Summary
हम उनके microenvironment में स्तन ट्यूमर कोशिकाओं और अन्य कोशिकाओं के बीच बातचीत के वास्तविक समय में रहते सेल इमेजिंग के लिए 3 डी coculture मॉडल विकसित किया है कि प्रभाव एक आक्रामक phenotype के लिए प्रगति. इन मॉडलों paracrine - प्रेरित, proteolytic, / chemokine साइटोकाइन और kinase invasiveness में फंसा रास्ते को लक्षित करने के लिए दवाओं के लिए preclinical स्क्रीन के रूप में सेवा कर सकते हैं.
Protocol
1. डीक्यू - substrates के तैयार
- DQ-substrates के खोलने शीशियों से पहले कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए, विआयनीकृत पानी में 1 मिलीग्राम / मिलीग्राम डीक्यू सब्सट्रेट के स्टॉक समाधान तैयार, 50 μl aliquots और दुकान में 4 डिग्री सेल्सियस पर विभाजन की अनुमति दें lyophilized
~ 5 मिनट और 50 के लिए गर्मी डिग्री सेल्सियस फैलाव को सुविधाजनक बनाने के लिए के लिए एक अल्ट्रासोनिक पानी स्नान के में डीक्यू सब्सट्रेट आंदोलन के लिए आवश्यक हो सकता है.
- 4 में रात भर बर्फ पिघलना RBM डिग्री सेल्सियस, RBM हर समय बर्फ पर नियंत्रित किया जाना चाहिए.
- 10X फॉस्फेट बनाने खारा बफर (पीबीएस), 80 ग्राम NaCl भंग (1.37 एम), 2 जी KCl (0.027 एम), 14.4 छ ना 2 4 HPO (एम 1), और 2.4 छ 2 के.एच. पीओ 4 (0.02 एम) में 800 मिलीलीटर ultrapure पानी. 7,4 करने के लिए 1,0 एम एचसीएल के साथ पीबीएस बफर समाधान के पीएच को समायोजित करें. लाओ मात्रा 1 लीटर, निस्पंदन द्वारा बाँझ.
- ठंडा कोलेजन मैं ठंडा 10X पीबीएस 1 भाग के 8 भागों: कोलेजन बर्फ पर मैं समाधान तैयार. पीएच को समायोजित करेंमिश्रण का 7.2-7.6 बाँझ 0.1 एम NaOH का उपयोग करने के लिए. पीएच स्ट्रिप्स के साथ पीएच की जाँच करें और 10 भागों में बाँझ पानी के साथ अंतिम मात्रा को समायोजित.
- कोलेजन मैं समाधान में डीक्यू - कोलेजन मैं एक prechilled ट्यूब में 25 μg / मिलीग्राम और 2.4 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए गिराए, क्रमशः द्वारा कोलेजन मैं मैट्रिक्स: डीक्यू कोलेजन मैं तैयार.
- 25 μg / मिलीलीटर और 12-15 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता DQ-कोलेजन RBM में एक prechilled ट्यूब में (Cultrex या Matrigel) में चतुर्थ गिराए, क्रमशः पुनर्गठन तहखाने झिल्ली (RBM) मैट्रिक्स: डीक्यू कोलेजन चतुर्थ तैयार करते हैं. मिश्रण बर्फ कोमल pipetting का उपयोग करने के लिए बुलबुले बनाने से बचने के.
2. MAME cocultures तैयार
चित्रा 1 cocultures के एक योजनाबद्ध आरेख के लिए देखें.
- जगह दो एक संस्कृति डिश में 35 मिमी या एक 35 मिमी μ-डिश IbiTreat उपयोग आयताकार प्लास्टिक coverslips के (10 मिनट और हवा में सूखे के लिए 70% शराब में निष्फल). यहाँ दिशा दोनों coverslips और μ-व्यंजन के लिए कर रहे हैं, जो हम छात्रों के लिए उपयोगएक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर मर जाता है. एक उलटा माइक्रोस्कोप पर अध्ययन के लिए, हम केवल μ - व्यंजन का उपयोग करें.
