Summary
Vi har utviklet 3D coculture modeller for levende celle bildebehandling i sanntid av interaksjoner mellom bryst tumorceller og andre celler i mikromiljøet deres som påvirker progresjon til en invasiv fenotype. Disse modellene kan tjene som prekliniske skjermer for narkotika å målrette parakrine-indusert proteolytiske og chemokine / cytokin og kinase stier involvert i invasivitet.
Abstract
Vi har utviklet 3D coculture modeller, som vi kaller MAME (m ammary en rchitecture og m icroenvironment e ngineering), og brukte dem til live-celle bildebehandling i sanntid av celle: celle interaksjoner. Vårt overordnede mål var å utvikle modeller som rekapitulere arkitekturen av preinvasive bryst lesjoner å studere deres progresjon til en invasiv fenotype. Konkret har vi utviklet modeller for å analysere samspill mellom pre-maligne bryst epiteliale celler varianter og andre celletyper av svulsten mikromiljøet som har vært innblandet i styrke eller redusere progresjon av preinvasive bryst epitelceller til invasive duktale karsinomer. Andre celletyper studert hittil er korgcellene, fibroblaster og makrofager og blod og lymfatiske mikrovaskulære endotelceller. I tillegg til Mame modellene som er utviklet for å rekapitulere de cellulære interaksjoner i brystet underkreft progresjon, har vi utviklet sammenlignbare modeller for utviklingen av prostatakreft.
Her har vi illustrere prosedyrene for å etablere 3D cocultures sammen med bruk av live-celle bildebehandling og en funksjonell proteolyse analysen å følge overgangen cocultures av brystkreft duktalt carcinoma in situ (DCIS) celler og fibroblaster til en invasiv fenotype over tid, i dette tilfellet over tjue-tre dager i kultur. Den MAME cocultures består av flere lag. Fibroblaster er innebygd i bunnlaget av type I kollagen. På den er plassert et lag av rekonstituert basalmembran (RBM) som DCIS celler blir seedet. En endelig øverste laget av 2% RBM er inkludert og fylles med hver endring av media. Slik image proteolyse tilknyttet progresjon til en invasiv fenotype, bruker vi dye-let (DQ) fluorescerende matrix proteiner (DQ-collagen jeg blandet med lag av kollagen I og DQ-kollagen IV blandet med midten laget av RBM) og observere levende kulturer bruker konfokalmikroskopi. Optiske seksjoner er fanget, behandlet og rekonstruert i 3D med Volocity visualisering programvare. I løpet av 23 dager i MAME cocultures, de DCIS cellene sprer og coalesce i store invasive strukturer. Fibroblaster migrerer og blir innlemmet i disse invasive strukturer. Fluorescent proteolytiske fragmenter av bindevevet er funnet i sammenheng med overflaten av DCIS strukturer, intracellulært, og også spredt over hele den omkringliggende matrise. Legemidler som mål proteolytisk, chemokine / cytokin og kinase pathways eller modifikasjoner i mobilnettet sammensetningen av cocultures kan redusere invasivitet, som tyder på at Mame modellene kan brukes som prekliniske skjermer for nye terapeutiske tilnærminger.
Protocol
1. Forbered DQ-underlag
- Tillat lyofilisert DQ-underlag varmes opp til romtemperatur før åpning ampuller, forberede stamløsning av 1 mg / ml DQ-substrat i avionisert vann, dele inn 50 mL alikvoter og oppbevares ved 4 ° C.
Det kan være nødvendig å agitere DQ-substrat i en ultrasonisk vannbad for ~ 5 min og varme til 50 ° C for å lette spredning.
- Tine RBM på is natten ved 4 ° C; RBM skal håndteres på is til alle tider.
- For å gjøre 10X fosfatbufret saltvann (PBS), oppløse 80 g NaCl (1,37 M), 2 g KCl (0,027 M), 14,4 g Na 2 HPO 4 (1 M), og 2,4 g KH 2 PO 4 (0,02 M) i 800 ml ultrarent vann. Juster pH PBS buffer løsning til 7,4 med 1,0 M HCl. Bring volum til 1 liter, sterilisere ved filtrering.
- Forbered kollagen Jeg løsning på is: 8 deler av kjølt kollagen jeg til en del av kjølt 10X PBS. Juster pHav blandingen til 07.02 til 07.06 med steril 0,1 M NaOH. Sjekk pH med pH strips og justere den endelige volumet til 10 deler med sterilt vann.
