Summary
एक साधारण विधि के जुड़े उपकला कोशिकाओं पर ऊतक fibroblasts के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए वर्णित है. इस विधि और तीन आयामी ऊतक संस्कृति के संयोजन 3 डी से अलगाव के बाद कोशिकाओं के विश्लेषण की सुविधा कर सकते हैं. तकनीक घातक संभावित अलग की कोशिकाओं के लिए लागू है, ट्यूमर कोशिकाओं पर ट्यूमर जुड़े stroma के प्रभाव के व्यवस्थित अध्ययन की अनुमति देता है.
Protocol
1. तीन आयामी सह संस्कृतियों की स्थापना
- सह संस्कृतियों की स्थापना से पहले दिन, फ्रीजर और एक 4 ° सी फ्रिज में बर्फ पिघलना पर से Matrigel रातोंरात हटा.
- 10% गोजातीय सीरम बछड़ा, 5 μg / एमएल इंसुलिन के साथ DME/F12 मध्यम प्रयोग के दिन पर, सह संस्कृति है, जो उपकला कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा मध्यम (इस उदाहरण में HMEC मध्यम से मेल खाती है के लिए मध्यम तैयार 1 μg / एमएल hydrocortisone, और 1 एनजी / एमएल EGF). बर्फ कम से कम 1 घंटे Matrigel साथ मिश्रण से पहले पर मध्यम रखें.
- , Thawed Matrigel पतला करने के लिए, Matrigel की कुल वांछित मात्रा का निर्धारण: मध्यम (300 प्रति 24 अच्छी तरह से प्लेट के लिए μL) और बर्फ पर एक बाँझ ट्यूब कि बर्फ ठंड HMEC मध्यम के आधा मात्रा जोड़ें. फिर ट्यूब, thawed Matrigel का एक ही आधा कुल मात्रा जोड़ने के लिए एक 1:1 कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए. बर्फ ट्यूब रखें.
- जगह Matrigel 50 μL: 24 अच्छी तरह से एक थाली के कुओं में मध्यम मध्य अच्छी तरह से मिश्रण औरhumidified हवा और 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- कुओं मध्यम मिश्रण और एक और 60 मिनट के लिए सेते हैं: Matrigel की एक अतिरिक्त 450 μL जोड़ें.
- ऊष्मायन के दौरान, 0.5 x 10 के एक एकाग्रता में (ज tert - अमर न्यूनीकरण स्तन GFP व्यक्त Fibroblasts) के fibroblasts और उपकला कोशिकाओं (यहाँ ज tert - अमर मानव स्तन उपकला सेल आरएफपी व्यक्त लाइन) के एक 1:1 निलंबन तैयार HMEC माध्यम के 0.5 मिलीग्राम में 5 प्रत्येक कोशिकाओं.
- 60 मिनट ऊष्मायन कदम के बाद, धीरे जम जेल के शीर्ष पर सेल निलंबन ड्रॉप, और संस्कृति इनक्यूबेटर में लौटने.
- 2 दिनों के लिए संस्कृतियों परेशान नहीं. इस के बाद, हर माध्यम बदला जा 2-3 दिन कर सकते हैं बहुत अच्छी तरह से और धीरे से ताजा HMEC मध्यम के साथ जगह की ओर से धीरे मध्यम aspirating.
- माइक्रोस्कोपी के तहत उपगोल गठन दैनिक मॉनिटर. संस्कृतियों 10-14 दिनों के बाद आम तौर पर परिपक्व हैं. के रूप में छविउचित प्रकाश या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग. उपगोल आकार और लंबाई प्रक्षेपण प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत मापा जा सकता है.
2. उपगोल सह संस्कृतियों से कक्ष का अलगाव
- बहुत धीरे, संस्कृति विंदुक ऊपर और नीचे 10x एक बाँझ 2 - एमएल कांच पिपेट का उपयोग कर. वैकल्पिक रूप से, एक 1000 microliter प्लास्टिक विंदुक के क्रम में संस्कृति विंदुक या 70% इथेनॉल में वाष्पदावी विसंक्रण विसर्जन द्वारा निष्फल कैंची का उपयोग टिप टिप कटौती. या तो ग्लास विंदुक या एक बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब कटौती प्लास्टिक विंदुक टिप और कमरे के तापमान पर 2000 rpm पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के साथ संस्कृति स्थानांतरण. सेलुलर spheroids नीचे में तलछट.
