लंबे समय तक माउस ब्रेन इमेजिंग के लिए एक पॉलिश और प्रबलित विंडो पतला - खोपड़ी

Summary

हम एक लिए माउस खोपड़ी है कि मिलीमीटर तक फैला है और मस्तिष्क की सूजन के बिना महीने के लिए स्थिर है में एक इमेजिंग विंडो के रूप में विधि प्रस्तुत करते हैं. इस विधि को अच्छी तरह से दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए रक्त प्रवाह, सेलुलर गतिशीलता, और सेल / संवहनी संरचना की अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अनुकूल है.

Abstract

के cortical समारोह के vivo में इमेजिंग intracranial पर्यावरण के विघटन के बिना मस्तिष्क के लिए ऑप्टिकल का उपयोग की आवश्यकता है. हम एक माउस खोपड़ी है कि व्यास में कई मिलीमीटर तक फैला है और महीने के लिए स्थिर है में एक पॉलिश और प्रबलित पतला खोपड़ी (बंदरगाहों) खिड़की के रूप में विधि प्रस्तुत करते हैं. खोपड़ी मोटाई में 10 से 15 माइक्रोन के लिए एक हाथ ड्रिल आयोजित करने के लिए ऑप्टिकल स्पष्टता प्राप्त करने के साथ पतला है, और है तो cyanoacrylate गोंद और एक कवर ग्लास से मढ़ा: 1), 2 कठोरता प्रदान करने के लिए) हड्डी regrowth को रोकना और 3) प्रकाश बिखरने को कम हड्डी की सतह पर अनियमितताओं से. के बाद से खोपड़ी का उल्लंघन नहीं है, किसी भी सूजन है कि अध्ययन किया जा रहा है की प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता है बहुत कम है. इमेजिंग cortical सतह के नीचे 250 माइक्रोन तक की गहराई दो photon माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. इस विंडो को अच्छी तरह से दोनों संवेदनाहृत और जाग तैयारी में मस्तिष्क रक्त प्रवाह और सेलुलर समारोह का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है. यह आगे सेशन प्रदान करता हैportunity सेल गतिविधि का उपयोग optogenetics हेरफेर करने के लिए या photosensitizers परिसंचारी के विकिरण द्वारा लक्षित वाहिकाओं में रक्त के प्रवाह को बाधित.

Protocol

1. ^मैं सर्जरी के लिए तैयारी

1. एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर के में Maxizyme और सर्जिकल दूध का एक मिश्रण में sonicating द्वारा सर्जिकल उपकरण साफ करें. प्रत्येक प्रयोग से पहले शल्य चिकित्सा उपकरण आटोक्लेव.
2. सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक अभिकर्मकों और disposables उपलब्ध हैं. अभिकर्मकों और disposables की एक सूची तालिका 2 में प्रदान की जाती है. अभिकर्मकों और disposables कि उजागर ऊतक के साथ संपर्क में आ बाँझ हो सकता है, जब संभव चाहिए.
3. संज्ञाहरण प्रेरित करना. विशिष्ट अस्तित्व पढ़ाई के लिए उपयुक्त anesthetics तालिका 1 में वर्णित हैं. पैर की अंगुली चुटकी प्रतिवर्त की कमी के लिए जाँच के द्वारा संज्ञाहरण की शल्य विमान सुनिश्चित करें. माउस का इष्टतम उम्र की उम्र 3 से 6 सप्ताह है. युवा चूहों की खोपड़ी नरम और पतली मुश्किल हैं. बड़े चूहों मोटा खोपड़ी है कि thinning के प्रक्रिया के दौरान अधिक खून बहाना होगा.
4. पशु सुरक्षित एक stereotaxic ¹ फ्रेम में. तालिका 2 में शल्य चिकित्सा उपकरणों की एक सूची प्रदान की जाती है.
5. शरीर का तापमान बनाए रखने के37 में ऊपरी ° C एक प्रतिक्रिया विनियमित गुदा जांच और गर्मी पैड का उपयोग कर.
6. आंखों को नेत्र मरहम लागू करने के लिए नमी बनाए रखने के लिए.
7. एक छोटे से बिजली के रेजर के साथ खोपड़ी दाढ़ी.
8. Betadine, 70 (v / v)% isopropyl शराब के साथ swabbing द्वारा पीछा के साथ खोपड़ी को साफ करें.
9. अगर वांछित, जाँच, कि दिल और सांस लेने की दर एक सामान्य सीमा के भीतर एक नाड़ी oximeter का उपयोग कर रहे हैं. एक माउस के लिए, इन संख्या लगभग 10 केंद्र और 2 हर्ट्ज, क्रमशः.
10. 37 डिग्री सेल्सियस (125 मिमी, NaCl 10 मिमी ग्लूकोज, 10 मिमी HEPES, 3.1 मिमी ₂ CaCl, 1.3 मिमी ₂ MgCl, पीएच 7.4) (सिग्मा से सभी रसायन) बाँझ फ़िल्टर कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ (ACSF) के एक नि: शेष भाजक गर्म ^2.

