En polert og forsterket tynnet-skalle Window for langsiktig Imaging av Mouse Brain

Summary

Vi presenterer en metode for å danne en avbildning vindu i musen hodeskallen som spenner millimeter og er stabil i flere måneder uten betennelse i hjernen. Denne metoden egner seg godt for longitudinelle studier av blodstrøm, cellulære dynamikk, og celle / vaskulær struktur ved hjelp av to-foton mikroskopi.

Abstract

In vivo avbildning av kortikal funksjon krever optisk tilgang til hjernen uten avbrudd av intrakraniell miljøet. Vi presenterer en metode for å danne en polert og forsterket tynnet hodeskallen (porter) vindu i musen hodeskallen som spenner over flere millimeter i diameter og er stabil i flere måneder. Skallen er tynnet 10 til 15 mikrometer i tykkelse med en håndholdt drill for å oppnå optisk klarhet, og deretter kledde med Cyanoakrylat lim og et dekke glass til: 1) gir stivhet, 2) hemmer bein gjenvekst og 3) redusere lysspredning fra uregelmessigheter på beinet overflaten. Siden skallen ikke er brutt, er enhver betennelse som kan påvirke prosessen som studeres sterkt redusert. Imaging dybder opp til 250 mikrometer under kortikale overflate kan oppnås ved å bruke to-foton laser scanning mikroskopi. Dette vinduet er godt egnet til å studere cerebral blodstrøm og cellulær funksjon i både anesteserte og våken forberedelser. Det gir ytterligere opportunity å manipulere celleaktivitet bruke optogenetics eller å forstyrre blodgjennomstrømningen i målrettede skip ved bestråling av sirkulerende fotosensitisere.

Protocol

1. Forberedelse til kirurgi ⁱ

1. Rengjør de kirurgiske verktøy ved sonicating i en blanding av Maxizyme og kirurgisk Milk i en ultrasoniske renere. Autoklaver kirurgiske verktøy før hvert forsøk.
2. Sikre at alle nødvendige reagenser og forbruksmateriell er tilgjengelig. En liste av reagenser og forbruksmateriell er gitt i Tabell 2. Reagenser og forbruksmateriell som kommer i kontakt med utsatt vev bør være steril, når det er mulig.
3. Indusere anestesi. Typiske bedøvelse egnet for overlevelse studier er beskrevet i Tabell 1. Sikre kirurgisk flyet av anestesi ved å sjekke for manglende tå klype refleks. Den optimale alder av musen er 3 til 6 ukers alder. Skallen på yngre mus er mykere og mer vanskelig å tynn. Eldre mus har tykkere hodeskalle som vil blø mer under tynning prosedyren.
4. Sikre dyret i en stereotaxic ramme ^en. En liste over kirurgisk utstyr er gitt i Tabell 2.
5. Opprettholde kroppens temperaturTure ved 37 ° C ved hjelp av en feedback regulert rektal probe og varme pad.
6. Påfør ophthalmic salve til øynene for å holde på fuktigheten.
7. Shave hodebunnen med en liten elektrisk barberhøvel.
8. Rengjør hodebunnen med Betadine, etterfulgt av swabbing med 70% (v / v) isopropylalkohol.
9. Hvis ønskelig, sjekk at hjerte og pust priser er innenfor et normalt område ved hjelp av en pulsoksymeter. For en mus, disse tallene bør sentrum rundt 10 og 2 Hz, henholdsvis.
10. Varm en delmengde av steril-filtrerte kunstig cerebral spinal væske (ACSF) til 37 ° C (125 mM NaCl, 10 mM glukose, 10 mm HEPES, 3,1 mM CaCl _2, 1,3 mm ₂ MgCl, 7,4 pH) (alle kjemikalier fra Sigma) ^2.