- कोलेजन मैं मैट्रिक्स: मैं डीक्यू - कोलेजन के साथ fibroblasts की वांछित संख्या मिश्रण. कोलेजन मैं मैट्रिक्स: लंबी अवधि के आंकड़े 2 और 3 में सचित्र cocultures के लिए, हम मीडिया के 10 μl प्लस डीक्यू कोलेजन मैं 60 μl में 500 fibroblasts का उपयोग करें.
- 100 μl micropipettor का प्रयोग, ध्यान से विंदुक और fibroblast के 70 μl फैल: डीक्यू कोलेजन मैं: कोलेजन मैं मैट्रिक्स प्रत्येक coverslip की पूरी सतह पर और humidified इनक्यूबेटर में 37 ° C पर 30 मिनट के लिए जमना के लिए सीओ 2 के बिना छोड़.
- स्थानांतरण 35 मिमी 10 से संतुलित करना मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 ° सी इनक्यूबेटर coverslips युक्त व्यंजन.
- . इनक्यूबेटर से निकालें और हुड के तहत 35 मिमी बर्तन छोड़ जब तक वे कमरे के तापमान के लिए आते हैं.
- RBM जम डीक्यू कोलेजन मैं शीर्ष पर मैट्रिक्स: एम्बेडेड fibroblasts साथ कोलेजन मैं मैट्रिक्स 60 DQ-कोलेजन चतुर्थ के μl जोड़ें. विंदुक टिप, क्षमताओं के साथRBM मैट्रिक्स, समान रूप से तंतुप्रसू scratching के से परहेज:: refully DQ-कोलेजन चतुर्थ फैल डीक्यू कोलेजन मैं: कोलेजन मैं मैट्रिक्स.
- स्थानांतरण 35 मिमी 37 ° सी इनक्यूबेटर 10 से जमना मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ coverslips युक्त व्यंजन. जबकि DQ कोलेजन चतुर्थ: RBM मैट्रिक्स के solidifying है trypsinize है, और उपकला कोशिकाओं गिनती.
- : एक उपकला / ट्यूमर coverslips के है पर सेल निलंबन की जगह 50 μl DQ-कोलेजन चतुर्थ के साथ लेपित RBM मैट्रिक्स. 35 मिमी की जगह एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में coverslips युक्त व्यंजन. RBM मैट्रिक्स कोशिकाओं के लिए 40 से 60 मिनट DQ-कोलेजन चतुर्थ करने के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं. लंबी अवधि के आंकड़े 2 और 3 में सचित्र cocultures के लिए, हम 2500 उपकला या ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करें.
- संस्कृति प्रत्येक पकवान 35 मिमी के लिए 2% RBM युक्त मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें. यदि किसी भी दवा उपचार कर रही है, दवाओं के इस समय में जोड़ा जाना चाहिए.
- इमेजिंग पहले समय के वांछित अवधि के लिए सेते हैं. लंबी अवधि संस्कृतियों के लिए हर 3-4 दिन, मीडिया परिवर्तित किया जाना चाहिए. कोशिकाओं को बनाए रखा जा सकता हैअपने सामान्य संस्कृति के माध्यम में. स्तन सेल लाइनों के MAME cocultures के लिए, हम उपकला बेसल (MEBM PRF) मध्यम MEGM SingleQuots साथ पूरक का उपयोग करें.
3. Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 4D (3 डी + समय) रहते MAME cocultures इमेजिंग प्रदर्शन
- सबूत के सिद्धांत सचित्र अध्ययन के लिए, MAME cocultures हमारे प्रकाशित एक प्रक्रिया के अनुसार एक फ्लोरोसेंट सेल ट्रैकिंग रंग के साथ लेबल रहे थे. पीबीएस के साथ धोने के बाद, cocultures MEGM मध्यम में 5 माइक्रोन CellTracker के ऑरेंज के साथ एक 37 ° सी इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए incubated रहे थे, पीबीएस के साथ फिर से धोया और 30 मिनट के लिए prewarmed MEGMmedium के साथ incubated 37 ° C में 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर साथ इमेजिंग पहले .
- छवि MAME cocultures Zeiss एल एस एम 510-मेटा confocal सूक्ष्मदर्शी पर कम बढ़ाई (10X, पानी की सूई लेंस) में रहते हैं.