2. एक प्रमुख फ्रेम बढ़ते

1. संदंश और शल्य कैंची की एक जोड़ी के साथ पूरे पृष्ठीय खोपड़ी की सतह पर खोपड़ी निकालें. त्वचा खोपड़ी और बाद के दोनों तरफ laterally टेम्पोरल मांसपेशियों के किनारों को छाँटो(छवि 1 ए) गर्दन की मांसपेशियों को erior.
2. एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करने के लिए पतली periosteum खोपड़ी की सतह से हटाने के लिए.
3. एक नम कपास के साथ खोपड़ी को साफ applicator के इत्तला दे दी और एक धूल से हवा की एक धारा के साथ खोपड़ी सतह सूखी है. तो पूरे खोपड़ी की सतह के लिए cyanoacrylate गोंद की एक पतली परत लागू होते हैं. गोंद अच्छी तरह से शुष्क करने की अनुमति देते हैं. गोंद की इस परत के बाद के चरणों में दंत सीमेंट के समुचित पालन के लिए आवश्यक है. cyanoacrylate गोंद निष्फल हो जरूरत नहीं है.
4. खोपड़ी की सतह के लिए वांछित खिड़की के क्षेत्र से दूर एक धातु संबंधक संलग्न. Anesthetized तैयारी के लिए, एक छोटे से अखरोट cyanoacrylate गोंद का एक थपका, जो बाद में इमेजिंग एक बोल्ट का उपयोग कर सेटअप (छवि 1B, 1L और 1N) में खराब किया जा सकता है के साथ खोपड़ी के लिए सुरक्षित किया जा सकता है. टेप के साथ अखरोट की पीठ सील करने के लिए सुनिश्चित करें कि गोंद धागे खोपड़ी के लिए लगाव के दौरान दर्ज नहीं करता है. अखरोट और टेप निष्फल किया जाना चाहिए सर्जरी से पहले वाष्पदावी विसंक्रण द्वारा.
5. जाग इमेजिंग की तैयारी के लिए, दो लगाव अंक (छवि 1M और 1N) के साथ एक और अधिक कठोर कस्टम संबंधक देते हैं. Contralateral cortical गोलार्द्ध अधिक एक आधा मिमी ड्रिल गड़गड़ाहट के साथ खोपड़ी में दो छेद ड्रिल करने के लिए, और फिर दो # 000 आत्म दोहन शिकंजा परिचय. इन शिकंजा सिर लंगर खोपड़ी के लिए माउंट करने में मदद करेगा. केवल एक पेंच की पूर्ण मोड़ लागू करने के लिए, क्रम में करने के लिए अंतर्निहित प्रांतस्था करने के लिए दबाव लागू करने से बचने के लिए. तो, सेरिबैलम पर एक cyanoacrylate गोंद की छोटी थपका के साथ कस्टम धातु पार बार देते हैं. Cyanoacrylate गोंद अच्छी तरह से सूखे के लिए अनुमति देते हैं. यह धातु संबंधक बहुत स्वतंत्रता की डिग्री कम कर देता है और अनुदैर्ध्य अध्ययन में एक ही इमेजिंग क्षेत्र के स्थानांतरण को सरल. एक व्यापक पार बार इलेक्ट्रोड स्थान और vibrissae की उत्तेजना के लिए पर्याप्त कमरा देता है. कस्टम सिर माउंट और युक्ति लगाव पैदा करने के लिए विस्तृत योजना ऑनलाइन उपलब्ध हैं (/ sics links.html ">) http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html. शिकंजा और पार बार सर्जरी से पहले वाष्पदावी विसंक्रण द्वारा निष्फल किया जाना चाहिए.
6. पूरे खोपड़ी की सतह खिड़की का स्थान, दंत सीमेंट की एक परत के साथ (छवि 1C और 1D) को छोड़कर, कवर. सुनिश्चित करें कि त्वचा के संपर्क में किनारों सीमेंट द्वारा कवर कर रहे हैं. दंत सीमेंट के घटकों को निष्फल हो जरूरत नहीं है.