2. Montering en Hode Frame

1. Fjern hodebunnen over hele dorsal skallen overflaten med en pinsett og kirurgiske sakser. Trim huden lateralt til kantene av timelig musklene på hver side av skallen og posterior til musklene i nakken (Fig. 1A).
2. Bruk en skalpell blad for å fjerne den tynne periosteum fra overflaten av skallen.
3. Rengjør skallen med en fuktig bomull tippet applikator og tørk skallen overflaten med en strøm av luft fra en støv kan. Deretter påfør et tynt lag med Cyanoakrylat lim til hele skallen overflaten. La limet tørke grundig. Dette laget med lim er nødvendig for riktig etterlevelse av dental sement i påfølgende trinn. Den Cyanoakrylat Limet trenger ikke å bli sterilisert.
4. Fest en metall-kontakt til skallen overflaten, vekk fra området av ønsket vinduet. For anesteserte preparater, kan en liten nøtt festes til skallen med en skvett av Cyanoakrylat lim, som senere kan skrus inn i bildebehandling oppsettet ved hjelp av en bolt (Fig. 1B, 1L og 1N). Tett baksida av mutteren med tape for å sikre at limet ikke inn trådene under vedlegg til skallen. Mutteren og tape bør steriliseres ved autoklavering før operasjonen.
5. For vakner bildebehandling preparater, feste en mer rigid tilpasset kontakt med to festepunkter (Fig. 1M og 1N). Bor to hull i hodeskallen over kontralaterale kortikale halvkule med en ½ mm drill Burr, og deretter introdusere to # 000 self-skruer. Disse skruene vil hjelpe forankre hodet festet til skallen. Bruk bare en full omdreining av skruen, for å unngå ved å trykke på den underliggende cortex. Deretter fester du egendefinerte metall korset bar med en liten skvett av Cyanoakrylat lim over lillehjernen. La Cyanoakrylat limet tørke grundig. Dette Helmetallkontakter reduserer graden av frihet og forenkler flytting av samme bildebehandling feltet i longitudinelle studier. Et bredt kors bar gir rikelig rom for plassering av elektrodene og stimulering av vibrissae. Detaljerte planer for å generere egendefinerte hodet festet og feste enheten er tilgjengelig på nettet (SICS / links.html "> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). Skruer og kors bar bør steriliseres ved autoklavering før operasjonen.
6. Dekk hele skallen overflaten, unntatt plasseringen av vinduet, med et lag av dental sement (Fig. 1C og 1D). Sørg for at alle utsatte kanter av huden er dekket av sement. Komponentene i dental sement trenger ikke å bli sterilisert.

3. Produksjon av et polert og forsterket tynnet-skalle (porter) Window

1. Sørg for at drill grader er skarpe og unngå gjenbruk dem. Ved hjelp av en lav hastighet på dental drill, tynn en 2 mm med 2 mm region over somatosensoriske cortex med en ½ mm Burr. Veksle mellom å tisse i skallen med ACSF og deretter tørking skallen overflaten med en mild luftstrøm fra en gass støvkost, våt til kjøling, og tørr for tynning. Dette krever tynning gjennom cancellous laget av skallen, som kan blø, men kan Controlled ved å skylle med ACSF (Fig. 1E). Skallen begynner å bøye under litt press på drillen når det er ~ 50 mikrometer, og de ​​pial fartøyene skal være synlig gjennom våt bein (Fig. 1F). På dette tykkelse, vil små hvite flekker i benet blir synlige i noen sekunder rett etter den tørre hodeskallen overflaten er fuktet.
2. På dette punktet, tynne bein ytterligere. Bruk en langsommere drill hastighet, dvs. 1000 rpm, som barberer skallen overflaten med bare en lett berøring. Bruk små kontrollerte bevegelser mens du holder boret som en penn og gjelder bare kraft i lateral retning. Benet skal ~ for 10 til 15 mikrometer i sin endelige tykkelse (Fig. 1G). Når benet er tilstrekkelig tynn, vil de små hvite flekker i benet ikke lenger være synlig når den tørre hodeskallen overflaten er fuktet.
3. Poler vinduet regionen med tinn oksid pulver. Fest en ferdiglaget borekronen som er dyppet i silikon akvarium fugemasse og medtrukket, og etterlot en konisk pisk (innfelt, fig. 1H). Den silikon pisk bør utarbeides minst én dag før operasjon, og steriliseres med 70% isopropanol før bruk. Plasser en liten klype pulver på vinduet sammen med en dråpe ACSF (Fig. 1H). Vend slurry over vinduet i opptil ti minutter ved forsiktig å berøre tuppen av bevegelige pisken til skallen overflaten. Skyll bort tinn oksid pulveret grundig fra vinduet med ACSF og tørk bein grundig med en mild luftstrøm. Surface uregelmessigheter og heftende bein chips igjen ved å bore i de forrige trinnene bør fjernes etter polering (Fig. 1H og 1I). Den tinn oksid Pulveret trenger ikke å bli sterilisert.
4. Klipp firkantede biter av no. 0 dekning glass litt mindre enn størrelsen på vinduet. Bruk en skriftlærd til å forsiktig scorer separerte horisontale og vertikale linjer i dekkglass med en rett kant. Deretter plasserer dekselet slip i en petriskål og knOck fatet mot et bord kanten å skille glassbitene. Hele petriskål kan deretter autoklaveres for å sikre sterilitet.
5. Plasser en riktig størrelse glasset i nærheten av tørket vinduet. Påfør en liten skvett av Cyanoakrylat lim over vinduet med spissen av en brukket tre bomullstupp applikator, og raskt skyve precut stykke dekning glass oppå limet. Unngå å lage bobler under glasset. Skyv glasset mot skallen overflaten, og hold i noen sekunder (Fig. 1J og 1o). La limet tørke grundig over 15 minutter. Overflødig Cyanoakrylat lim kan fjernes fra den øvre overflaten av glasset med en skalpell blad etter at den er tørket. Forsegle kantene på glasset med dental sement og danne en litt hevet godt for å holde vann til å dyppe linsen (Fig. 1K og 1o).