- धीरे Centrifuged ट्यूब के ऊपर से बाधित Matrigel हटाने एक बाँझ पाश्चर विंदुक टिप का उपयोग करें.
- 1 मिलीलीटर HMEC मध्यम जोड़ें pelleted spheroids, पिपेट और नीचे एक बाँझ 2 एमएल कांच विंदुक के साथ 2-3 बार, और एक अच्छी तरह से में 24 अच्छी तरह से संस्कृति स्थानांतरणटिशू कल्चर प्लेट.
- Spheroids कम से कम 48 घंटे के लिए डिश के लिए संलग्न के माध्यम को बदलने के लिए पूर्व अनुमति दें. समय के साथ कोशिकाओं और गोलाकार संरचनाओं को छोड़ने के लिए और monolayers के रूप में विकसित होगा.
- पारित होने सेल संस्कृतियों जब कोशिकाओं को 50% संगम तक पहुँचने. पहले एक 35 मिमी पकवान (लगभग 2-4 दिन) के लिए संस्कृति का विस्तार, और फिर एक 100 मिमी पकवान (लगभग 3-5 दिन) के लिए. तुरंत लिए प्रत्येक बीतने कदम से पहले, एक बाँझ पाश्चर विंदुक का उपयोग करने के लिए मैन्युअल रूप से कई अवशिष्ट संभव के रूप में "भूत spheroids" के रूप में दूर.
- जनसंख्या प्रतिदीप्ति सेल अगर आवश्यक छँटाई के द्वारा उचित कोशिका की सतह मार्करों और आगे अलग अलग सेल आबादी का उपयोग पवित्रता के लिए प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण. अलग कोशिकाओं को अब आगे के विश्लेषण के लिए तैयार हैं के रूप में वांछित.
3. प्रतिनिधि परिणाम
तीन आयामी उपगोल सह संस्कृतियों में, इंजीनियर Tiam1 मुंह बंद करने के साथ fibroblasts मा में वृद्धि हुई आक्रमण प्रेरितस्तन उपकला कोशिकाओं द्वारा ट्रिक्स (चित्रा 1, तुलना डी, ई, एफ एक करने के लिए, बी, सी). साथ fibroblasts इंजीनियर अधिक Tiam1 की अभिव्यक्ति कम स्तन कैंसर कोशिका लाइन SUM159 (चित्रा 1, जी, एच, मैं, जम्मू कश्मीर, एल की तुलना) द्वारा मैट्रिक्स आक्रमण के लिए प्रेरित करना.
एक बार सह सुसंस्कृत spheroids स्थापित किया गया है, सेल आबादी फिर से चढ़ाना द्वारा एक दो आयामी संदर्भ में spheroids से अलग किया जा सकता है, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है. परीक्षण कोशिकाओं के सापेक्ष विकास दर पर निर्भर करता है, शुद्ध आबादी धारावाहिक बीतने के माध्यम से उभरने (के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है) हो सकता है या उचित सेल मार्कर का उपयोग कर हल किया जा सकता है. 3 डी सह संस्कृति से अलगाव के बाद, उपकला कोशिकाओं समय की विस्तारित अवधि में fibroblasts के साथ सह संस्कृति द्वारा प्रदत्त गुणों को बनाए रखने, विश्लेषण के लिए पर्याप्त अवसर की अनुमति है. इस उदाहरण में, Tiam1 की कमी fibroblasts के संपर्क में वृद्धि प्रवास सह सुसंस्कृत HMECs में है कि सप्ताह के लिए बनाए प्रेरित3 डी सह संस्कृति से fter अलगाव (चित्रा 4).