3. पॉलिश की पीढ़ी और पतला - खोपड़ी विंडो (बंदरगाहों) प्रबलित

1. सुनिश्चित करें कि ड्रिल burrs तेज कर रहे हैं और उन्हें reusing से बचें. दंत ड्रिल पर एक कम गति का प्रयोग, 2 somatosensory प्रांतस्था पर एक आधा मिमी गड़गड़ाहट के साथ मिमी क्षेत्र द्वारा पतली एक 2 मिमी. ठंडा करने के लिए गीला, और thinning के लिए सूखी, ACSF साथ खोपड़ी गीला और फिर गैस झाड़न से एक हवा की कोमल धारा के साथ खोपड़ी सतह सुखाने के बीच वैकल्पिक. यह खोपड़ी, जो खून की जालीदार परत के माध्यम से thinning के आवश्यकता है, लेकिन नियंत्रण किया जा सकता हैACSF के साथ निस्तब्धता (छवि 1E) के द्वारा एड. खोपड़ी ड्रिल का मामूली दबाव में फ्लेक्स जब यह ~ 50 माइक्रोन है, और PIAL वाहिकाओं गीला हड्डी (छवि 1F) के माध्यम से दिखाई जानी चाहिए शुरू होता है. यह मोटाई में, हड्डी के भीतर छोटे सफेद धब्बे के तुरंत बाद सूखी खोपड़ी सतह सिक्त कुछ सेकंड के लिए दिखाई हो जाएगा.
2. इस बिंदु पर, हड्डी पतली और आगे भी. एक धीमी गति ड्रिल, अर्थात्, 1000 rpm के, जो केवल एक मामूली स्पर्श के साथ खोपड़ी सतह shaves. छोटे नियंत्रित आंदोलनों का उपयोग करते हुए एक कलम की तरह ड्रिल पकड़ और केवल पार्श्व दिशा में बल लागू होते हैं. हड्डी अपनी अंतिम मोटाई (छवि 1G) में 10 से 15 माइक्रोन ~~ चाहिए. जब हड्डी पर्याप्त पतली है, हड्डी में छोटे सफेद धब्बे अब और नहीं दिखाई हो जब सूखी खोपड़ी सतह के सिक्त है.
3. टिन ऑक्साइड पाउडर के साथ खिड़की के क्षेत्र पोलिश. पूर्व एक ड्रिल बिट है कि सिलिकॉन मछलीघर सीलेंट में और साथ में भिगोया गया है संलग्नतैयार, एक पतला कोड़ा (इनसेट, अंजीर. 1H) छोड़ने. सिलिकॉन कोड़ा सर्जरी से पहले कम से कम एक दिन के लिए तैयार रहना चाहिए, और 70% का उपयोग करने के लिए पूर्व isopropanol साथ निष्फल. खिड़की पर ACSF (1H छवि) की एक बूंद के साथ पाउडर के एक छोटे से चुटकी रखें. खिड़की पर दस मिनट के लिए धीरे चलती कोड़ा की खोपड़ी सतह टिप को छू द्वारा घोल उत्तेजित करना. दूर टिन ऑक्साइड पाउडर अच्छी तरह से ACSF का उपयोग कर खिड़की से और फ्लश हड्डी हवा की एक सौम्य धारा के साथ अच्छी तरह से सूखे. सतह अनियमितताओं और पक्षपाती हड्डी चिप्स पिछले चरण में ड्रिलिंग के द्वारा छोड़ दिया चमकाने (छवि 1h के और 1 मैं) के बाद हटा दिया जाना चाहिए. टिन ऑक्साइड पाउडर को निष्फल करने की आवश्यकता नहीं है.
4. कोई वर्ग टुकड़े काटें. 0 कवर थोड़ा खिड़की के आकार की तुलना में छोटे गिलास. धीरे कवर पर्ची का उपयोग कर एक सीधे बढ़त में अलग क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर लाइनों का स्कोर एक मुंशी का प्रयोग करें. फिर एक पेट्री डिश और कर्नाटक में कवर पर्ची जगहकाँच के टुकड़े को अलग करने के लिए एक मेज बढ़त के खिलाफ पकवान ock. पूरे पेट्री डिश तो बाँझपन को सुनिश्चित autoclaved किया जा सकता है.
5. एक उचित आकार कवर ग्लास के पास सूखे खिड़की रखें. एक टूटी हुई लकड़ी कपास टिप applicator के टिप का उपयोग कर खिड़की पर एक cyanoacrylate गोंद की छोटी थपका लागू करें, और जल्दी से कवर गिलास के ऊपर गोंद की precut टुकड़ा धक्का. कवर गिलास नीचे बुलबुले बनाने से बचें. धीरे खोपड़ी की सतह के खिलाफ कवर गिलास धक्का, और कुछ ही सेकंड (छवि 1J और 1O) के लिए पकड़. गोंद 15 मिनट से अधिक अच्छी तरह से शुष्क करने की अनुमति दें. अतिरिक्त cyanoacrylate गोंद एक स्केलपेल ब्लेड के साथ कवर कांच की ऊपरी सतह से हटाया जा सकता है के बाद यह सूख जाता है. दंत सीमेंट के साथ कवर गिलास के किनारों को सील करने और फार्म का एक थोड़ा अच्छी तरह से उठाया सूई लेंस (छवि 1K और 1O) के लिए पानी की पकड़ है.

