernt, das Verhältnis von einer Zelle zu einem anderen, die Länge der Zeit in der Kultur wird durch die spezifischen Zelltypen und der experimentelle Frage abhängen. MAME Modellen kann auch erweitert werden, um die Effekte von Veränderungen in der Mikroumgebung der Brusttumoren, z. B. pH, Sauerstoff-Partialdruck zu beurteilen. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass, wenn MAME Kulturen bei einem leicht sauren pH-Wert, dh, pH 6,8 gehalten werden, gibt es eine Zunahme bei der Proteolyse und Invasivität. Darüber hinaus haben wir auch gezeigt, dass wir ähnliche Kokulturen verwenden, um andere Krebsarten wie Prostata-Krebs zu versehen.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS und KRM). Live-Cell-Imaging wurde in der Mikroskopie, Imaging-und Ressourcen-Core unterstützt Zytometrie durchgeführt, zum Teil, von NIH-Center Zuschuss P30 CA22453 dem Karmanos Cancer Institute, Wayne State University und von der Perinatologie Research Branch des National Institute of Child Health and Development , Wayne State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | Phenol red-free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
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