A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

Summary

Nós apresentar um método para formar uma janela de imagem no crânio do rato que se estende por milímetro e é estável durante meses sem inflamação do cérebro. Este método é bem adequado para estudos longitudinais de fluxo de sangue, a dinâmica celular, e as células / estrutura vascular utilizando dois fotões microscopia.

Abstract

In vivo de imagem da função cortical requer acesso óptico para o cérebro sem interrupção do ambiente intracraniana. Nós apresentamos um método para formar um crânio polido e reforçado diluído (portas) janela no crânio do rato que se estende por vários milímetros de diâmetro e é estável durante meses. O crânio é diluído para 10 a 15 uM de espessura com uma mão de broca para alcançar claridade óptica, e é então revestida com cola de cianoacrilato e uma tampa de vidro para: 1) proporcionar rigidez, 2) inibir crescimento do osso e 3) reduzir a dispersão de luz a partir de irregularidades na superfície do osso. Uma vez que o crânio não seja ultrapassado, qualquer inflamação que pode afetar o processo que está sendo estudado é bastante reduzido. Profundidades de imagem de até 250 uM abaixo da superfície cortical pode ser conseguido usando dois-fotão microscopia laser scanning. Esta janela é bem adequado para estudar o fluxo sanguíneo cerebral e da função celular, tanto em preparações anestesiados e acordado. Além disso, oferece a optunidade para manipular a atividade das células usando optogenetics ou para interromper o fluxo de sangue nos vasos alvo de irradiação de fotossensibilizadores circulando.

Protocol

1. Preparação para Cirurgia ⁱ

1. Limpe os instrumentos cirúrgicos por sonicação em uma mistura de leite Maxizyme e cirúrgica em um líquido de limpeza ultra-sônica. Autoclavar os instrumentos cirúrgicos, antes de cada experiência.
2. Assegurar que todos os reagentes necessários e descartáveis ​​estão disponíveis. Uma lista de reagentes e produtos descartáveis ​​é fornecido na Tabela 2. Reagentes e produtos descartáveis ​​que entram em contacto com o tecido exposto deve ser estéril, quando possível.
3. Induzir a anestesia. Anestésicos típicos adequados para estudos de sobrevivência estão descritos na Tabela 1. Certifique-se de plano cirúrgico de anestesia, verificando, por falta de reflexo pitada pés. A idade óptima de rato é de 3 a 6 semanas de idade. Os crânios de ratos mais jovens são mais suaves e mais difícil de fina. Ratos mais velhos têm crânios mais espessos que vai sangrar mais durante o processo de desbaste.
4. Proteger o animal numa moldura estereotáxico ^1. Uma lista de equipamento cirúrgico é fornecido na Tabela 2.
5. Manter o corpo temperatura a 37 ° C usando um gabarito sonda rectal e regulada almofada de calor.
6. Aplicar pomada oftálmica para os olhos para reter a umidade.
7. Raspar o couro cabeludo com um aparelho de barbear elétrico pequeno.
8. Limpar o couro cabeludo com Betadine, seguido por raspagem com 70% (v / v) de álcool isopropílico.
9. Se desejar, verificar que a freqüência cardíaca e respiração são dentro de uma faixa normal usando um oxímetro de pulso. Para um rato, estes números devem centro cerca de 10 e 2 Hz, respectivamente.
10. Aquecer uma aliquota de esterilizada por filtração fluido cerebral espinal artificial (ACSF) a 37 ° C (125 mM de NaCl, 10 mM de glucose, 10 mM de HEPES, 3,1 _mM de CaCl2, 1,3 _mM de MgCl2, pH 7,4) (todos os produtos químicos a partir de Sigma) ^2.

