Summary
Une méthode simple est décrite pour analyser les effets de fibroblastes de tissus sur les cellules épithéliales associées. La combinaison de cette méthode et la culture de tissus en trois dimensions peut faciliter l'analyse des cellules après l'isolement de la 3D. La technique est applicable à des cellules plus ou moins de potentiel malin, permettant l'étude systématique des effets de associé à une tumeur du stroma sur les cellules tumorales.
Abstract
Bien que des efforts énormes ont été consacrés à l'identification des voies de signalisation et des molécules impliquées dans les comportements de cellules normales et malignes 1-2, une grande partie de ce travail a été fait à l'aide classique en deux dimensions des modèles de culture de cellules, qui permettent de la manipulation des cellules facile. Il est devenu clair que les voies de signalisation intracellulaires sont touchés par les forces extracellulaires, y compris la dimensionnalité et la tension superficielle de cellules 3-4. De multiples approches ont été prises pour développer des modèles tridimensionnels qui représentent plus précisément l'architecture des tissus biologiques 3. Bien que ces modèles intègrent multi-dimensionnalité et les contraintes architecturales, l'étude des effets conséquents sur les cellules est moins facile que dans la culture de tissus à deux dimensions en raison des limites des modèles et de la difficulté à extraire des cellules pour une analyse ultérieure.
Le rôle important du microenvironnement autour des tumeurs dans la tumorigenèse et le comportement de tumeur is de plus en plus reconnue 4. Stroma tumoral est composé de plusieurs types de cellules et molécules extracellulaires. Au cours du développement tumoral il ya des signaux bidirectionnels entre les cellules tumorales et les cellules stromales 5. Bien que certains facteurs participant à la tumeur du stroma co-évolution ont été identifiés, il ya encore un besoin de développer des techniques simples à identifier systématiquement et d'étudier l'éventail complet de ces 6 signaux. Les fibroblastes sont les cellules les plus abondantes dans normales ou associé à une tumeur des tissus stromales, et de contribuer au dépôt et à l'entretien de la membrane basale et les facteurs de croissance paracrines 7.
De nombreux groupes ont utilisé trois systèmes de culture dimensions pour étudier le rôle des fibroblastes sur diverses fonctions cellulaires, y compris la réponse tumorale aux traitements, le recrutement de cellules immunitaires, des molécules de signalisation, la prolifération, l'apoptose, l'angiogenèse et l'invasion 8-15. Nous avons optimisé une méthode simple pour le culesser les effets de fibroblastes mammaires sur les cellules épithéliales mammaires en utilisant un modèle de matrice extracellulaire disponible dans le commerce pour créer des cultures tridimensionnelles de populations de cellules mixtes (co-cultures) 16-22. La co-culture avec des cellules suite former des sphéroïdes avec le regroupement des fibroblastes à l'intérieur et les cellules épithéliales largement à l'extérieur des sphéroïdes et formant multicellulaires saillies dans la matrice. Manipulation des fibroblastes qui mène à invasivité des cellules altérées épithéliale peut être facilement quantifié par des changements dans le nombre et la durée des projections épithéliales 23. En outre, nous avons mis au point une méthode pour isoler les cellules épithéliales sur trois dimensions de co-culture qui facilite l'analyse des effets de l'exposition sur le comportement des fibroblastes épithéliale. Nous avons constaté que les effets de la co-culture persister pendant des semaines après l'isolement de cellules épithéliales, ce qui permet amplement de temps pour effectuer des essais multiples. Cette méthode est adaptable à des cellules devariant potentiel malin et ne nécessite aucun équipement spécialisé. Cette technique permet une évaluation rapide des modèles cellulaires in vitro dans des conditions multiples, et les résultats correspondants peuvent être comparés à des modèles in vivo de tissus animaux ainsi que des échantillons de tissus humains.
