Summary
En enkel metode er beskrevet for å analysere effekter av vev fibroblaster på tilknyttede epitelceller. Kombinasjonen av denne metoden og tre-dimensjonale vevskultur kan lette analysen av cellene etter isolasjon fra 3D. Teknikken er aktuelt å celler med varierende malignt potensial, slik systematisk studie av effekten av tumor-assosierte stroma på kreftcellene.
Abstract
Mens enorme innsatsen har gått inn i å identifisere signalveier og molekyler involvert i normale og maligne celle oppførsel 1-2, mye av dette arbeidet har blitt utført ved hjelp av klassiske to-dimensjonale cellekultur modeller, som gir mulighet for enkel celle manipulering. Det har blitt klart at intracellulære signalveier er påvirket av ekstracellulære styrker, inkludert dimensjonalitet og celle overflatespenning 3-4. Flere tilnærminger har blitt tatt for å utvikle tredimensjonale modeller som mer nøyaktig representere biologisk vevet arkitektur tre. Selv om disse modellene innlemme multi-dimensjonalitet og arkitektoniske påkjenninger, er studiet av påfølgende effekter på cellene mindre lettvinte enn i to-dimensjonal vevskultur grunn av begrensninger på modeller og vanskeligheten med å trekke ut celler for senere analyse.
Den viktige rolle mikromiljøet rundt svulster i tumorigenesis og tumor atferd is stadig anerkjent 4. Tumor stroma er sammensatt av flere celletyper og ekstracellulære molekyler. Under tumorutviklingen det er toveis signalene mellom tumorceller og stromale celler 5. Selv om noen faktorer som deltar i tumor-stroma co-evolusjon har blitt identifisert, er det fortsatt behov for å utvikle enkle teknikker for å systematisk identifisere og studere hel rekke av disse signalene 6. Fibroblaster er den mest tallrike celletype i normal eller tumor-assosierte stromale vev, og bidra til deponering og vedlikehold av basalmembran og parakrine vekstfaktorer syv.
Mange grupper har brukt tre dimensjonale kultur systemer for å studere rollen fibroblaster på ulike cellulære funksjoner, deriblant tumor respons på behandling, rekruttering av immunceller, signalmolekyler, spredning, apoptose, angiogenese, og invasjon 8-15. Vi har optimalisert en enkel metode for assEssing effekten av brystkjertlene fibroblaster på mammary epitelceller ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig ekstracellulær matriks modell for å lage tre-dimensjonale kulturer blandede celle populasjoner (co-kulturer) 16-22. Med fortsatt co-kulturen cellene danner spheroids med fibroblaster clustering i interiør og epitelceller i hovedsak på utsiden av spheroids og forming flercellede anslag inn i matrisen. Manipulering av fibroblaster som fører til endrede epitelial celle invasivitet lett kan kvantifiseres av endringer i tall og lengde av epitelial anslag 23. Videre har vi utviklet en metode til å isolere epitelceller av tre-dimensjonal co-kulturen som forenkler analyse av virkningene av fibroblast eksponering på epitelial oppførsel. Vi har funnet at effekten av co-kultur vedvare i uker etter epitelial celle isolasjon, tillater god tid for å utføre flere analyser. Denne metoden er tilpasningsdyktige til cellenevarierende malignt potensial og trenger ingen spesialisert utstyr. Denne teknikken gjør det mulig for hurtig evaluering av in vitro Cellemodeller under flere forhold, og de tilsvarende resultatene kan sammenlignes med in vivo animalsk vev modeller så vel som menneskelige vevsprøver.
Protocol
1. Etablering Tredimensjonale Co, kulturer
- Dagen før etablere de øvrige kulturer, fjerne Matrigel fra fryseren og tine på is i en 4 ° C kjøleskap over natten.
- På dagen for forsøket, forberede medium for co-kulturen, som tilsvarer medium for epitelceller som skal brukes (HMEC medium i dette eksemplet: DME/F12 medium med 10% bovint kalveserum, 5 mikrogram / ml Insulin , 1 mikrogram / ml hydrokortison, og 1 ng / ml EGF). Holde mediet på is i minst 1 time forut for blanding med Matrigel.
- Å fortynne tint Matrigel, fastslår den totale ønsket mengde Matrigel: medium (300 mL per brønn for 24-brønns plater) og legg i halvparten at volumet av iskald HMEC medium til et sterilt rør på is. Deretter legger den samme halve totalt volum på tint Matrigel til røret for å oppnå en 1:01 fortynning. Hold røret på is.
- Place 50 mL av Matrigel: middels blanding mid-brønnen i utpekte brønner på en 24-brønn plate oginkuberes i 10 min i et 37 ° C inkubator med luftfuktighet og 5% CO 2.
- Legge til en ekstra 450 mL av Matrigel: middels blanding til brønnene og inkuber for ytterligere 60 minutter.
