Summary
Hemos desarrollado modelos 3D para el cocultivo de células vivas imágenes en tiempo real de las interacciones entre las células tumorales de mama y otras células en el microambiente que afectan la progresión a un fenotipo invasivo. Estos modelos pueden servir como pantallas preclínicos de los medicamentos que se dirigen a paracrinos inducidos por las vías proteolíticas, quimiocinas / citocinas y la quinasa implicados en la invasión.
Abstract
Hemos desarrollado modelos 3D co-cultivo, que llamamos MAME (m ammary un RQUITECTURA m NGENIERÍA icroenvironment e), y los utiliza para imágenes en vivo de las células en tiempo real de células: las interacciones celulares. Nuestro objetivo general fue desarrollar modelos que recapitular la arquitectura de las lesiones preinvasoras del seno para estudiar su progresión a un fenotipo invasivo. Específicamente, hemos desarrollado modelos para analizar las interacciones entre premalignas variantes de células epiteliales de mama y otros tipos de células del microambiente del tumor que han sido implicados en la mejora o reducción de la progresión de las células epiteliales de mama preinvasoras a carcinomas ductales invasivos. Otros tipos de células estudiadas hasta la fecha son las células mioepiteliales, fibroblastos, macrófagos y la sangre y las células endoteliales microvasculares linfáticos. Además de los modelos de MAME, que están diseñados para recapitular las interacciones celulares en el pecho durantela progresión del cáncer, hemos desarrollado modelos comparables de la progresión de los cánceres de próstata.
Aquí se ilustran los procedimientos para establecer los cocultivos 3D junto con el uso de imágenes en vivo de células y un ensayo de proteolisis funcional para seguir la transición de cocultivos de carcinoma ductal in situ (CDIS) y fibroblastos células a un fenotipo invasivo en el tiempo, en este caso más de veinte y tres días de cultivo. El co-cultivos MAME consisten en varias capas. Los fibroblastos están incrustadas en la capa inferior de colágeno de tipo I. En que se coloca una capa de membrana basal reconstituida (RBM) en el cual las células se siembran DCIS. Una capa final de la parte superior del 2% RBM se incluye y se repone con cada cambio de los medios de comunicación. Para la proteólisis de la imagen asociada con la progresión a un fenotipo invasivo, se utiliza proteínas fluorescentes de tinte enfriadas (DQ) de la matriz (DQ-colágeno I mezclado con la capa de colágeno I y IV DQ-colágeno mezclado con la capa media de rBM) y observar a las culturas vivas mediante microscopía confocal. Secciones ópticas son capturados, procesados y reconstruido en 3D con el software de visualización de Volocity. En el transcurso de 23 días en cocultivos MAME, las células proliferan y DCIS se unen en grandes estructuras invasivas. Los fibroblastos migran y se incorporan a estas estructuras invasivas. Fluorescentes fragmentos proteolíticos de los colágenos se encuentran en asociación con la superficie de las estructuras DCIS, intracelularmente, y también dispersa por toda la matriz circundante. Los medicamentos que las vías proteolíticas objetivo, quimiocinas / citocinas y la quinasa o modificaciones en la composición celular de la co-cultivos pueden reducir la invasividad, lo que sugiere que los modelos de MAME se puede utilizar como pantallas preclínicos de nuevos enfoques terapéuticos.
Protocol
1. Preparar DQ-sustratos
- Permitir liofilizó DQ-sustratos calentar a temperatura ambiente antes de la apertura de viales, preparar la solución madre de 1 mg / ml de DQ-sustrato en agua desionizada, se dividen en 50 ml de alícuotas y se almacena a 4 ° C.
Puede ser necesario agitar DQ-sustrato en un baño de agua ultrasónico durante ~ 5 minutos y se calienta a 50 ° C para facilitar la dispersión.
- RBM Descongelar en hielo durante la noche a 4 ° C; RBM debe ser manejado en hielo en todo momento.
- Para hacer fosfato 10X tamponado salino (PBS), se disuelven 80 g de NaCl (1,37 M), 2 g de KCl (0,027 M), 14,4 g de Na 2 HPO 4 (1 M) y 2,4 g de KH 2 PO 4 (0,02 M) en 800 ml de agua ultrapura. Ajustar el pH de la solución tampón PBS a 7,4 con 1,0 M de HCl. Aumentar el volumen hasta 1 litro, esterilizar por filtración.
- Preparar colágeno solución I sobre hielo: 8 partes de colágeno refrigerados I de 1 parte de refrigerados 10X PBS. Ajustar el pHde mezcla a 7.2-7.6 usando estéril 0,1 M de NaOH. Verificar el pH con tiras de pH y ajustar el volumen final a 10 partes con agua estéril.