Protocol
1. L'établissement en trois dimensions co-cultures
- Le jour avant d'établir des co-cultures, retirez le Matrigel du congélateur et le dégel de la glace dans un 4 ° C réfrigérateur pendant la nuit.
- Le jour de l'expérience, pour préparer le milieu de co-culture, qui correspond à la moyenne pour les cellules épithéliales à être utilisés (moyenne HMEC dans cet exemple: DME/F12 milieu avec 10% de sérum bovin veau, 5 pg / ml d'insuline , 1 ug / ml d'hydrocortisone et 1 ng / ml EGF). Gardez le support sur la glace au moins 1 heure avant de les mélanger avec Matrigel.
- Pour diluer le Matrigel décongelé, déterminer la quantité totale souhaitée de Matrigel: moyen (300 ul par puits pour plaques à 24 puits) et ajouter la moitié de ce volume de glace froide moyennes HMEC dans un tube stérile sur la glace. Puis ajouter le même demi-volume total de Matrigel décongelé au tube pour obtenir une dilution 1:1. Garder le tube sur la glace.
- Placer 50 uL de Matrigel: mélange de milieu mi-bien dans les puits désignés d'une plaque de 24 puits etincuber pendant 10 min dans un incubateur à 37 ° C avec de l'air humidifié et 5% de CO 2.
- Ajouter un supplément de 450 pi de Matrigel: mélange de milieu dans les puits et incuber pendant 60 minutes.
- Au cours de l'incubation, préparer une suspension 1:1 de fibroblastes (ici fibroblastes de réduction de la h-TERT-immortalisées mammaires exprimant la GFP) et les cellules épithéliales (ici h-TERT-humaines immortalisées ligne mammaire des cellules épithéliales exprimant RFP) à une concentration de 0,5 x 10 5 cellules chacune dans 0,5 ml de milieu HMEC.
- Après l'étape d'incubation de 60 minutes, faire tomber doucement la suspension de cellules sur la surface du gel, solidifié, et retourner la culture dans l'incubateur.
- Ne dérangez pas les cultures pendant 2 jours. Après cela, support peut être changé à chaque 2-3 jours par aspiration très légèrement support à partir du côté du puits et lentement le remplacement par du milieu frais HMEC.
- Surveiller la formation sphéroïde quotidienne en microscopie. Les cultures sont généralement matures après 10-14 jours. L'image commeappropriée en utilisant la lumière ou la microscopie à fluorescence. La taille et la longueur de projection Sphéroïde peut être mesurée en microscopie optique.
2. Isolement des cellules de co-cultures Sphéroïde
- Très doucement, pipeter la culture de haut en bas 10x en utilisant un stérile de 2 ml pipette en verre. Sinon, couper la pointe d'une pointe de 1000 microlitre pipette en plastique avec des ciseaux stérilisés par autoclavage ou immersion dans l'éthanol à 70% afin de pipeter la culture. Transférer la culture avec soit la pipette de verre ou la pointe de pipette en plastique à une coupe stérile 15 tube de centrifugeuse ml et centrifugeuse pendant 5 min à 2000 tours par minute à température ambiante. Les sphéroïdes cellulaires seront sédiments au fond.
- Utilisez un embout de pipette Pasteur stérile pour enlever délicatement le Matrigel perturbé par le haut du tube centrifugé.
- Ajouter 1 ml HMEC moyen des sphéroïdes granulés, pipeter haut et en bas 2-3 fois avec une pipette stérile de 2 ml en verre, et de transférer la culture d'un puits dans un de 24 puitsplaque de culture tissulaire.
- Autoriser les sphéroïdes de joindre à l'antenne pendant au moins 48 heures avant de changer le milieu. Au fil du temps, les cellules seront quitter les structures sphéroïdales et de grandir sous forme de monocouches.