2. A montagem de uma estrutura de cabeça

1. Remover o couro cabeludo sobre toda a superfície craniana dorsal com um par de pinças e tesouras cirúrgicas. Aparar a pele lateralmente para as bordas dos músculos temporais em ambos os lados do crânio e póserior para os músculos do pescoço (Fig. 1A).
2. Usar uma lâmina de bisturi para remover o periósteo fina a partir da superfície do crânio.
3. Limpe o crânio com um algodão úmido o aplicador derrubado e secar a superfície do crânio com uma corrente de ar a partir de um pó pode. Em seguida, aplicar uma fina camada de cola de cianoacrilato para toda a superfície craniana. Deixe a cola secar completamente. Esta camada de cola é necessária para a aderência adequada do cimento dentário em passos subsequentes. A cola de cianoacrilato não precisa de ser esterilizado.
4. Anexar um conector de metal para a superfície do crânio, para longe da área da janela desejado. Para as preparações anestesiados, uma porca de pequeno pode ser fixado ao crânio com um pouco de cola de cianoacrilato, o qual pode mais tarde ser aparafusado no configuração de imagem utilizando um parafuso (Fig. 1B, 1L e 1N). Selar a parte de trás da porca com fita para garantir que a cola não entra os fios durante a fixação ao crânio. A porca ea fita devem ser esterilizados em autoclave antes da cirurgia.
5. Para as preparações de imagem acordados, anexar um conector mais rígida personalizada com dois pontos de fixação (Fig. 1M e 1N). Faça dois furos no crânio sobre o hemisfério contralateral cortical com uma broca de ½ mm broca e, em seguida, introduzir dois # 000 parafusos auto-atarrachantes. Estes parafusos vai ajudar a ancorar a cabeça para montar o crânio. Aplicam-se apenas uma volta completa do parafuso, a fim de evitar a aplicação de pressão para o córtex subjacente. Em seguida, coloque a barra transversal personalizado de metal com uma pequena bagatela de cola de cianoacrilato sobre o cerebelo. Deixe a cola de cianoacrilato para secar completamente. Este conector de metal reduz grandemente os graus de liberdade e simplifica relocalização do campo de imagem mesmo em estudos longitudinais. Uma barra transversal de largura dá amplo espaço para a colocação do eletrodo e estimulação de vibrissas. Planos detalhados para gerar a montagem de cabeça personalizado e dispositivo de fixação estão disponíveis online (sics / links.html "> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). Os parafusos e barra transversal devem ser esterilizados em autoclave antes da cirurgia.
6. Cobrir toda a superfície craniana, excluindo a localização da janela, com uma camada de cimento dentário (Fig. 1C e 1D). Assegure-se que todas as arestas expostas da pele são cobertas por cimento. Os componentes do cimento dental não precisa de ser esterilizado.

3. A Geração de um polido e reforçado afinado crânio-Window (portas)

1. Certifique-se que as rebarbas de perfuração são nítidas e evitar a reutilização los. Usando uma baixa velocidade na broca dental, fino de 2 mm por 2 mm sobre a região do córtex somatossensorial com ½ mm rebarba. Alterne entre molhar o crânio com ACSF e depois secagem da superfície do crânio com uma ligeira corrente de ar de um espanador de gás; molhado para resfriamento e seca para o desbaste. Isto requer o desbaste através da camada esponjosa do crânio, que podem sangrar, mas pode ser controlled através de lavagem com ACSF (Fig. 1E). O crânio começa a flectir sob a pressão ligeira da broca, quando ele é de ~ 50 um, e os vasos Pial deve ser visível através do osso molhado (Fig. 1F). Neste espessura, pequenas manchas brancas no interior do osso se tornarão visíveis durante alguns segundos, imediatamente após a superfície do crânio seco é humedecida.
2. Neste ponto, o osso fina ainda mais. Use uma velocidade de perfuração, ou seja, 1000 rpm, que raspa a superfície craniana, com apenas um leve toque. Use pequenos movimentos controlados, mantendo a broca como uma caneta e só se aplica força no sentido lateral. O osso deve ser ~~~V 10 a 15 mM, na sua espessura final (Fig. 1G). Quando o osso é suficientemente fina, as manchas brancas pequenas no osso não será mais visível quando a superfície do crânio seco é humedecido.
3. Polir a região janela com pó de óxido de estanho. Anexar uma broca pré-fabricada que foi mergulhado em silicone selante aquário e comtraçadas, deixando um chicote cônico (inset, fig. 1H). O chicote de silicone deve ser preparado pelo menos um dia antes da cirurgia, e esterilizadas com 70% de isopropanol antes de usar. Colocar uma pitada de pó sobre a janela, juntamente com uma gota de ACSF (Fig. 1H). Agitar a suspensão sobre a janela de até dez minutos por tocar suavemente a ponta do chicote que se deslocam para a superfície do crânio. Lave afastado o pó de óxido de estanho completamente a partir da janela usando ACSF e secar o osso cuidadosamente com uma corrente suave de ar. Irregularidades de superfície e fragmentos de ossos aderentes deixados por perfuração nas etapas anteriores deve ser removida após o polimento (Fig. 1H e 1I). O pó de óxido de estanho não precisa de ser esterilizado.
4. Corte pedaços quadrados de nenhuma. 0 vidro de cobertura ligeiramente menor do que o tamanho da janela. Use um escriba, que gentilmente marcar separadas linhas horizontais e verticais na lamínula utilizando uma borda reta. Em seguida, coloque a lâmina de cobertura numa placa de Petri e knock o prato contra uma borda da mesa para separar as peças de vidro. A placa de petri inteira pode então ser autoclavados para assegurar a esterilidade.
5. Coloque uma tampa de vidro de tamanho adequado próxima janela a seco. Aplique uma pequena bagatela de cola de cianoacrilato sobre a janela com a ponta de um aplicador de ponta de madeira algodão quebrado, e rapidamente empurre a peça pré-cortados de tampa de vidro em cima da cola. Evite criar bolhas debaixo da tampa de vidro. Com cuidado, empurre a tampa de vidro contra a superfície do crânio, e segure por alguns segundos (Fig. 1J e 1O). Permitir que a cola seque completamente ao longo de 15 minutos. Cola de cianoacrilato em excesso pode ser removido da superfície superior da tampa de vidro com uma lâmina de bisturi depois é seca. Selar as extremidades da tampa de vidro com cimento dental e formar uma ligeiramente levantada bem a reter a água para a lente de imersão (Fig. 1K e 1O).