- Preparar DQ-colágeno I: colágeno I matriz mediante la dilución de DQ-colágeno I en colágeno I solución en un tubo previamente enfriado a una concentración final de 25 mg / ml y 2,4 mg / ml, respectivamente.
- Preparar DQ-colágeno IV: membrana basal reconstituida (GBR) matriz mediante la dilución de DQ-colágeno IV en la GBR (Cultrex o Matrigel) en un tubo previamente enfriado a una concentración final de 25 mg / ml y 12-15 mg / ml, respectivamente. Mezcle el hielo con pipeteo suave para evitar la creación de burbujas.
2. Preparar cocultivos MAME
Véase la Figura 1 para un diagrama esquemático de cocultivos.
- Coloque dos cubreobjetos de plástico rectangulares (esterilizada en alcohol al 70% durante 10 minutos y se seca al aire) en una placa de cultivo de 35 mm o utilizar un ibiTreat de 35 mm μ-Dish. Llegar aquí son para los dos cubreobjetos y u-Dishes, que utilizamos para estudiantesmuere en un microscopio vertical. Para los estudios en un microscopio invertido, sólo usamos μ de platos.
- Mezclar el número deseado de fibroblastos con DQ-colágeno I: colágeno I matriz. Para los cocultivos largo plazo ilustradas en las Figuras 2 y 3, se utiliza 500 fibroblastos en 10 l de medios más 60 l de DQ-colágeno I: colágeno I de la matriz.
- Usando una micropipeta 100-l, y se extendió cuidadosamente pipeta 70 l de fibroblastos: DQ-colágeno I: colágeno I matriz sobre la superficie entera de cada cubreobjetos y dejar a 37 ° C en un incubador humidificado sin CO 2 durante 30 minutos para solidificar.
- Transferencia de 35-mm platos que contienen cubreobjetos a 37 ° C incubadora con 5% de CO 2 durante 10 min para equilibrar.
- Eliminar de la incubadora y dejar los platos de 35 mm bajo el capó hasta que llegue a temperatura ambiente.
- Añadir 60 l de DQ-colágeno IV: GBR matriz en la parte superior de la solidificado DQ-colágeno I: colágeno I matriz con fibroblastos embebidos. Con punta de la pipeta, carefully extendió DQ-colágeno IV: GBR matriz de manera uniforme, evitando rayar los fibroblastos: DQ-colágeno I: colágeno I de la matriz.
- Transferencia de 35-mm platos que contienen cubreobjetos a 37 ° C incubadora con 5% de CO 2 durante 10 minutos para solidificar. Mientras que el IV DQ-colágeno: GBR matriz se solidifica, trypsinize y contar las células epiteliales.
- Colocar 50 l de una suspensión de células epiteliales / tumoral sobre cubreobjetos revestidos con DQ-colágeno IV: GBR matriz. Coloque de 35 mm platos que contienen los cubreobjetos en una incubadora a 37 ° C. Permitir 40 a 60 minutos para que las células se adhieren a DQ-colágeno IV: GBR matriz. Para los cocultivos largo plazo ilustradas en las Figuras 2 y 3, se utiliza 2500 células epiteliales o tumor.
- Añadir 2 ml de medio de cultivo que contiene 2% RBM a cada plato de 35 mm. Si al hacer los tratamientos de drogas, los medicamentos se debe agregar en este momento.
- Incubar durante período de tiempo deseado antes de imágenes. Para cultivos a largo plazo, los medios de comunicación debe ser cambiado cada 3-4 días. Las células se pueden manteneren su medio de cultivo normal. Para cocultivos MAME de mama líneas celulares, se utiliza medio basal del epitelio (MEBM-PRF), complementado con SingleQuots MEGM.
3. Realizar 4D (3D + tiempo) de la imagen en vivo cocultivos MAME por microscopía confocal
- Para los estudios de prueba de principio ilustrado, cocultivos MAME fueron marcadas con un colorante fluorescente de la célula de seguimiento de acuerdo a nuestro procedimiento publicado 1. Después de lavar con PBS, se incubaron con cocultivos 5 Naranja CellTracker mM en el medio MEGM durante 45 minutos en una incubadora a 37 ° C, se lavó de nuevo con PBS y se incubaron con MEGMmedium precalentado durante 30 minutos en 37 ° C con 5% de CO 2 incubadora antes de imágenes .
- Imagen cocultivos MAME en vivo en un bajo aumento (10X, inmersión en agua) en un microscopio Zeiss LSM 510 META confocal.
- Secciones ópticas son capturados en intervalos a lo largo de toda la profundidad de las estructuras. Para nuestros estudios, podemos capturar secciones ópticas a las 10intervalos m.