- Forbered DQ-kollagen I: kollagen jeg matrisen ved å fortynne DQ-kollagen jeg i kollagen jeg løsningen i en prechilled rør til en endelig konsentrasjon på 25 mikrogram / ml og 2,4 mg / ml, henholdsvis.
- Forbered DQ-kollagen IV: rekonstituert basalmembran (RBM) matrise ved å fortynne DQ-kollagen IV i RBM (Cultrex eller Matrigel) i en prechilled rør til en endelig konsentrasjon på 25 mikrogram / ml og 12-15 mg / ml, henholdsvis. Bland på is med mild pipettering å unngå å skape bobler.
2. Forbered MAME cocultures
Se figur 1 for en prinsippskisse av cocultures.
- Place to rektangulære plast Dekkglass (sterilisert i 70% alkohol i 10 min og lufttørket) i et 35-mm kultur parabolen, eller bruke en IbiTreat 35-mm μ-oppvask. Veibeskrivelse her er både Dekkglass og Mju-retter, som vi bruker for studør på en oppreist mikroskop. For studier på en invertert mikroskop, bruker vi bare Mju-retter.
- Bland ønsket antall fibroblaster med DQ-kollagen I: kollagen jeg matrise. For de langsiktige cocultures illustrert i figur 2 og 3, bruker vi 500 fibroblaster i 10 mL av media pluss 60 mL av DQ-kollagen jeg: kollagen jeg matrix.
- Ved hjelp av en 100-mL micropipettor, nøye pipette og spre 70 mL av fibroblast: DQ-kollagen I: kollagen jeg matrise over hele overflaten av hvert dekkglass og la ved 37 ° C i en fuktet inkubator uten CO 2 i 30 min å stivne.
- Transfer 35-mm retter som inneholder Dekkglass til 37 ° C inkubator med 5% CO 2 for 10 min skal stabilisere seg.
- Fjern fra inkubator og la 35-mm retter under panseret før de kommer til romtemperatur.
- Legg 60 mL av DQ-kollagen IV: RBM matrise på toppen av størknet DQ-kollagen I: kollagen jeg matrise med innebygde fibroblaster. Med pipettespissen, carefully spre DQ-kollagen IV: RBM matrise jevnt, unngå riper i fibroblast: DQ-kollagen I: kollagen jeg matrise.
- Transfer 35-mm retter som inneholder Dekkglass til 37 ° C inkubator med 5% CO 2 i 10 min å stivne. Mens DQ-kollagen IV: RBM matrise solidifying, trypsinize og telle epitelceller.
- Place 50 mL av en epitelial / svulst cellesuspensjon på Dekkglass belagt med DQ-kollagen IV: RBM matrise. Plasser 35 mm-retter som inneholder Dekkglass inn i en 37 ° C inkubator. Tillat 40-60 min for cellene å feste til DQ-kollagen IV: RBM matrise. For de langsiktige cocultures illustrert i figur 2 og 3, bruker vi 2500 epiteliale eller tumor celler.
- Tilsett 2 ml av kultur medium som inneholder 2% RBM til hver 35-mm parabolen. Hvis du gjør noen medikamentelle behandlinger, bør legemidler legges på dette tidspunktet.
- Inkuber i ønsket tid før bildebehandling. For langsiktige kulturer, bør media byttes hver 3-4 dager. Cellene kan opprettholdesi sin normale kultur medium. For MAME cocultures av brystkreft cellelinjer, bruker vi epithelial Basal Medium (MEBM-PRF) supplert med MEGM SingleQuots.
3. Utfør 4D (3D + tid) avbildning av levende MAME cocultures av konfokalmikroskopi
- For proof-of-prinsippet studier illustrerte ble MAME cocultures merket med et fluorescerende celle sporing fargestoff i henhold til våre publiserte prosedyren en. Etter vask med PBS, ble cocultures inkubert med 5 mikrometer CellTracker Orange i MEGM medium for 45 min i en 37 ° C inkubator, vaskes igjen med PBS og inkubert med prewarmed MEGMmedium for 30 min i 37 ° C med 5% CO 2 inkubator før bildebehandling .
- Bilde MAME cocultures leve på en lav forstørrelse (10x, vann dyppe linsen) på en Zeiss LSM-510 META confocal mikroskop.
- Optiske seksjonene er fanget i intervaller gjennom hele dybden av strukturene. For våre studier, fanger vi opp optiske seksjoner ved 10mikrometer intervaller.