4. Recuperação

1. Coloque o animal em uma cirurgia quente gaiola seguinte. Monitorar oanimais periodicamente até que ele se recupera totalmente da anestesia.
2. Se a preparação se destina a sobreviver por mais do que um dia, fornecer buprenorfina (0,03 mg por roedor g) para analgesia. Nós imagem tipicamente o animal, pelo menos, um dia após o implante inicial.

5. Preparação de imagens

1. Estabilizar o animal em uma placa de montagem óptica para imagiologia, usando o quadro como um suporte para a cabeça (Fig. 1D e 1M). Um aparelho de retenção pode ser feita a partir de componentes disponíveis comercialmente a partir de optomechanical Qioptiq ou ThorLabs. A nossa chapa separada pode ser transportado entre conjuntos de imagem cirúrgicas e de dois fotões com o animal e todos os dispositivos de monitorização fisiológicas montados como uma unidade ^3.
2. Se o fluxo de sangue de imagem for desejado, injectar 0,05 mL de 5% (w / v) fluorescente-dextrano corante dissolvida em solução salina estéril, quer através da veia da cauda ou da veia infraorbital para rotular do soro do sangue (Fig. 2A e 2C para 2H 4-7. Isso deve ser feito sob anestesia geral. Administração veia Infraorbital pode ser mais fácil para iniciantes, como soluções de dextrano são mais viscosos. A veia da cauda pode ser difícil localizar no escuro ratinhos coloridos, ea veia tende a colapsar após uma injecção falhou. Para imagem vasculatura com verde de emissão, usar um isotiocianato de fluoresceína dextrano. Para emissão vermelha, usar um Texas Red dextrano. Com altas dextranos de peso molecular, o corante permanecerão em circulação durante várias horas. Alternativamente, os animais com endógenos etiquetas fluorescentes podem ser visualizados directamente no comprimento de onda de excitação apropriada de dois fotões. A solução de dextrano pode ser congelada em alíquotas para utilização futura.
3. Limpe suavemente a superfície da janela com um algodão úmido o aplicador derrubado.
4. Para imagem prolongada de preparações anestesiados, injectar por via intraperitoneal de Ringer com lactato estéril da solução a um volume de 3 uL por grama a cada 2 horas para manter fluidos corporais e requisitos de energia. </ Li>
5. Quando os animais de imagem no estado de vigília, limitar apoio de cabeça para apenas algumas horas em um momento de reduzir os níveis de estresse. Retornar o animal na gaiola casa entre as sessões de imagem por comida e água.

6. Os resultados representativos

Uma janela de sucesso vai permitir profundidades de imagem até 250 uM abaixo da superfície pial durante vários meses. Este método tem sido utilizada para estudar in vivo o fluxo de sangue capilar ^{4, 8,} a activação da microglia ^{8, 9,} e uma estrutura dendrítica dentro do parênquima cortical ^8. Num exemplo, usamos dois fotões de imagem para mostrar a vasculatura cortical de um rato anestesiado fluorescente proteína Thy1-amarelo (YFP), após o soro do sangue é rotulado por injecção intravenosa de Texas Red dextrano (Fig. 2A). Vasos durais muitas vezes são visíveis ligeiramente acima da superfície cortical na dura-máter (Fig. 2C, seta). Grandes arteríolas e vênulas Pial lie na superfície cortical (Fig. 2D). Ramo vasos penetrantes desta rede superfície e mergulhar no córtex, onde se ramificam em uma cama densa capilar que alimenta o tecido cortical (Fig. 2E a 2H). Arbors dendríticas de YFP profundo expressando neurônios corticais, um sinal endógeno para esta linha de mouse, podem ser visualizados simultaneamente em um segundo canal ¹⁰ (Fig. 2B a 2H). O sinal de segunda harmónica do osso foi recolhido num terceiro canal, e pode ser usado para medir a espessura do crânio diluído após a recolha de pilhas de imagens (Fig. 2A a 2C).