- Under rugingen, utarbeide en 1:1 suspensjon av fibroblaster (her H-tert-udødeliggjorde reduksjon mammary Fibroblaster uttrykker GFP) og epitelceller (her H-tert-udødeliggjort Menneskelig mammary epithelial Cell linje uttrykker RFP) i en konsentrasjon på 0,5 x 10 5 celler hver på 0,5 ml HMEC medium.
- Etter 60 minutters inkubasjon steg forsiktig slippe cellesuspensjon på toppen av størknet gel, og returnere kultur inkubatoren.
- Ikke forstyrr de kulturene i 2 dager. Deretter kan mediet endres hver 2-3 dager etter meget forsiktig aspirere medium fra siden av brønnen og forsiktig erstatte med frisk HMEC medium.
- Overvåk sfæriske legemet formasjon daglig henhold mikroskopi. Kulturer er generelt moden etter 10-14 dager. Bildet somhensiktsmessig å bruke lys eller fluoriserende mikroskopi. Spheroid størrelse og projeksjon lengde kan måles under lys mikroskopi.
2. Isolering av Celler fra Spheroid Co-kulturer
- Veldig forsiktig, pipetter kulturen opp og ned 10x ved hjelp av en steril 2-ml glass pipette. Alternativt avskåret tuppen av en 1000 mikroliter plast pipettespissen bruke saks steriliseres ved autoklavering eller nedsenking i 70% etanol for å pipetter kulturen. Overfør kultur med enten glass pipette eller kuttet plast pipettespissen til en steril 15 ml sentrifugerør og sentrifuger i 5 min ved 2000 rpm ved romtemperatur. De cellulære spheroids vil sedimentere på bunnen.
- Bruk en steril Pasteur pipette tips å forsiktig fjerne forstyrret Matrigel fra toppen av sentrifugert røret.
- Tilsett 1 ml HMEC medium til pelleterte spheroids, pipetter opp og ned 2-3 ganger med en steril 2 ml glass pipette, og overføre kultur til en brønn i en 24-brønnvevskultur plate.
- La spheroids å feste til parabolen i minst 48 timer før du bytter medium. Over tid cellene vil forlate sfæroidal strukturer og vokse som monolayers.
- Passage på cellekulturer når cellene nå 50% Confluence. Først utvide kultur til et 35 mm rett (ca 2-4 dager), og deretter til en 100 mm tallerken (ca 3-5 dager). Umiddelbart før hver passering trinn, bruker en steril Pasteur pipette for å manuelt fjerne så mange rester "Ghost spheroids" som mulig.
- Analyser cellene med flowcytometri for befolkningen renhet ved hjelp av egnede celleoverflaten markører og ytterligere separate forskjellige celle populasjoner av fluorescens celle sortering om nødvendig. De isolerte celler er nå klar for videre analyse som ønsket.
3. Representative Resultater
I tre-dimensjonal sfæriske legemet co-kulturer, fibroblaster med konstruerte Tiam1 Silencing indusere økt invasjonen i maTrix av mammary epitelceller (Figur 1, sammenligne D, E, F til A, B, C). Fibroblaster med konstruert over-uttrykk for Tiam1 induserer redusert matrise invasjon av brystkreft cellelinje SUM159 (Figur 1, sammenligne J, K, L til G, H, I).
Når co-cultured spheroids har blitt etablert, kan celle populasjoner bli isolert fra spheroids skrevet av re-plating i ett to-dimensjonal kontekst, som vist i figur 2. Avhengig av relative vekstrater på cellene testet, kan ren populasjoner dukke gjennom seriell passasje (som vist på figur 3) eller du kan sorteres ved hjelp av hensiktsmessige celle markører. Etter isolasjon fra 3D co-kulturen, epitelceller beholde egenskapene gitt av co-kulturen med fibroblaster over lengre tid, slik at gode muligheter for analyse. I dette eksempelet, induserte eksponering for Tiam1-mangelfull fibroblaster økt migrasjon i samarbeid dyrkede HMECs som vedvarte i flere uker enfter isolasjon fra 3D co-kulturen (figur 4).
Figur 1. Imaging av etablert sfæriske legemet co-kulturer under lys og fluorescens mikroskopi. Spheroid kulturer er etablert med mammary epiteliale og fibroblast cellelinjer og lov til å vokse i kulturen i 10-14 dager. AF: epiteliale = HMEC-mCherry celler. GL: epitelceller = SUM159-mCherry celler. AC, GI: fibroblast = kontroll RMF-GFP celler. DF: fibroblast = RMF-GFP med Tiam1 stanse. JL: fibroblast = RMF-GFP med Tiam1 over-uttrykk. Piler indikere epiteliale projeksjoner invaderende inn i matrise.