- ऑप्टिकल वर्गों संरचनाओं की पूरी गहराई भर अंतराल पर कब्जा कर रहे हैं. हमारे अध्ययन के लिए, हम 10 पर ऑप्टिकल वर्गों पर कब्जामाइक्रोन अंतराल.
- ऑप्टिकल वर्गों का उपयोग करने के लिए 3 डी में छवियों को फिर से संगठित करने के लिए. हम Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न.
- 3D पुनर्निर्माण की फिल्में बनाना इतना है कि संरचनाओं, सेल: सेल बातचीत और आसपास matrices के साथ बातचीत visualized किया जा सकता है. हम QuikTime 7 प्लेयर के साथ फिल्में कर दिया.
4. प्रतिनिधि परिणाम
MAME cocultures कि हम विकसित विभिन्न सेलुलर घटक है कि एक स्तन ट्यूमर और इसके microenvironment शामिल के बीच बातचीत के वास्तविक समय में रहते सेल इमेजिंग के लिए एक विनयशील प्रयोगात्मक मॉडल हैं. यहाँ हम सेल पुनरावृत्ति करना MAME मॉडल की क्षमता का प्रदर्शन: स्तन कैंसर की प्रगति के दौरान और रहने कक्ष इमेजिंग के सेल बातचीत के लिए समय के साथ वे बातचीत का पालन करें. हम एक preinvasive MCF10.DCIS मानव स्तन सेल लाइन और एक मानव स्तन कैंसर से जुड़े fibroblast लाइन, WS-12Ti के बीच छवि बातचीत करने की क्षमता का उदाहरण देकर स्पष्ट करना अधिक,संस्कृति में अधिक से अधिक तीन सप्ताह की अवधि. cocultures 3, 16 और 23 दिनों में imaged थे. की पूरी मात्रा के माध्यम से cocultures ऑप्टिकल वर्गों में पुनर्निर्मित किया गया 3 डी और प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 2 में तीन timepoints के प्रत्येक के लिए दिखाया. चित्रा 2 में लाल प्रतिदीप्ति MCF10.DCIS और था 12Ti कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है. दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच भेदभाव और दीर्घकालिक cocultures के लिए, एक transfect या व्यक्तिगत सेल प्रकार transduce कर सकते हैं फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ संस्कृतियों की स्थापना के लिए पहले. एक MAME coculture MCF10.DCIS और WS-12Ti कोशिकाओं है कि विभिन्न प्रकार से पहचान के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल रहे हैं चित्रा 3 में सचित्र है.
Substrates के द्वारा शामिल है, इस मामले में DQ-कोलेजन में, MAME cocultures में, हम आकलन और proteolysis में एक आक्रामक phenotype के लिए संक्रमण के साथ जुड़े समय पर कर सकते हैं यों परिवर्तन. हम फ्लोरोसेंट दरार उत्पादों को बढ़ाता के लिए तरीकों की स्थापना की है कि परिणामसे डीक्यू - कोलेजन 2,3 गिरावट. हम लेबलिंग और सेल नाभिक गिनती करके MAME cocultures पूरे 3 डी मात्रा भर गिरावट उत्पादों के प्रति एक कोशिका के आधार पर मानक के अनुसार. इसके अलावा, हम बाह्य और intracellular डिब्बों को गिरावट के स्थानीयकरण और कुल, intracellular और बाह्य गिरावट उत्पादों के रूप में हम 2 पहले से वर्णित है मात्रा ठहराना कर सकते हैं. आंकड़े 2 और 3 में हरी प्रतिदीप्ति दो DQ-कोलेजन substrates के दरार के उत्पादों का प्रतिनिधित्व करता है. इस समय, कोलेजन विभिन्न लेबल उपलब्ध नहीं हैं कि हमें प्रकार चतुर्थ और मैं कोलेजन प्रकार के कोलेजन गिरावट की गिरावट के बीच अंतर करने की अनुमति होगी.