Corticais dinâmica vasculares são profundamente afetados pelos anestésicos ^11. Em um segundo exemplo, vamos mostrar um vídeo de vasoactivity espontânea coletados por microscopia de dois fótons de um rato habituado acordado. Oscilações vasomotores proeminentes no diâmetro do lúmen são vistos com uma arteríola pial, mas não com um vénula vizinho. Estefaixa basal de vasoactivity é diminuída com ⁴ anestesia com uretana. Para quantificar as mudanças espontâneas e evocadas no fluxo sanguíneo, usamos técnicas de exploração de linha adaptados para capturar tanto o diâmetro vascular e velocidade de células vermelhas do sangue dos vasos individuais. Detalhadas sobre recursos de imagem quantitativa do fluxo sanguíneo usando microscopia de dois fótons estão disponíveis ^{3, 12.}

Figura 1. Procedimento para uma janela Portas. (A K a) Imagens de passos seqüenciais no processo para gerar uma janela Portas. Veja o texto para instruções detalhadas. β = bregma e λ = lambda. (L) sistema de parafusos e porcas para fixar a cabeça durante o exame de preparações anestesiados. (M) Custom usinado montagem da cruzeta bar para os preparativos acordados. Neste exemplo, um conector também foi implantado para gravações electrocorticogram repetidas. (N)Diagrama esquemático mostrando a vista dorsal da cabeça e posição de montagem de vários componentes. A porca utilizada em L painel se entende como alternativa para a barra transversal usando no painel M. Dois # 000 parafusos auto-atarrachantes são adicionados com a barra transversal de montagem para maior estabilidade com os preparativos de imagem acordados. (O) Diagrama esquemático mostrando corte transversal de uma janela Portas.

Figura 2. Imagem de dois fótons de estrutura vascular e neuronal no córtex do rato. Todas as imagens foram coletadas através de uma janela portas em um rato Thy1-YFP até 2 dias após o implante de janela ^10. Projecção máxima mais de 150 uM de tecido na orientação coronal mostrando o crânio diluído em relação à vasculatura (A) e dendritos (B). O osso (azul) foi detectada através da recolha de fluorescência a segunda harmónica a 450 nm de emissão com 900 nm de excitação 6. Os campos dendríticos de neurônios (verde) são endógenos para a linha do mouse Thy1-YFP transgênico. (CH) projeções máximas acima de 50 mM de tecido na orientação horizontal em diferentes profundidades abaixo da pia. De dados é a partir da pilha mesma imagem mostrada na Painéis A e B. vasos máter pode ser visível um pouco acima da superfície cortical (seta em C).

Abreviaturas

ACSF = fluido espinhal cerebral artificial
PORTOS = janela crânio polido e reforçado diluído
YFP = proteína amarelo fluorescente

ⁱ Assegurar que os procedimentos descritos são aprovados por seu Animal Care institucional local e usar Comitê.

Discussion

Dois fótons de imagens através de uma janela Portas exige transmissão através do osso diluído e dura-máter, que atenua a luz do laser e adiciona aberrações ópticas em profundidades maiores ^8. No entanto, apesar de este inconveniente, a profundidade de imagem até 250 um abaixo da superfície pial pode ser conseguido com 900 nm de excitação. Maiores profundidades de imagem podem, em princípio, seria possível com comprimentos de onda mais longos de excitação ^13. Uma grande vantagem deste método é a ausência de inflamação cortical que possa existir transitoriamente em métodos que envolvem a craniotomia completa ^{14, 15.} Um bem preparado janela Portas não deve apresentar sinais evidentes de angiogênese ou inflamação após a implantação ^8. Isto pode ser avaliada in vivo durante o curso da experiência por imagem estrutura vasculatura, ou através da detecção de alterações morfológicas da microglia no CX (3) CR1-GFP do rato linha ^{8, 16, 17.} Além disso, post hoc imunohistologia deve ser porformada para confirmar a ausência de astrogliose no córtex superficial, por exemplo, utilizando um anticorpo para proteína ácida fibrilar glial ^8.