- Utilice las secciones ópticas para la reconstrucción de imágenes en 3D. Utilizamos el software Volocity para generar reconstrucciones en 3D.
- Hacer películas de las reconstrucciones en 3D de manera que las estructuras, de células: las interacciones celulares y las interacciones con las matrices de los alrededores se pueden visualizar. Hemos hecho películas con el Reproductor de Quiktime 7.
4. Los resultados representativos
El co-cultivos de MAME que hemos desarrollado son un modelo manejable experimental para imágenes en vivo de las células en tiempo real de las interacciones entre los diversos componentes celulares que forman un tumor de mama y su microambiente. Aquí se demuestra la capacidad de los modelos de MAME para recapitular la célula: las interacciones celulares durante la progresión del cáncer de mama y de células vivas de imágenes para seguir las interacciones a través del tiempo. Se ilustra la capacidad de las interacciones de imagen entre una línea de preinvasiva MCF10.DCIS de células humanas de mama y un cáncer de mama humano asociado a la línea de fibroblastos, WS-12Ti, a lo largoun período de más de tres semanas en cultivo. El co-cultivos fueron visualizados a los 3, 16 y 23 días. Secciones ópticas a través de todo el volumen de la cocultivos fueron reconstruidas en 3D y ejemplos representativos se muestran para cada uno de los tres puntos de tiempo en la Figura 2. La fluorescencia roja en la Figura 2 representa el MCF10.DCIS y células de WS-12TI. Para discriminar entre los dos tipos de células y de largo plazo co-cultivos, se puede transfectar o transducción de los distintos tipos de células con proteínas fluorescentes previo al establecimiento de los cultivos. Un cocultivo de las células MAME MCF10.DCIS y WS-12Ti que están diferencialmente marcadas con proteínas fluorescentes para la identificación se ilustra en la Figura 3.
Por incorporación de sustratos, en este caso DQ-colágeno, en la co-cultivos de MAME, podemos evaluar y cuantificar los cambios en el tiempo en la proteólisis asociados con la transición a un fenotipo invasivo. Hemos establecido los métodos para la cuantificación de los productos de su desdoblamiento fluorescentes que dan como resultadode DQ-colágeno degradación 2,3. Nos normalizar los productos de degradación a lo largo de todo el volumen 3D de la cocultivos MAME en una base por célula mediante el etiquetado y contando los núcleos celulares. Además, se puede localizar la degradación de los compartimentos intracelulares y extracelulares y cuantificar el total de productos, la degradación intracelular y extracelular, como hemos descrito anteriormente 2. La fluorescencia verde en las figuras 2 y 3 representa productos de escisión de los dos sustratos de colágeno-DQ. En este momento, colágenos diferencialmente marcados no están disponibles que nos permiten distinguir entre la degradación del colágeno tipo IV y la degradación del colágeno tipo I.
Las interacciones en el cocultivos MAME son dinámicos y pueden cambiar con el tiempo. Para obtener información temporal y dinámico, el mismo campo de visión puede ser secciones con imagen y ópticas tomadas a través de la muestra completa del volumen repetidamente durante un período de tiempo de minutos a semanas,por lo tanto la recolección de datos en 4-D. En la figura 2, que ilustran los cambios más dramáticos que se producen más de 23 días: los cambios en el número de células, la migración celular y las interacciones celulares, los volúmenes de la estructura, las formas de la estructura, las desviaciones de las estructuras de esfericidad, excrecencias invasivos y proteólisis. Por otra parte, también demuestran un cambio general en el volumen debido a la co-cultivos MAME degradantes de la matriz extracelular que rodea a su durante este período. A los tres días como se ilustra en la Figura 2A, el volumen es 110.000 m 3. En contraste, el volumen de la cocultivos MAME menos 16 y 23 días es sólo 46.250 m 3, como se ilustra en las figuras 2B y C.
Figura 1. Diagrama esquemático de cocultivos MAME. Cubreobjetos de plástico se recubre con colágeno I, que contiene DQ-colágeno I y fibroblastos (Magenta). Una 2 ª capa de membrana basal reconstituida (RBM), que contiene DQ-collagen IV se añade. Las células tumorales (rojo) se colocan en la parte superior y el 2% en la cultura de gestión basada en los medios de comunicación se superpone (puntos blancos) con cada cambio de los medios de comunicación. El verde representa los productos de desdoblamiento fluorescentes de DQ-colágeno I y IV.