4. Recovery

1. Plasser dyret i et varmt bur etter operasjonen. Overvåkdyr jevnlig til den gjenoppretter fullt fra anestesi.
2. Dersom preparatet er ment å overleve i mer enn én dag, gi buprenorfin (0,03 mikrogram per g gnager) for smertelindring. Vi vanligvis bilde av dyret minst en dag etter den første implantasjon.

5. Imaging Forberedelse

1. Stabilisere dyret på en optisk breadboard for avbildning ved hjelp av ramme som en hodestøtte (Fig. 1L og 1M). En beherskelse apparat kan gjøres fra kommersielt tilgjengelige optomekaniske komponenter fra Qioptiq eller ThorLabs. Vår egen plate kan transporteres mellom kirurgiske og to-foton imaging-suiter med dyret og alle fysiologiske overvåkingsutstyr samlet som en enhet ^3.
2. Hvis blod flow imaging er ønskelig, injisere 0,05 ml 5% (w / v) fluorescerende-dekstransulfat fargestoff oppløst i sterilt saltvann enten gjennom halen blodåre eller infraorbital vene å merke blodet serum (Fig. 2A og 2C til 2H 4-7. Dette må gjøres under narkose. Infraorbital vene administrasjonen kan være lettere for nybegynnere, som dekstran løsninger er mer tyktflytende. Halen vene kan være vanskelig å finne i mørke mus, og venen tendens til å kollapse etter et mislykket injeksjon. For bildebehandling blodkar med grønn utslipp, bruke en fluorescein isothiocyanate dekstran. For rød-utslipp, bruke en Texas Red dekstran. Med høy molekylvekt dextrans, vil fargestoffet blir værende i omløp i flere timer. Alternativt kan dyr med endogene fluorescerende etiketter bli fotografert direkte på hensiktsmessig to-foton eksitasjon bølgelengde. Den dekstran Løsningen kan fryses i alikvoter for fremtidig bruk.
3. Forsiktig rengjøre vindusflate med en fuktig bomull tippet applikator.
4. Ved forlenget avbildning av anesteserte preparater, injisere steril Ringer-laktat oppløsning intraperitonealt ved et volum på 3 mL per gram hver 2 time for å opprettholde kroppens væske og energibehov. </ Li>
5. Når bildebehandling dyr i våken tilstand, begrense hodestøtten til bare noen få timer av gangen for å redusere stressnivået. Tilbake dyret til hjemmet buret mellom bildediagnostikk økter for mat og vann.

6. Representative Resultater

En vellykket vindu vil tillate tenkelig dybder opp til 250 mikrometer under pial overflaten i flere måneder. Denne metoden har blitt brukt til å studere in vivo kapillært blod flyte ^{4, 8,} microglial aktivering ^{8, 9,} og dendrittiske struktur innen kortikale parenchyma ^8. I ett eksempel, bruker vi to-foton imaging å vise kortikal blodkar av en bedøvet Thy1-gul fluoriserende protein (YFP) mus, etter at blodet serum er merket med intravenøs injeksjon av Texas Red dekstran (Fig. 2A). Dural fartøy er ofte synlige litt over kortikale overflate i dura mater (Fig. 2C, pil). Store pial arterioler og venules lie på kortikale overflate (fig 2d). Penetrating fartøy gren fra denne flaten nettverket og dykke inn i hjernebarken hvor de ramify til en tett kapillær seng som mater kortikale vev (Fig. 2E til 2H). Dendrittiske ARBORS av dyp YFP uttrykke kortikale nevroner, et signal endogen til denne musen linjen, kan avbildes samtidig i en andre kanal ¹⁰ (Fig. 2B til 2H). Den andre harmoniske signal av benet ble samlet i en tredje kanal, og kan brukes til å måle tykkelsen på tynnet hodeskallen etter innsamling av billedopptak stabler (Fig. 2A til 2C).