4. वसूली

1. एक गर्म पिंजरे सर्जरी के बाद में पशु रखें. मॉनिटरजानवर समय समय पर जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से ठीक है.
2. यदि तैयारी के लिए एक से अधिक दिन के लिए जीवित रहने का मतलब है, buprenorphine (0.03 छ कृंतक प्रति μg) analgesia के लिए प्रदान करते हैं. हम प्रारंभिक आरोपण के बाद आम तौर पर पशु कम से कम एक दिन छवि.

5. इमेजिंग तैयारी

1. पशु इमेजिंग के लिए एक ऑप्टिकल breadboard पर स्थिर की, एक सिर का समर्थन (छवि 1L और 1M) के रूप में फ्रेम का उपयोग कर. एक संयम तंत्र Qioptiq या Thorlabs से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध optomechanical घटक से किया जा सकता है. हमारा अलग प्लेट शल्य चिकित्सा और पशु और एक इकाई के रूप में ³ इकट्ठे सभी शारीरिक निगरानी उपकरणों के साथ दो photon इमेजिंग सुइट्स के बीच ले जाया जा सकता है.
2. यदि रक्त प्रवाह इमेजिंग वांछित है, 5% की 0.05 एमएल (w / v) फ्लोरोसेंट dextran डाई पूंछ नस या infraorbital नस के माध्यम से या तो बाँझ खारा में भंग रक्त सीरम (छवि 2A और 2C 2H लेबल इंजेक्षन 4-7). यह सामान्य संज्ञाहरण के तहत किया जाना चाहिए. Infraorbital नस प्रशासन beginners के लिए आसान हो सकता है, के रूप में dextran समाधान अधिक चिपचिपा हो सकता है. करने के लिए काले रंग चूहों में पता लगाने पूंछ नस मुश्किल हो सकते हैं, और नस विफल इंजेक्शन के बाद गिर जाता है. इमेजिंग vasculature के साथ हरे रंग उत्सर्जन के लिए, एक fluorescein आइसोथियोसाइनेट dextran का उपयोग करें. लाल उत्सर्जन लिए, एक टेक्सास रेड dextran का उपयोग करें. उच्च आणविक वजन dextrans के साथ, रंग संचलन में कई घंटे के लिए रहेगा. वैकल्पिक रूप से, अंतर्जात फ्लोरोसेंट लेबल के साथ पशुओं के उचित उत्तेजना दो photon तरंग दैर्ध्य में सीधे imaged किया कर सकते हैं. dextran समाधान aliquots में भविष्य के उपयोग के लिए जमे हुए किया जा सकता है.
3. धीरे से एक नम कपास के साथ खिड़की सतह को साफ applicator के इत्तला दे दी.
4. Anesthetized तैयारी के लंबे समय तक इमेजिंग के लिए, 3 μL की मात्रा में प्रति ग्राम हर 2 घंटे बाँझ lactated घंटी समाधान intraperitoneally के लिए शरीर के तरल पदार्थ और ऊर्जा आवश्यकताओं को बनाए रखने इंजेक्षन <./ Li>