Figur 2. Serial avbildning av kulturer under lys og fluorescens mikroskopi etter isolasjon fra Matrigel kultur. Dag 0 representerer bildebehandling umiddelbart etter isolasjon; dag 1, 2 og5 indikerer dager etter isolasjon. Koronaen av celler forlater de Spheroid øker over tid. Til slutt et "spøkelse" sfæriske legemet med svært få celler forblir (pil). Veldig få spheroids igjen etter spøkelse fjerning og første passasje.
Figur 3. Flowcytometri analyser av celler etter isolasjon fra Matrigel co-kulturen. Etter sfæriske legemet co-kulturer har utviklet seg, er celler isolert fra 3D co-kulturen med pipettering og seriell passaging. Smak alikvoter blir analysert med flowcytometri (i dette eksempelet bruker grønn fluorescens og rød fluorescens å identifisere GFP-uttrykke fibroblaster og mCherry-uttrykker epitelceller henholdsvis) for å bestemme relativ bestander av epiteliale og fibroblast celler.
Figur 4. Transwell migrasjon av HMECs vedvarer etter isolatividere fra Matrigel co-kulturen. Når rene bestander har blitt oppnådd gjennom kultur eller fluorescens celle sortering, kan cellene kan analyseres som ønsket. Her migrasjon av HMECs co-kultivert med enten kontroll (C) eller Tiam1 mangelfulle (ark) fibroblaster tvers perforerte transwells ble vurdert ved 2, 4 og 8 uker etter isolasjon fra co-kulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteres her er en enkel tilnærming til å analysere effektene av stromale fibroblaster på epiteliale celler, inkludert tumor celler. Det tillater for direkte celle-celle interaksjon innenfor en tre-dimensjonal sammenheng som støttes av ekstracellulær basalmembran matrix, samtidig som enkel ekstraksjon av celler fra matrix for videre analyse. Dette kan brukes til studier av tumor-assosierte stroma, som fibroblast linjer kan bli manipulert til å påvirke signalveiene av valg og epiteliale linjer kan variere i invasiv potensial, som vist på figur 1. 3D co-kulturen Modellen gir mulighet for visuell bekreftelse på at endringer i cellen invasivitet har blitt indusert. Den isolasjon protokollen åpner for utvinning av celler fra 3D kulturer med et minimum av håndtering og unngår bruk av trypsin eller Matrix-løser seg opp midler som kan påvirke celle egenskaper. Effekten av eksponering for fibroblast i 3D co-kulturen vedvarer i epitelceller aktreER isolasjon fra 3D co-kultur, tilrettelegging påfølgende analyse (figur 4). Mens eksempel vises her skildrer effekter på celle migrasjon, kan enhver analysen gjelder for celler som vokser i 2D benyttes på de isolerte cellene. Vi har brukt denne metoden for å analysere virkningene av varierende fibroblast Tiam1 uttrykk på oppførselen til tilhørende mammary epitelceller. Tiam1 mangel på fibroblaster fremmer mammary tumorcelle invasjon og metastasering i 3D kultur og animalske tumormodeller 23. Denne metoden har gitt oss mulighet til å analysere potensielle er involvert veier ved hjelp av molekylære, biokjemiske og funksjonelle tester (Liu og Buchsbaum, in press).
Det er viktig å bruke bare cellelinjer i god helse og å følge strenge steril teknikk for å hindre forurensning av kulturer under prosessen. De beste resultatene oppnås ved hjelp av celler fra tidlige snarere enn slutten passasjer (nøyaktig passasje antallet vil variere avhengig av Spesifikkic celle linje) og fra celler høstet i tettheter mellom 50-80% samløpet. Presis håndtering av Matrigel ifølge protokollen er nøkkelen for å tilrettelegge for både komplett liquification før etablering co-kulturer og for å sikre grundig herding av matrisen før tillegg av cellene. Utilstrekkelig mengde eller størkning av matrisen vil resultere i celler som vokser som en monolayer snarere enn i spheroids i kulturer. Når først etablere sfæriske legemet co-kulturer, tillater plassering av en innledende 50 mL plugg i brønnen for solid forankring og mer ensartet størkning av endelig matrise, som er viktig for å jevnt fordelt sfæriske legemet formasjon. Fjerning av alle spøkelse spheroids på post-isolasjon passasje trinn er kritisk hvis automatisert celle sortering skal brukes til å skille blandede bestander. De eksemplene som er vist her bruker fenol-rød gratis Matrigel med protein sammensetning på ca 10 mg / ml. Den fenol-røde gratis forberedelse tillater fargegjenkjenning i assaYS, som fluorescens.
Denne teknikken kan brukes til en rekke celletyper for å studere effekter av stromale fibroblaster på tilknyttede epiteliale celletumorer eller omvendt effekt av kreftceller på tilknyttede fibroblaster. Denne teknikken gjør det mulig for rask evaluering av in vitro-celle modeller under flere forhold, og de tilsvarende resultatene kan deretter sammenlignes med in vivo animalsk vev modeller så vel som menneskelige vevsprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L.
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