- Passage de la cellule cultures lorsque les cellules atteignent 50% de confluence. En premier la culture d'un plat de 35 mm (environ 2-4 jours), puis à un plat de 100 mm (environ 3-5 jours). Immédiatement avant chaque étape de passage, utilisez une pipette Pasteur stérile pour supprimer manuellement le plus grand nombre résiduels "sphéroïdes fantômes» que possible.
- Analyser les cellules par cytométrie en flux pour la pureté de la population à l'aide appropriées marqueurs de surface cellulaire et d'autres populations cellulaires distinctes différents par tri cellulaire par fluorescence, si nécessaire. Les cellules isolées sont maintenant prêtes pour une analyse plus poussée comme vous le souhaitez.
3. Les résultats représentatifs
En trois dimensions sphéroïde co-cultures, les fibroblastes avec d'ingénierie Tiam1 silencing induit l'invasion accrue dans matrix par les cellules épithéliales mammaires (figure 1, comparer D, E, F à A, B, C). Fibroblastes avec conçus sur-expression de Tiam1 induire l'invasion matrice diminué par la lignée cellulaire de cancer du sein SUM159 (Figure 1, comparer J, K, L à G, H, I).
Une fois que la co-culture sphéroïdes ont été mis en place, les populations de cellules peuvent être isolées à partir de sphéroïdes par replaquage dans un contexte à deux dimensions, comme le montre la figure 2. Selon les taux de croissance relatifs des cellules testées, des populations pures peuvent émerger à travers une série de passages (comme le montre la figure 3) ou peuvent être triés à l'aide des marqueurs de cellules appropriées. Après isolement de la 3D co-culture, les cellules épithéliales de conserver les propriétés conférées par la co-culture avec des fibroblastes sur des périodes de temps prolongées, ce qui permet amplement l'occasion pour l'analyse. Dans cet exemple, l'exposition à Tiam1 déficientes fibroblastes induit une migration accrue en co-cultivées HMECs qui a persisté pendant une semaineprès avoir l'isolement de la 3D co-culture (Figure 4).
Figure 1. Imagerie du sphéroïde créé des co-cultures en microscopie optique et de fluorescence. Cultures sphéroïdes sont établis avec lignées de cellules épithéliales mammaires et des fibroblastes et a permis de croître en culture pendant 10-14 jours. AF: épithéliales = Une HMEC-mCherry cellules. GL: les cellules épithéliales = Une SUM159-mCherry cellules. AC, IG: fibroblastes = contrôle RMF-GFP cellules. DF: fibroblastes = RMF-GFP avec Tiam1 silence. JL: fibroblastes = RMF-GFP avec Tiam1 sur-expression. Les flèches indiquent les projections épithéliales invasion dans la matrice.
Figure 2. Imagerie de série de cultures en microscopie optique et de fluorescence après l'isolement de la culture Matrigel. Jour 0 représente l'imagerie immédiatement après l'isolement, les jours 1, 2 et5 indiquent jours après l'isolement. La couronne de cellules qui quittent les augmentations de sphéroïdes au fil du temps. Finalement, un «fantôme» sphéroïde avec très peu de cellules reste (flèche). Sphéroïdes il reste très peu après le retrait fantôme et le premier passage.
Figure 3. Analyse par cytométrie en flux des cellules après isolement de Matrigel co-culture. Après sphéroïde co-cultures ont mûri, les cellules sont isolées de la 3D co-culture avec le pipetage et de série repiquage. Aliquotes sont analysées par cytométrie en flux (dans cet exemple en utilisant la fluorescence verte et rouge de fluorescence pour identifier GFP-exprimer les fibroblastes et les mCherry-exprimant les cellules épithéliales, respectivement) pour déterminer les populations relatives des cellules épithéliales et des fibroblastes.
Figure 4. La migration Transwell de HMECs persiste après isolatià partir de Matrigel co-culture. Une fois que les populations pures ont été obtenues grâce à la culture ou le tri de cellules à fluorescence, les cellules peuvent être analysées comme vous le souhaitez. Voici la migration des HMECs co-cultivées avec un groupe témoin (C) ou Tiam1 déficientes (SHT) à travers des fibroblastes transwells perforées a été évaluée aux semaines 2, 4 et 8 après l'isolement de co-culture.