- Bruk optiske delene for å rekonstruere bildene i 3D. Vi bruker Volocity programvare til å generere 3D rekonstruksjoner.
- Lag filmer av 3D rekonstruksjoner slik at strukturer, celle: celle interaksjoner og samspill med omkringliggende matrisene kan bli visualisert. Vi laget filmer med QuikTime Player 7.
4. Representative Resultater
Den MAME cocultures at vi utviklet er en medgjørlig eksperimentell modell for levende celle bildebehandling i sanntid av interaksjoner mellom de ulike cellulære bestanddeler som utgjør en brystsvulst og dens mikromiljøet. Her kan vi demonstrere evnen til Mame modeller å rekapitulere celle: celle interaksjoner brystkreft progresjon og live-celle bildebehandling for å følge disse interaksjoner over tid. Vi illustrerer evnen til bildet interaksjoner mellom en preinvasive MCF10.DCIS menneskelig bryst celle linje og en menneskelig brystkreft-assosiert fibroblast linje, WS-12Ti, overen periode på mer enn tre uker i kulturen. Den cocultures ble fotografert på 3, 16 og 23 dager. Optiske seksjoner gjennom hele volumet av cocultures ble rekonstruert i 3D og representative eksempler er vist for hver av de tre tidspunktene i Figur 2. Den røde fluorescens i figur 2 representerer MCF10.DCIS og WS-12Ti celler. Å skille mellom de to celletypene og for langsiktige cocultures, kan man transfektere eller transduce individuelle celletyper med selvlysende proteiner før etablering av kulturer. En MAME coculture av MCF10.DCIS og WS-12Ti celler som er differensielt merket med fluorescerende proteiner for identifisering er illustrert i figur 3.
Ved å innlemme underlag, i dette tilfellet DQ-bindevevet, i MAME cocultures, kan vi vurdere og kvantifisere endringer over tid i proteolyse forbundet med overgangen til en invasiv fenotype. Vi har etablert metoder for å kvantifisere de fluorescerende cleavage produktene på grunnfra DQ-kollagen nedbrytning 2,3. Vi normalisere nedbrytingsprodukter hele 3D-volumet av MAME cocultures på per celle basis ved merking og telling cellekjerner. Videre kan vi lokalisere degradering til ekstracellulære og intracellulære rom og kvantifisere den totale, intracellulære og ekstracellulære nedbrytingsprodukter som vi har beskrevet tidligere to. Den grønne fluorescens i figur 2 og 3 representerer cleavage produkter av de to DQ-kollagen underlag. På denne tiden, differensielt-merket bindevevet er ikke tilgjengelig som ville tillate oss å skille mellom degradering av type IV kollagen og nedbrytning av type I kollagen.
Samhandlingen i MAME cocultures er dynamiske og kan endres over tid. For å oppnå tidsmessig og dynamisk informasjon, kan det samme synsfeltet bli fotografert og optisk seksjoner tatt gjennom hele prøven av volumet gjentatte ganger over en periode fra minutter til uker,dermed samle inn data i 4-D. I Figur 2 illustrerer vi heller dramatiske endringer som skjer over 23 dager: endringer i celle nummer, celle migrasjon og celle interaksjoner, struktur volumer, struktur former, avvik av strukturene fra sphericity, krenkende utvekster og proteolyse. Videre har vi også demonstrere en samlet endring i volum som følge av MAME cocultures nedverdigende deres omkringliggende ekstracellulær matrix over denne tidsperioden. På tre dager som illustrert i figur 2A, er volumet 110 000 mikrometer tre. I kontrast, er volumet av MAME cocultures på 16 og 23 dager bare 46 250 mikrometer 3, som illustrert i figur 2B og C.
Figur 1. Skjematisk diagram av MAME cocultures. Plastic dekkglass er belagt med kollagen I, inneholder DQ-kollagen jeg og fibroblaster (magenta). Et andre lag rekonstituert basalmembran (RBM) inneholder DQ-colLågen IV legges til. Kreftceller (rød) er belagt på toppen og 2% RBM i kultur media er overlappet (hvite prikker) med hver endring av media. Grønn representerer de fluorescerende cleavage produkter av DQ-kollagen I og IV.