MAME cocultures में बातचीत गतिशील हैं और समय के साथ बदल सकते हैं. लौकिक और गतिशील जानकारी प्राप्त करने के लिए, को देखने के एक ही क्षेत्र छवि और ऑप्टिकल मात्रा का पूरा नमूना के माध्यम से बार बार सप्ताह के लिए पहले से समय की अवधि में ले लिया हो सकता है,इस प्रकार 4 - डी में डेटा एकत्रित. चित्रा 2 में, हम बल्कि नाटकीय परिवर्तन है कि 23 दिन से अधिक होने वर्णन: सेल नंबर में परिवर्तन, सेल प्रवास और सेल बातचीत, संरचना संस्करणों, संरचना आकार, संरचनाओं की गोलाई से विचलन, आक्रामक outgrowths और proteolysis. इसके अलावा, हम भी कारण MAME cocultures के लिए मात्रा में एक समग्र परिवर्तन का प्रदर्शन इस समय अवधि में बाह्य मैट्रिक्स आसपास अपमानजनक उनके. तीन दिन के रूप में चित्र 2A में सचित्र में, मात्रा 110,000 3 माइक्रोन है. इसके विपरीत में, 16 और 23 दिन में MAME cocultures की मात्रा 46,250 केवल 3 माइक्रोन के रूप में आंकड़े 2B और सी. में सचित्र है
आकृति 1. MAME cocultures. योजनाबद्ध आरेख प्लास्टिक coverslip मैं कोलेजन के साथ लेपित है, डीक्यू कोलेजन मैं और fibroblasts (मैजंटा) युक्त. पुनर्गठन तहखाने झिल्ली के एक 2 परत (RBM) DQ-कर्नल युक्तlagen चतुर्थ जोड़ा जाता है. ट्यूमर कोशिकाओं (लाल) शीर्ष पर चढ़ाया जाता है और संस्कृति मीडिया में 2% RBM मीडिया के हर बदलाव के साथ (सफेद डॉट्स) मढ़ा है. डीक्यू कोलेजन मैं और चतुर्थ ग्रीन फ्लोरोसेंट दरार उत्पादों का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 2. MCF10.DCIS मानव स्तन कोशिकाओं और WS-12Ti मानव स्तन fibroblasts की MAME cocultures. fibroblasts / मैं मैं DQ-कोलेजन और युक्त RBM DQ-कोलेजन चतुर्थ के साथ मढ़ा कोलेजन में एम्बेडेड थे. DCIS कोशिकाओं और RBM मढ़ा 2% RBM युक्त मीडिया के साथ पर वरीयता प्राप्त किया गया. यहाँ सचित्र coculture में 23 दिनों के दौरान, सेल प्रसार, डीक्यू कोलेजन चतुर्थ और मैं (हरा) और कोलेजन matrices के क्षरण cocultures की मात्रा में कमी से संकेत के रूप में. कोशिकाओं इमेजिंग (लाल) से पहले बगल में CellTracker ऑरेंज के साथ लेबल करके स्थानीयकृत किया गया. वही रहते cocultures 23 दिन से अधिक ग द्वारा कब्जा कर लिया छवियों के साथ मनाया गयाcoculture की 3, 16 और 23 दिनों में onfocal माइक्रोस्कोपी. परिणामस्वरूप ऑप्टिकल स्लाइस Volocity सॉफ्टवेयर के साथ 3 डी में खंगाला गया. बढ़ाई, 10X.