5. जब जाग राज्य में इमेजिंग जानवरों, एक समय में केवल कुछ घंटे के लिए सिर संयम को सीमित करने के लिए तनाव का स्तर कम है. पशु इमेजिंग सत्र के बीच में भोजन और पानी के लिए घर पिंजरे में लौटें.

6. प्रतिनिधि परिणाम

एक सफल खिड़की इमेजिंग गहराई की अनुमति के लिए कई महीनों के लिए PIAL सतह के नीचे 250 माइक्रोन. इस विधि के cortical पैरेन्काइमा भीतर ⁸ vivo में केशिका रक्त ^{4 प्रवाह, 8,} microglial सक्रियण ^{8, 9,} और वृक्ष के समान संरचना में अध्ययन किया गया है. एक उदाहरण में, हम दो photon इमेजिंग का उपयोग करने के लिए एक संवेदनाहृत Thy1 पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन माउस (YFP) के cortical vasculature को दिखाने के लिए, के बाद रक्त सीरम टेक्सास रेड dextran (2A छवि) की नसों में इंजेक्शन द्वारा लेबल है. Dural वाहिकाओं अक्सर ड्यूरा मेटर में cortical सतह (छवि 2C, तीर) से थोड़ा ऊपर दिखाई दे रहे हैं. बड़े PIAL arterioles और venules लीcortical सतह पर ई (चित्र 2 डी). प्रांतस्था, जहां वे एक घने केशिका बिस्तर कि cortical ऊतक फ़ीड (छवि 2E 2H) में शाखाओं में विभक्त होना में इस सतह नेटवर्क और गोता से तीक्ष्ण वाहिकाओं शाखा. गहरी cortical न्यूरॉन्स व्यक्त YFP, संकेत इस माउस रेखा से अंतर्जात के वृक्ष के समान arbors, एक दूसरे ¹⁰ चैनल (छवि 2B 2H) में समवर्ती imaged किया जा सकता है. हड्डी के दूसरे हार्मोनिक संकेत के एक तिहाई चैनल में एकत्र किया गया था, और छवि के ढेर संग्रह के बाद पतला खोपड़ी (छवि 2C करने के लिए 2A) की मोटाई गेज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Cortical संवहनी गतिशीलता गहराई ¹¹ anesthetics के द्वारा प्रभावित होते हैं. एक दूसरे उदाहरण में, हम सहज vasoactivity एक आदत जाग माउस से दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा एकत्र की एक वीडियो दिखा. लुमेन व्यास में प्रमुख vasomotor दोलनों PIAL धमनिका के साथ देखा जाता है, लेकिन नहीं पड़ोसी venule के साथ. यहvasoactivity की बेसल रेंज urethane संज्ञाहरण ⁴ के साथ कम है. रक्त के प्रवाह में सहज और पैदा परिवर्तन मात्रा ठहराना करने के लिए, हम अनुकूलित लाइन स्कैनिंग तकनीक का उपयोग करने के लिए दोनों संवहनी व्यास और व्यक्ति वाहिकाओं के लाल रक्त कोशिका वेग पर कब्जा. मात्रात्मक रक्त प्रवाह इमेजिंग दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग पर विस्तृत संसाधनों ³ उपलब्ध ^{हैं, 12.}