Kortikal vaskulære dynamikk er sterkt berørt av bedøvelse ^11. I et annet eksempel, viser vi en video av spontan vasoactivity innsamlet av to-foton mikroskopi fra en habituated våken mus. Prominente vasomotoriske svingninger i lumen diameter blir sett med en pial arteriole, men ikke med et naboland venule. Dettebasal rekke vasoactivity er redusert med uretan anestesi ^fire. For å kvantifisere spontane og følelsesladede endringer i blodstrømmen, bruker vi tilpasset linje skanning teknikker for å fange både vaskulær diameter og røde blodceller hastigheten enkelte fartøy. Detaljerte ressurser på kvantitativ blodgjennomstrømning avbildning ved hjelp av to-foton mikroskopi er tilgjengelig ^{3, 12.}

Figur 1. Prosedyre for en PORTS vindu. (A til K) Bilder av sekvensielle trinn i prosedyren for å generere en PORTS vindu. Se teksten for detaljerte instruksjoner. β = bregma og λ = lambda. (L) Bolt og mutter system for sikring hodet under avbildning av anesteserte preparater. (M) Custom maskinert korset bar hode mount for våken forberedelser. I dette eksempelet ble en kontakt også implantert for gjentatte electrocorticogram opptak. (N)Prinsippskisse som viser dorsal utsikt over hodet festet og plasseringen av ulike komponenter. Mutteren brukes i panelet L er ment som alternativ til korset bar bruker i panelet M. Two # 000 selvborende skruer legges med korset bar mount for ekstra stabilitet med våken bildebehandling forberedelser. (O) Prinsippskisse som viser tverrsnitt av en PORTS vindu.

Figur 2. To-foton avbildning av blodkar og neuronal struktur i mus cortex. Alle bildene ble tatt gjennom et PORTS vindu i en Thy1-YFP mus på 2 dager etter vindu implantasjon ^10. Maksimal projeksjon over 150 mikrometer vev i den koronale orientering viser tynnet skallen i forhold til blodkar (A) og dendritter (B). Benet (blå) ble oppdaget ved å samle den andre harmoniske fluorescens ved 450 nm-utslipp med 900 nm eksitasjon 6. De dendrittiske felt av nevroner (grønn) er endogent til Thy1-YFP transgene mus linje. (CH) Maksimale anslag over 50 mikrometer av vev i horisontal orientering på forskjellige dybder under Pia. Data er fra samme bildestakk vist i Panels A og B. dural fartøy kan være synlig like ovenfor kortikale overflate (pil i C).

Forkortelser

ACSF = kunstig cerebral spinalvæske
PORTS = polert og forsterket tynnet skallen vindu
YFP = gul fluoriserende protein

^{sikrer jeg} at prosedyrene som er beskrevet er godkjent av din lokale institusjoner Animal Care og Bruk komité.

Discussion

To-foton bildebehandling gjennom en PORTS vindu krever overføring gjennom tynnet bein og dura, som demper laserlys og legger optiske avvik på større dyp ^8. Men til tross for denne ulempen, kan bildebehandling dybder opp til 250 mikrometer under pial overflaten oppnås med 900 nm eksitasjon. Større bildebehandling dybder kan i prinsippet være mulig med lengre eksitasjonsbølgelengdene ^13. En stor fordel med denne metoden er fraværet av kortikale betennelse som kan eksistere forbigående i metoder som involverer hele ^{14 kraniotomi, 15.} En godt forberedt PORTS vindu skal viser ingen klare tegn på angiogenese eller inflammasjon etter implantering ^8. Dette kan vurderes i vivo i løpet av eksperimentet ved bildebehandling blodkar struktur, eller ved å registrere morfologiske endringer av microglia i CX (3) CR1-GFP mus ^{8 linje, 16, 17.} Videre bør post hoc immunohistology være perdannet for å bekrefte fraværet av astrogliosis i den overfladiske cortex, for eksempel ved hjelp av et antistoff for glial fibrillary surt protein ^8.