Figur 2. MAME cocultures av MCF10.DCIS menneskelige brystkreft celler og WS-12Ti menneskelige brystkreft fibroblaster. De fibroblaster ble innebygd i kollagen I / DQ-kollagen jeg og overlappet RBM inneholder DQ-kollagen IV. De DCIS cellene ble deretter seedet på RBM og overlappet med media som inneholder 2% RBM. Over de 23 dagene i coculture illustrerte her, var det celleproliferasjon, degradering av DQ-kollagen IV og jeg (grønn) og kollagen matriser som indikert av reduksjonen i volumet av cocultures. Celler ble lokalisert ved merking med CellTracker Orange in situ før imaging (rød). De samme live cocultures ble observert over de 23 dagene med bilder tatt av confocal mikroskopi ved 3, 16 og 23 dager med coculture. De resulterende optiske skiver ble rekonstruert i 3D med Volocity programvare. Forstørrelse, 10X.
Figur 3. Mame 16 dagers cocultures av MCF10.DCIS menneskelige brystkreft celler og WS-12Ti menneskelige brystkreft fibroblaster som uttrykker RFP (red) og YFP (hvit), henholdsvis. Cocultures ble etablert og analysert som i figur 2. De to celletypene vist her hadde imidlertid vært ulikt merkes slik at de kunne skilles fra hverandre. De høyere forstørrelse bilder i dette tallet, sammenlignet med dem som i figur 2, illustrere proteolyse av DQ-kollagen IV på overflaten av DCIS celler og diffus proteolyse av DQ-kollagen jeg i områder nær fibroblaster. Forstørrelse, 20X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som vist, kan det MAME cocultures brukes til live-celle bildebehandling i sanntid av interaksjoner mellom de ulike cellulære bestanddeler som utgjør en brystsvulst og dens mikromiljøet. I pågående studier i laboratoriet vårt, har vi brukt MAME cocultures å identifisere proteolytiske veier i forbindelse med overgang fra DCIS til invasivt duktalt karsinom, samt interaksjoner mellom proteolytiske stier og andre veier som er involvert i denne overgangen som chemokine / cytokin / vekstfaktor veier . Vi videre viste at Mame modeller kan brukes som et verktøy for screening effektene av små molekyl hemmere, blokkerer antistoffer eller shRNAs som modulerer proteolytisk / chemokine / cytokin / vekstfaktor veier 3-5. De Mame modellene kan brukes til live-celle avbildning av tumorvekst, invasjon og proteolyse løpet ganger alt fra minutter og timer, som vi tidligere har vist 6,7, til uker som illustrert her i figur 2 og 3. Detinteraksjoner blir observert er mellom celler i én art, dvs. humane tumorceller og tumor-assosierte celler, snarere enn mellom humane tumorceller og mus stromale celler som i intravital bildebehandling 8. De Mame modellene er en medgjørlig system. Molekyler av interesse kan være downregulated med shRNAs i enkelte celletyper før coculturing slik at deres bidrag i denne cellen type til nedbrytning av DQ-bindevevet kan avbildes og kvantifiseres i 3D 2. Klargjort fra Mame modeller kan prøves å måle endringer i utskillelsen av proteaser, cytokiner, etc. Den informasjonen vi får gir en eksperimentell basis for å teste effekten av små molekyl hemmere, blokkering antistoffer, etc.
Det cellulære sammensetningen av MAME cocultures lett kan manipuleres slik at man kan bruke dem til å vurdere bidraget av andre celletyper som finnes i svulsten mikromiljøet (f.eks korgcellene, monocytter, endotelceller i blodfartøy og lymfatiske opprinnelse) til ondartet progresjon 6,7. Nummeret på ulike celletyper seeded, forholdet mellom en celle til en annen og tiden i kulturen vil avhenge av spesifikke celletyper som brukes og den eksperimentelle spørsmålet. Mame modellene kan også utvides til å vurdere virkningene av endringer i mikromiljøet omgir brystsvulster, f.eks, pH, oksygen spenning. For eksempel har vi vist at når Mame kulturer opprettholdes på en litt sur pH, dvs. 6,8 pH, er det en økning i proteolyse og invasivitet. I tillegg har vi også vist at vi kan bruke lignende cocultures å modellere andre kreftformer som prostata kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet, delvis ved National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS og RRM). Live-celle bildebehandling ble utført i Mikroskopi, Imaging og cytometri Resources Core-støtte, delvis ved NIH Senter bevilgning P30 CA22453 til Karmanos Cancer Institute, Wayne State University og ved Perinatology Forskning Branch av National Institutes of Child Health and Development , Wayne State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | Phenol red-free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