आकृति 1. प्रक्रिया एक बंदरगाहों खिड़की के लिए. (एक कश्मीर के लिए) एक बंदरगाहों खिड़की पैदा करने के लिए प्रक्रिया में अनुक्रमिक चरणों की छवियाँ. पाठ के लिए विस्तृत निर्देश देखें. β = पर्वबिन्दु और λ = लैम्ब्डा. (एल) संवेदनाहृत तैयारी की इमेजिंग के दौरान सिर हासिल करने के लिए बोल्ट और अखरोट प्रणाली. (एम) कस्टम जाग तैयारी के लिए पार पट्टी सिर माउंट machined किया. इस उदाहरण में, एक संबंधक भी दोहराया विद्युत - प्रान्तस्थालेख रिकॉर्डिंग के लिए प्रत्यारोपित किया गया था. (एन)योजनाबद्ध आरेख सिर माउंट और विभिन्न घटकों की स्थिति की पृष्ठीय दृश्य दिखा. पैनल एल में अखरोट का प्रयोग पैनल एम. दो में पार पट्टी का उपयोग करने के लिए विकल्प के रूप में मतलब है # 000 आत्म दोहन शिकंजा जाग इमेजिंग तैयारी के साथ जोड़ा स्थिरता के लिए पार बार माउंट के साथ जोड़ रहे हैं. (का.) योजनाबद्ध एक बंदरगाहों खिड़की के पार अनुभाग दिखा आरेख.

चित्रा 2. माउस प्रांतस्था में vasculature को और neuronal संरचना की दो photon इमेजिंग. खिड़की ¹⁰ आरोपण के बाद 2 दिनों में सभी छवियों एक बंदरगाहों खिड़की के माध्यम से एक माउस-YFP Thy1 में एकत्र किए गए. राज्याभिषेक वाहिका संरचना (ए) और dendrites (बी) के संबंध में पतला खोपड़ी दिखा अभिविन्यास में ऊतक के 150 माइक्रोन अधिक से अधिक से अधिक प्रक्षेपण. हड्डी (नीला) 450 एनएम उत्सर्जन पर 900 एनएम उत्तेजना के साथ दूसरा हार्मोनिक प्रतिदीप्ति संग्रह के द्वारा पाया गया था 6 dextran द्वारा चिह्नित किया गया. न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान फ़ील्ड्स (हरा) Thy1 YFP ट्रांसजेनिक माउस लाइन अंतर्जात हैं. (CH) के ऊतक के 50 माइक्रोन से अधिक पिया नीचे अलग गहराई में क्षैतिज ओरिएंटेशन में अधिक से अधिक अनुमानों. डेटा एक ही छवि पैनलों में दिखाया ढेर से ए और बी Dural वाहिकाओं cortical सतह (सी में तीर) के ऊपर दिखाई हो सकता है.

लघुरूप

ACSF = कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ
बंदरगाहों = पॉलिश और प्रबलित पतला खोपड़ी खिड़की
YFP = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन

^मैं सुनिश्चित करें कि वर्णित प्रक्रियाओं अपने स्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल के द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं और समिति का प्रयोग करें.