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Discussion
La méthode présentée ici représente une approche simple pour analyser les effets des fibroblastes du stroma sur les cellules épithéliales, y compris les cellules tumorales. Il permet de directement l'interaction cellule-cellule dans un contexte tridimensionnel pris en charge par la matrice extracellulaire de la membrane basale, tout en permettant une extraction facile des cellules de la matrice pour une analyse plus approfondie. Cela peut être appliqué à l'étude de associé à une tumeur stroma, comme des lignes de fibroblastes peut être manipulé pour affecter les voies de signalisation de choix et les lignes épithéliales peut varier de potentiel invasif, comme représenté sur la figure 1. La 3D co-culture modèle permet de vérifier visuellement que les changements dans envahissant des cellules ont été induits. Le protocole d'isolement permet l'extraction de cellules à partir des cultures 3D avec un minimum de manipulation et évite l'utilisation de la trypsine ou la matrice à dissolution agents qui pourraient influer sur les propriétés des cellules. Les effets de l'exposition à des fibroblastes en 3D co-culture persistent dans les cellules épithéliales arrièreisolement er de la 3D co-culture, de faciliter l'analyse ultérieure (Figure 4). Bien que l'exemple montré ici illustre les effets sur la migration des cellules, tout essai applicable aux cellules en croissance en 2D peut être utilisé sur des cellules isolées. Nous avons utilisé cette méthode pour analyser les effets de la variation des fibroblastes Tiam1 expression sur le comportement des cellules épithéliales mammaires associées. Tiam1 déficit dans les fibroblastes favorise l'invasion des cellules mammaires tumorale et les métastases dans la culture 3D et les modèles animaux de tumeurs 23. Cette méthode nous a permis d'analyser potentiels voies impliquées en utilisant des dosages moléculaires, biochimiques et fonctionnels (Liu et Buchsbaum, sous presse).
Il est important d'utiliser des lignées de cellules seulement en excellente santé et d'adhérer à une technique stérile rigoureux afin de prévenir la contamination des cultures au cours du processus. Les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant des cellules de début plutôt que de passages tardifs (nombre de passages précis variera en fonction de la spéciic cellules de la lignée cellulaire) et de la récolte à des densités entre la confluence de 50-80%. Manipulation précise de Matrigel selon le protocole est la clé afin de faciliter à la fois de liquéfaction complète avant d'établir des co-cultures et de veiller à la solidification complète de la matrice avant l'addition des cellules. Montant insuffisant ou d'une solidification de la matrice se traduira par des cellules de culture en monocouche plutôt que dans sphéroïdes dans les cultures. Lors de la première place du sphéroïde co-cultures, la mise en place d'une première de 50 plug ul dans le puits permet de solidification ancrage solide et plus uniforme de la matrice finale, ce qui est essentiel à la formation sphéroïde uniformément répartie. Suppression de toutes les sphéroïdes fantômes à des étapes de passage post-isolation est essentielle si le tri de cellules automatisé doit être utilisé pour séparer des populations mixtes. Les exemples présentés ici utilisent rouge de phénol Matrigel libre avec la composition en protéines d'environ 10 mg / ml. La préparation rouge de phénol libre permet de détecter la couleur à Assays, telles que la fluorescence.
Cette technique peut être appliquée à une gamme de types de cellules dans le but d'étudier les effets de fibroblastes du stroma sur associés tumeurs des cellules épithéliales ou inversement, les effets des cellules tumorales sur les fibroblastes associés. Cette technique permet une évaluation rapide des modèles cellulaires in vitro dans des conditions multiples, et les résultats correspondants peuvent alors être comparés à des modèles in vivo de tissus animaux ainsi que des échantillons de tissus humains.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
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