चित्रा 1 स्थापित उपगोल सह संस्कृतियों के प्रकाश माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति के तहत इमेजिंग. पर उपगोल संस्कृतियों स्तन उपकला और तंतुप्रसू सेल लाइनों के साथ स्थापित कर रहे हैं और 10-14 दिनों के लिए संस्कृति में विकसित करने की अनुमति नहीं है. वायुसेना: उपकला कोशिकाओं = HMEC - mCherry. जीएल: उपकला कोशिकाओं = कोशिकाओं SUM159 mCherry. एसी, सैनिक: fibroblast कोशिकाओं = नियंत्रण RMF - GFP. लोमो: तंतुप्रसू = RMF GFP Tiam1 मुंह बंद करने के साथ. जीएल: तंतुप्रसू का = RMF GFP-Tiam1 अधिक अभिव्यक्ति के साथ. तीर उपकला मैट्रिक्स में हमलावर अनुमानों से संकेत मिलता है.
चित्रा 2 Matrigel संस्कृति से अलगाव के बाद प्रकाश माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति तहत संस्कृतियों के सीरियल इमेजिंग. 0 दिन अलगाव के बाद तुरंत इमेजिंग का प्रतिनिधित्व करता है, 1 दिन, 2 औरअलगाव के बाद 5 दिनों से संकेत मिलता है. समय पर उपगोल वृद्धि जा कोशिकाओं के प्रभामंडल. अंततः बहुत कुछ कोशिकाओं के साथ एक "भूत" उपगोल रहता है (तीर). बहुत कुछ spheroids भूत हटाने और पहले पारित होने के बाद रहते हैं.
चित्रा 3. सह संस्कृति Matrigel से अलगाव के बाद कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण. बाद सह संस्कृतियों उपगोल परिपक्व है, कोशिकाओं pipetting साथ 3 डी सह संस्कृति और धारावाहिक passaging से अलग कर रहे हैं. नमूना aliquots प्रवाह cytometry से विश्लेषण कर रहे हैं (इस प्रतिदीप्ति हरी और लाल प्रतिदीप्ति का उपयोग करने के लिए पहचान उदाहरण में GFP व्यक्त fibroblasts और mCherry व्यक्त उपकला कोशिकाओं क्रमशः) उपकला और fibroblast कोशिकाओं के रिश्तेदार आबादी का निर्धारण.
चित्रा 4. HMECs की Transwell प्रवास isolati के बाद बनी रहती हैपर सह संस्कृति Matrigel से. एक बार शुद्ध आबादी संस्कृति या प्रतिदीप्ति सेल छँटाई के माध्यम से प्राप्त किया गया है, कोशिकाओं के रूप में वांछित विश्लेषण किया जा सकता है. यहाँ या तो नियंत्रण (सी) या Tiam1 छिद्रित transwells भर में कमी fibroblasts (shT) के साथ सह - सुसंस्कृत HMECs के प्रवास 2, 4 और 8 सप्ताह में सह संस्कृति से अलगाव के बाद मूल्यांकन किया गया था.