O passo mais exigente em gerar uma janela Portas é desbaste do osso para 10 a 15 uM de espessura. Análise periódica da janela sob um microscópio de dissecção gama campo de fluorescência também é útil para medir a espessura do crânio durante o procedimento de desbaste. Etiquetas fluorescentes perto da superfície cortical deve ser claramente visível através do crânio molhado. Para obter uma medida mais precisa da espessura do crânio, o sinal de segunda harmónica do osso pode ser medido em uma pilha tridimensional sob dois fotões microscopia (Fig. 2A a 2C). Se isso for feito, antes da aplicação da cola e tampa de vidro, o osso e pode ser ainda mais diluída, se necessário. Insuficiente desbaste resulta em profundidade de imagem pobre. Polimento continuará para fluidificar o crânio quando a perfuração não é mais possível, e vai ajudarreduzir irregularidades de superfície e fragmentos de ossos aderentes. Em estudos preliminares, verificou-se que o polimento melhora semanas profundidade de imagem após a implantação inicial. No entanto, uma análise rigorosa sobre o benefício de polimento não foi realizada.

A aplicação de cola de cianoacrilato e tampa de vidro no topo do osso é um passo crítico para reduzir dispersão de luz e permitir a mais profunda de imagem. Devido ao processo de perfuração, a superfície do osso vai ser irregular, mesmo após o polimento, e, por conseguinte, o espalhamento de luz. A aplicação de cola de cianoacrilato preenche estas irregularidades eo vidro tampa sobrejacente deixa uma superfície não-dispersando lisa. Importante, os índices de refracção para a cola e tampa de vidro, que são 1,45 e 1,52 de acordo com as especificações do fabricante, estão intimamente combinados indexado à do osso a 1,55 ^18. Esta é uma melhoria sobre o ter ar ou de água acima do crânio diluído, que têm índices de refracção de 1,00 umd 1,33. Criticamente, a cola de cianoacrilato também ajuda a impedir óssea re-crescimento. Isto permite imagiologia longitudinal por até três meses, sem a necessidade de manutenção adicional após a cirurgia inicial.

A segunda causa da profundidade de imagem pobre é danos aos vasos Pial levando a uma hemorragia ou edema. Vibrações da broca deve ser minimizada. Em uma pequena proporção de casos de hemorragia no interior da dura-máter será inevitável. Isto é porque a vasculatura da dura-máter é contínuo com o plexo vascular do crânio, que é perturbada durante o procedimento de desbaste. Preparações com qualquer sinal de sub-dural sangramento deve ser descartado como espessamento dural e angiogênese seguirão. A taxa de sucesso da janela As portas podem ser tão elevada como 80% com a prática.

Para algumas experiências, pode ser necessário para injectar corantes / vírus ou inserir eléctrodos para o tecido sob a janela de portas. É possível gerar uma pequenaburaco adjacente à janela através do qual pipetas ou eléctrodos pode ser introduzido utilizando um braço estereotáxico ou Sutter manipulador ^19. Este buraco pode ser selados com cera de osso, se o animal está a ser trabalhada novamente em sessões futuras. No entanto, a introdução de eléctrodos podem, naturalmente, levar a inflamação na patologia córtex e aguda, tais como depressão alastrante.

A janela de portas devem ser bem adequado para qualquer modalidade de imagem a necessidade de acesso óptico para o cérebro. Isso inclui técnicas de imagem em superfície, tais como imagens ópticas intrínseca ²⁰ e laser speckle imagem ^21, ou ópticos técnicas de seccionamento como confocal ²² ou dois fótons de microscopia ^23. Além disso, uma preparação portas devem melhorar a resolução em escala de campo técnicas de imagem transcraniano como a tomografia de coerência óptica e microscopia ²⁴ fotoacústica ^25.

Finalmente, a janela Portas éadequado para imagiologia de animais acordados como a tampa de vidro adiciona rigidez à janela ^4. A montagem da cabeça é ainda mais estabilizada pela introdução de duas auto-roscante-# 000 parafusos para o hemisfério contralateral antes da aplicação do cimento dentário (Fig. 1E). Habituação a cabeça de fixação é importante para o movimento do animal reduzida durante o exame. Um animal de novo pode ser gradualmente acostumados a cabeça de retenção ao longo de um período de 3 a 7 dias antes da imagem, começando com 15 sessões min e de trabalho até várias horas.