Discussion

दो photon इमेजिंग एक बंदरगाहों खिड़की के माध्यम से पतला हड्डी और ड्यूरा, जो लेज़र प्रकाश attenuates और अधिक से अधिक ⁸ गहराई में ऑप्टिकल aberrations कहते हैं के माध्यम से प्रसारण की आवश्यकता है. हालांकि, इस खामी के बावजूद, PIAL सतह के नीचे 250 माइक्रोन इमेजिंग गहराई 900 एनएम उत्तेजना के साथ प्राप्त किया जा सकता है. ग्रेटर इमेजिंग गहराई सिद्धांत रूप में लंबे समय तक उत्तेजना ¹³ तरंगदैर्य के साथ संभव हो सकता है. इस पद्धति का एक प्रमुख लाभ cortical सूजन का अभाव है कि transiently पूरा कपाल - उच्छेदन ^{14, 15} से जुड़े तरीकों में मौजूद हो सकता है. एक अच्छी तरह से तैयार बंदरगाहों angiogenesis या सूजन की कोई प्रकट संकेत ⁸ आरोपण के बाद दिखाना चाहिए. इस इमेजिंग वाहिका संरचना संरचना के द्वारा प्रयोग के दौरान vivo में मूल्यांकन किया जा सकता है, या, microglia का CX (3) CR1 - GFP माउस ⁸ लाइन ^{16, 17,} में morphological परिवर्तन का पता लगाने के द्वारा. इसके अलावा, लिए पोस्ट अस्थायी immunohistology प्रती होना चाहिएसतही प्रांतस्था में astrogliosis के अभाव की पुष्टि करने के लिए, उदाहरण के लिए, glial सूक्ष्मतंतु सम्बन्धी अम्लीय ⁸ प्रोटीन के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग का गठन.

एक बंदरगाहों खिड़की पैदा करने में सबसे अधिक मांग कदम मोटाई में 10 से 15 माइक्रोन हड्डी thinning के है. एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे खिड़की की आवधिक परीक्षा भी thinning के प्रक्रिया के दौरान खोपड़ी मोटाई गेज करने के लिए उपयोगी है. Cortical सतह के पास प्रतिदीप्त लेबल गीला खोपड़ी के माध्यम से स्पष्ट रूप से दिखाई होना चाहिए. खोपड़ी मोटाई का एक और अधिक सटीक उपाय के लिए, हड्डी से दूसरे हार्मोनिक संकेत के दो photon माइक्रोस्कोपी (2A छवि 2C करने के लिए) के तहत एक तीन आयामी ढेर में मापा जा सकता है. यदि यह गोंद और कवर गिलास, हड्डी के आवेदन करने के लिए पहले किया जाता है और यदि आवश्यक हो तो आगे से पतला किया जा सकता है. अपर्याप्त गरीब इमेजिंग गहराई में परिणाम thinning. चमकाने के लिए खोपड़ी पतली जब ड्रिलिंग अब संभव नहीं है जारी रखने के लिए, और मदद करेगासतह अनियमितताओं और कम पक्षपाती हड्डी चिप्स. प्रारंभिक अध्ययन में हमने पाया है कि चमकाने प्रारंभिक आरोपण के बाद इमेजिंग गहराई सप्ताह में सुधार. हालांकि, चमकाने के लाभ पर एक कठोर विश्लेषण प्रदर्शन नहीं किया गया है.

cyanoacrylate और हड्डी के ऊपर कवर कांच गोंद का आवेदन प्रकाश बिखरने को कम करने के लिए और गहरी इमेजिंग के लिए अनुमति के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. ड्रिलिंग प्रक्रिया के कारण हड्डी की सतह अनियमित हो, चमकाने के बाद भी, और इसलिए प्रकाश बिखरने. cyanoacrylate गोंद का आवेदन इन अनियमितताओं में भरता है और overlying कवर गिलास एक गैर - बिखरने चिकनी सतह छोड़ देता है. महत्वपूर्ण बात, गोंद और कवर ग्लास, जो निर्माता विनिर्देशों के अनुसार 1.45 और 1.52 है, के लिए अपवर्तक सूचकांक ¹⁸ 1.55 पर मिलकर कर रहे हैं अनुक्रमित कि हड्डी के लिए मिलान. यह पतला खोपड़ी के ऊपर हवा या पानी होने पर एक सुधार है, जिसमें 1.00 की अपवर्तक सूचकांक हैघ 1.33. गंभीर, cyanoacrylate गोंद के आगे फिर से विकास की हड्डी को बाधित करने में मदद करता है. यह तीन महीने के लिए आरंभिक सर्जरी के बाद अतिरिक्त रखरखाव के लिए आवश्यकता के बिना अनुदैर्ध्य इमेजिंग, सक्षम बनाता है.