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि stromal fibroblasts की ट्यूमर कोशिकाओं सहित उपकला कोशिकाओं पर प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. यह सेल सेल के लिए एक तीन आयामी कोशिकी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स द्वारा समर्थित संदर्भ में सीधी बातचीत की अनुमति देता है, जबकि आगे के विश्लेषण के लिए सक्षम मैट्रिक्स कोशिकाओं से की आसान निकासी. यह ट्यूमर जुड़े stroma के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, रूप में तंतुप्रसू लाइनों पसंद और उपकला लाइनों आक्रामक क्षमता में भिन्नता है, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया हो सकता है का संकेत दे रास्ते को प्रभावित करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है. 3D मॉडल सह संस्कृति कि सेल invasiveness में बदलाव को प्रेरित किया गया है दृश्य सत्यापन के लिए अनुमति देता है. अलगाव प्रोटोकॉल से निपटने का एक न्यूनतम के साथ 3 डी संस्कृतियों से कोशिकाओं की निकासी के लिए अनुमति देता है और trypsin या मैट्रिक्स - भंग एजेंट के उपयोग से बचा जाता है कि सेल गुण को प्रभावित कर सकते हैं. 3 डी सह संस्कृति में तंतुप्रसू के लिए जोखिम के प्रभाव के उपकला पीछे की कोशिकाओं में जारी रहती हैएर 3 डी सह - संस्कृति से अलगाव, बाद में विश्लेषण (चित्रा 4) की सुविधा. जबकि यहां दिखाए गए उदाहरण में सेल प्रवास पर प्रभाव दर्शाया गया है, किसी भी 2d में बढ़ कोशिकाओं को लागू परख अलग कोशिकाओं पर इस्तेमाल किया जा सकता है. हम जुड़े स्तन उपकला कोशिकाओं के व्यवहार पर तंतुप्रसू Tiam1 अभिव्यक्ति बदलती के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया. Fibroblasts में tiam1 कमी के स्तन ट्यूमर सेल और 3 डी संस्कृति और पशु ट्यूमर 23 मॉडल में आक्रमण मेटास्टेसिस को बढ़ावा देता है. इस विधि हमें की क्षमता शामिल है, जैव रासायनिक, आणविक और कार्यात्मक assays (लियू और Buchsbaum, प्रेस में) का उपयोग करते हुए रास्ते का विश्लेषण करने के लिए सक्षम है.
यह महत्वपूर्ण है केवल उत्कृष्ट स्वास्थ्य में सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए और कठोर बाँझ तकनीक का पालन करने के क्रम में संस्कृतियों की प्रक्रिया के दौरान प्रदूषण को रोकने के. सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जल्दी से कोशिकाओं के बजाय देर से मार्ग का उपयोग (सटीक बीतने संख्या के विशिष्ट पर निर्भर करता है अलग अलग होंगेआईसी लाइन सेल) और कोशिकाओं से 50-80% के संगम के बीच घनत्व पर काटा. प्रोटोकॉल के अनुसार Matrigel की सटीक हैंडलिंग की सुविधा के लिए क्रम में दोनों पूरी liquification के पूर्व सह संस्कृतियों की स्थापना के लिए और कोशिकाओं के अलावा पहले मैट्रिक्स की पूरी तरह से दृढ़ीभवन सुनिश्चित करने की कुंजी है. अपर्याप्त या मैट्रिक्स की राशि दृढ़ीभवन संस्कृतियों में spheroids में बजाय एक monolayer के रूप में बढ़ कोशिकाओं में परिणाम देगा. जब पहली बार सह संस्कृतियों उपगोल स्थापना, अच्छी तरह से में एक प्रारंभिक 50 μl प्लग के स्थान के अंतिम मैट्रिक्स, जो समान रूप से वितरित उपगोल गठन के लिए महत्वपूर्ण है के प्रस्तोता ठोस और अधिक समान solidification के लिए अनुमति देता है. के बाद अलगाव बीतने के चरणों में सब भूत spheroids निकालना महत्वपूर्ण है अगर स्वचालित सेल छँटाई करने के लिए मिश्रित आबादी को अलग किया जा सकता है. उदाहरण यहाँ दिखाया लगभग 10 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन संरचना के साथ phenol लाल मुफ्त Matrigel का उपयोग करें. phenol के लाल मुक्त तैयारी Assa में रंग का पता लगाने के लिए अनुमति देता हैप्रतिदीप्ति जैसे वाईएस.
इस तकनीक को सेल प्रकार की एक श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है क्रम में stromal fibroblasts की संबद्ध उपकला कोशिका ट्यूमर या इसके विपरीत जुड़े fibroblasts पर ट्यूमर कोशिकाओं के प्रभाव पर प्रभाव का अध्ययन. इस तकनीक को कई शर्तों के तहत इन विट्रो सेल मॉडल में तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, और इसी परिणाम तो vivo पशु ऊतक के रूप में अच्छी तरह के रूप में मॉडल मानव ऊतकों के नमूनों में तुलना में किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L.
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