Figura 2. MAME cocultivos de células MCF10.DCIS de mama humanos y WS-12TI fibroblastos humanos de mama. Los fibroblastos fueron incorporados en el colágeno I / DQ-colágeno I y cubierta con GBR contiene DQ-colágeno IV. Las células de DCIS fueron sembradas en la gestión por resultados y recubierta con un medio que contiene 2% de la RBM. Durante los 23 días en cocultivo ilustrados aquí, hubo proliferación celular, la degradación de DQ-colágeno IV y I (verde) y las matrices de colágeno, como se indica por la reducción en el volumen de la cocultivos. Las células fueron localizados por el etiquetado con Orange CellTracker in situ antes de la imagen (rojo). Los co-cultivos vivos mismas se observaron durante los 23 días con las imágenes captadas por cmicroscopia onfocal a los 3, 16 y 23 días de cocultivo. Los cortes resultantes ópticos fueron reconstruidas en 3D con el software de Volocity. El aumento, 10 veces más.
Figura 3. MAME 16 días cocultivos de células MCF10.DCIS de mama humanos y WS-12TI fibroblastos humanos de mama que expresan RFP (rojo) y YFP (blanco), respectivamente. Cocultivos se establecieron y se analizó como en la Figura 2. Los dos tipos de células que se muestran aquí había, sin embargo, ha diferencialmente etiquetados de modo que pudieran ser distinguidos unos de otros. Las imágenes de aumento mayor en esta figura, en comparación con las de la figura 2, ilustran la proteolisis de DQ-colágeno IV en la superficie de las células DCIS y proteolisis difusa de DQ-colágeno I en las zonas cercanas a los fibroblastos. Ampliación, 20X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Como se ha demostrado, la cocultivos MAME puede ser utilizado para vivo de células de imágenes en tiempo real de las interacciones entre los diferentes constituyentes celulares que comprenden un tumor de mama y su microambiente. En los estudios en curso en nuestro laboratorio, hemos utilizado cocultivos MAME para identificar las vías proteolíticas asociadas con la transición de carcinoma ductal in situ de carcinoma ductal invasivo, así como las interacciones entre las vías proteolíticas y otras vías que participan en esta transición, tales como las vías de los factores de quimiocinas / citocinas / crecimiento . Se mostró además que los modelos MAME podría ser utilizado como una herramienta para la detección de los efectos de los inhibidores de moléculas pequeñas, bloqueando anticuerpos o shRNAs que modulan proteolítica / quimioquinas / citoquina / crecimiento vías factor 3-5. Los modelos MAME puede utilizarse para formación de imágenes en vivo de células de crecimiento del tumor, la invasión y la proteólisis durante tiempos que van desde minutos y horas, como se ha mostrado previamente 6,7, a semanas como se ilustra aquí en las figuras 2 y 3. Lainteracciones siendo observados son entre las células de una especie, es decir, las células tumorales humanas y células asociados a tumores, en lugar de entre las células tumorales humanas y células de ratón del estroma como en intravital imagen 8. Los modelos MAME son un sistema manejable. Las moléculas de interés puede ser downregulated con shRNAs en tipos de células individuales antes de la co-cultivo de modo que su contribución en ese tipo de célula a la degradación de DQ-colágenos pueden ser reflejados y se cuantifica en 3D 2. Acondicionado medios de comunicación de los modelos de MAME pueden ser degustados para medir los cambios en la secreción de proteasas, citoquinas, etc La información obtenida ofrece una base experimental para probar los efectos de inhibidores de moléculas pequeñas, el bloqueo de los anticuerpos, etc
La composición celular de los co-cultivos MAME puede ser fácilmente manipulada de modo que uno puede utilizar para evaluar la contribución de otros tipos de células se encuentran en el microambiente del tumor (por ejemplo, células mioepiteliales, monocitos, células endoteliales de sangrebuque y origen linfático) a la progresión maligna 6,7. El número de los diversos tipos de células sembradas, la relación de un tipo de célula a otra, y la duración del tiempo en cultivo dependerá de los tipos de células específicos utilizados y la cuestión experimental. Modelos MAME se puede extender también para evaluar los efectos de los cambios en el microambiente que rodean a los tumores de mama, por ejemplo, pH, tensión de oxígeno. Por ejemplo, hemos demostrado que cuando los cultivos MAME se mantiene a un pH ligeramente ácido, es decir, pH 6,8, hay un aumento en la proteolisis y la invasividad. Además, también hemos demostrado que podemos utilizar cocultivos similares a modelar otros tipos de cáncer como el cáncer de próstata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud R01 CA131990 (BFS y MRR). En vivo de células de imágenes se realizó en el Núcleo de Microscopía, imágenes y Citometría de Recursos apoyada, en parte, por el NIH Centro de concesión P30 CA22453 del Instituto Karmanos del Cáncer, Universidad Estatal de Wayne y por la Sección de Investigación de Perinatología del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo , Wayne State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | Phenol red-free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