गरीब इमेजिंग गहराई का एक दूसरा कारण ख़ून का बहाव या edema के लिए अग्रणी PIAL वाहिकाओं को नुकसान है. ड्रिल से कंपन को कम से कम किया जाना चाहिए. मामलों के एक छोटे से अनुपात में, ड्यूरा के भीतर खून बह रहा है अपरिहार्य हो जाएगा. इसका कारण यह है ड्यूरा मेटर की vasculature खोपड़ी के संवहनी जाल, जो thinning के प्रक्रिया के दौरान परेशान है साथ निरंतर है. उप dural खून बह रहा का कोई संकेत के साथ तैयारी dural और अधिक मोटा होना और angiogenesis के रूप में पीछा करना होगा करने के लिए त्याग किया जाना चाहिए. बंदरगाहों खिड़की की सफलता दर के रूप में अभ्यास के साथ 80% के रूप में उच्च के रूप में हो सकता है.

कुछ प्रयोगों के लिए, यह रंग / वायरस इंजेक्षन या बंदरगाहों खिड़की के नीचे के ऊतकों में इलेक्ट्रोड डालने के लिए आवश्यक हो सकता है. यह संभव है एक छोटे से उत्पन्नआसन्न छेद खिड़की, जिसके माध्यम से pipettes या इलेक्ट्रोड stereotaxic हाथ या Sutter ¹⁹ जोड़तोड़ का उपयोग शुरू किया जा सकता है. इस छेद हड्डी मोम के साथ resealed किया जा सकता है अगर पशु फिर से भविष्य के सत्रों में imaged किया जा रहा है. हालांकि, इलेक्ट्रोड की शुरूआत प्रांतस्था और तीव्र अवसाद प्रसार के रूप में विकृति विज्ञान में पाठ्यक्रम की सूजन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

बंदरगाहों खिड़की अच्छी तरह से किसी भी इमेजिंग मस्तिष्क के लिए ऑप्टिकल का उपयोग की आवश्यकता साधन के लिए अनुकूल किया जाना चाहिए. यह सतह के रूप में आंतरिक ऑप्टिकल ²⁰ इमेजिंग और लेजर इमेजिंग, ²¹ या confocal ²² या ²³ दो photon माइक्रोस्कोपी के रूप में ऑप्टिकल तकनीक सेक्शनिंग छींटेदार करना इमेजिंग तकनीक शामिल है. इसके अलावा, एक बंदरगाहों तैयारी के विस्तृत क्षेत्र transcranial के रूप में ऑप्टिकल जुटना ²⁴ टोमोग्राफी और photoacoustic ²⁵ माइक्रोस्कोपी इमेजिंग तकनीक में संकल्प में सुधार करना चाहिए.

अंत बंदरगाहों खिड़की हैकवर कांच के रूप में जाग जानवरों की इमेजिंग के लिए उपयुक्त ⁴ खिड़की करने के लिए कठोरता कहते हैं. सिर माउंट आगे दो स्वयं दोहन contralateral गोलार्द्ध # 000 शिकंजा दंत सीमेंट (1L छवि) के आवेदन करने के लिए पहले की शुरूआत से स्थिर है. सिर निर्धारण करने के लिए habituation इमेजिंग के दौरान कम पशु आंदोलन के लिए महत्वपूर्ण है. धीरे - धीरे एक नया पशु इमेजिंग के लिए पहले 3 से 7 दिन की अवधि से अधिक किया जा सकता है सिर संयम के लिए आदी, 15 मिनट के सत्र के साथ शुरू करने और कई घंटे तक काम कर रहे है.