Den mest krevende trinnet i å generere en PORTS vindu er tynning benet til 10 til 15 mikrometer i tykkelse. Periodisk gjennomgang av vinduet under et bredt felt fluorescens disseksjon mikroskop er også nyttig å måle kraniet tykkelse under tynning prosedyren. Fluorescent etiketter nær kortikale overflate bør være godt synlig gjennom den våte hodeskallen. For en mer nøyaktig mål på skallen tykkelse, kan den andre harmoniske signal fra beinet måles i en tredimensjonal stabel under to-foton mikroskopi (Fig. 2A til 2C). Hvis dette er gjort før påføring av lim og dekselet glass, bein og kan bli ytterligere tynnes om nødvendig. Utilstrekkelig tynning resulterer i dårlig bildebehandling dybde. Polering vil fortsette å tynne skallen når boringen er ikke lenger mulig, og vil hjelperedusere overflate uregelmessigheter og heftende bein chips. I foreløpige studier, har vi funnet at polering forbedrer bildebehandling dybde uker etter den første implantasjon. Imidlertid har en grundig analyse på fordelen ved polering ikke utført.

Anvendelsen av Cyanoakrylat lim og deksel glass på toppen av benet er et kritisk punkt for å redusere lysspredning og gir mulighet for dypere bildebehandling. På grunn av boreprosessen, vil overflaten av beinet være uregelmessig, selv etter polering, og derfor lysspredning. Anvendelsen av Cyanoakrylat lim fyller disse uregelmessighetene og overliggende glasset etterlater et ikke-spredning glatt overflate. Viktigere er de refractive indeksene for lim og dekselet glass, som er 1,45 og 1,52 i henhold til produsentens spesifikasjoner, tett indeksert matchet til at av bein ved 1.55 ^18. Dette er en forbedring over å ha luft eller vann over tynnet skallen, som har refractive indeksene til 1,00 end 1.33. Kritisk, hjelper Cyanoakrylat lim ytterligere å hindre bein ettervekst. Dette gjør langsgående bildebehandling i inntil tre måneder, uten behov for ytterligere vedlikehold etter den første operasjonen.

En annen årsak til dårlig avbildning dybde er skade på pial fartøy som fører til blødninger eller ødem. Vibrasjoner fra øvelsen bør minimaliseres. I en liten andel av tilfellene, vil blødning innenfor dura være uunngåelig. Dette er fordi blodkar av dura mater er kontinuerlig med vaskulær plexus av skallen, som er forstyrret under tynning prosedyren. Forberedelser med noen tegn på sub-dural blødning bør kastes som dural jevning og angiogenese vil følge. Suksessraten av Porter vinduet kan være så høyt som 80% med praksis.

For noen eksperimenter, kan det være nødvendig å injisere fargestoffer / virus eller sette elektroder inn i vevet under Porter vinduet. Det er mulig å generere en litenhullet ved siden av vinduet, der pipetter eller elektroder kan introduseres ved hjelp av en stereotaxic arm eller Sutter manipulator ^19. Dette hullet kan lagres, med bein voks hvis dyret er å bli fotografert igjen i fremtidige sesjoner. Men innføring av elektroder kan selvsagt føre til betennelse i hjernebarken og akutt patologi som sprer depresjon.

Porter vinduet bør være velegnet for enhver tenkelig modalitet krever optisk tilgang til hjernen. Dette inkluderer overflate imaging teknikker som egenverdi optisk avbildning ²⁰ og laser speckle ²¹ bildebehandling, eller optiske utsnitt teknikker som confocal ²² eller to-foton mikroskopi ^23. Videre bør en PORTS forberedelse bedre oppløsning i store felt transkranial imaging teknikker som optisk koherens tomografi ²⁴ og photoacoustic mikroskopi ^25.

Endelig er Porter vinduetegnet for avbildning av våkne dyr som glasset gir stivhet til vinduet ^4. Hodet festet er ytterligere stabilisert ved innføringen av to selvgjengende # 000 skruer til kontralaterale halvkule før påføring av dental sement (Fig. 1L). Tilvenning til hode-fiksering er viktig å redusere dyrs bevegelser under bildebehandling. En ny dyr kan bli gradvis vant til head-beherskelse over en periode på 3 til 7 dager før bildebehandling, og starter med 15 min økter og jobbe seg opp til flere timer.