चित्रा 3. MAME 16 MCF10.DCIS मानव स्तन कोशिकाओं और WS-12Ti मानव स्तन fibroblasts दिन cocultures कि एक्सप्रेस (लाल) आरएफपी और YFP (सफेद), क्रमशः. Cocultures स्थापित किया गया और चित्रा 2 के रूप में विश्लेषण किया. दो सेल प्रकार यहाँ दिखाया, लेकिन था, किया गया है विभिन्न इतना लेबल है कि वे एक दूसरे से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. इस आंकड़े में उच्च बढ़ाई छवियों, के रूप में चित्रा 2 में उन लोगों की तुलना में, DCIS कोशिकाओं की सतह के और fibroblasts पास क्षेत्रों में डीक्यू कोलेजन मैं फैलाना proteolysis में डीक्यू कोलेजन चतुर्थ के proteolysis वर्णन. बढ़ाई, 20X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
के रूप में प्रदर्शन किया, MAME cocultures विभिन्न सेलुलर घटक है कि एक स्तन ट्यूमर और इसके microenvironment शामिल के बीच बातचीत के वास्तविक समय में रहते सेल इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला में चल रहे अध्ययन में, हम MAME cocultures के proteolytic, DCIS से आक्रामक ductal कार्सिनोमा संक्रमण के साथ जुड़े रास्ते के रूप में अच्छी तरह से proteolytic रास्ते और chemokine / साइटोकाइन / वृद्धि कारक रास्ते के रूप में इस संक्रमण में शामिल अन्य रास्ते के बीच में बातचीत की पहचान इस्तेमाल किया है . हम आगे से पता चला है कि MAME मॉडल को छोटे अणु inhibitors की स्क्रीनिंग प्रभाव, कि एंटीबॉडी या shRNAs के proteolytic / / chemokine / साइटोकाइन कारक रास्ते विकास 3-5 मिलाना अवरुद्ध करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. MAME मॉडल ट्यूमर के विकास, मिनट और घंटे से लेकर बार से अधिक आक्रमण और proteolysis के रहने कक्ष इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में हम 6,7 पहले से पता चला है, सप्ताह के रूप में आंकड़े 2 और 3 में यहाँ सचित्र.मनाया जा रहा है एक प्रजाति, यानी, मानव ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर जुड़े कोशिकाओं, intravital इमेजिंग में 8 के बजाय मानव ट्यूमर कोशिकाओं और माउस stromal कोशिकाओं के बीच की कोशिकाओं के बीच बातचीत कर रहे हैं. MAME मॉडल एक विनयशील प्रणाली के हैं. ब्याज की अणु अलग - अलग प्रकार की कोशिकाओं में shRNAs के साथ downregulated coculturing के लिए पहले हो ताकि उनके कि सेल प्रकार में डीक्यू - कोलेजन की गिरावट के लिए योगदान और imaged किया जा सकता है 3 डी में 2 मात्रा कर सकते हैं. MAME मॉडल से वातानुकूलित मीडिया proteases के स्राव में परिवर्तन, साइटोकिन्स, आदि को मापने के लिए जांचा जा सकता है प्राप्त जानकारी के छोटे अणु inhibitors के प्रभाव का परीक्षण, एंटीबॉडी अवरुद्ध, आदि के लिए एक प्रायोगिक आधार प्रदान करता है
MAME cocultures के सेलुलर संरचना को आसानी से इतनी है कि उनमें से एक का उपयोग करने के लिए ट्यूमर microenvironment (उदाहरण के लिए, myoepithelial कोशिकाओं, monocytes, रक्त के endothelial कोशिकाओं में पाया अन्य प्रकार की कोशिकाओं के योगदान का आकलन कर सकते हैं छेड़छाड़ कर सकते हैंपोत और लसीका मूल घातक 6,7 प्रगति करने के लिए). विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं वरीयता प्राप्त है, एक सेल प्रकार का एक और अनुपात और संस्कृति में समय की लंबाई की संख्या में विशेष सेल का इस्तेमाल किया प्रकार और प्रयोगात्मक प्रश्न पर निर्भर करेगा. MAME मॉडल भी स्तन ट्यूमर के आसपास microenvironment में परिवर्तन, जैसे, पीएच, ऑक्सीजन तनाव के प्रभाव का आकलन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम पता चला है कि जब MAME संस्कृतियों को एक से थोड़ा अम्लीय pH, यानी, 6.8 पीएच पर रखा जाता है, वहाँ proteolysis और invasiveness में में वृद्धि हुई है. इसके अलावा, हम भी पता चला है कि हम समान cocultures के का उपयोग करने के लिए प्रोस्टेट कैंसर की तरह अन्य कैंसर मॉडल कर सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के भाग में, स्वास्थ्य CA131990 R01 (वित्तीय पर्यवेक्षण बोर्ड और RRM) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया. लाइव सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी इमेजिंग, और Cytometry संसाधन समर्थित कोर में प्रदर्शन किया था, भाग में, एनआईएच केंद्र p30 CA22453 अनुदान द्वारा Karmanos कैंसर संस्थान, वेन स्टेट यूनिवर्सिटी और बाल स्वास्थ्य और विकास के राष्ट्रीय संस्थानों के Perinatology अनुसंधान शाखा द्वारा , वेन स्टेट यूनिवर्सिटी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | Phenol red-free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
