Summary
Eine einfache Methode ist für die Analyse von Auswirkungen von Fibroblasten aus dem Bindegewebe auf verbundene Epithelzellen beschrieben. Die Kombination dieser Verfahren und dreidimensionalen Gewebekultur Analyse von Zellen nach der Isolierung aus 3D zu erleichtern. Die Technik ist für Zellen unterschiedlicher maligne Potential, so dass systematische Untersuchung der Wirkungen von Tumor-assoziiertem Stroma auf Tumorzellen.
Abstract
Während die enormen Anstrengungen haben sich identifizieren Signalwege und Moleküle in normalen und malignen Zelle Verhaltensweisen 1-2, einen Großteil dieser Arbeit geleistet worden ist mit klassischen zweidimensionalen Zellkultur-Modellen, die für eine einfache Handhabung ermöglichen Zelle beteiligt sind verschwunden. Es ist deutlich geworden, dass intrazelluläre Signalwege durch extrazelluläre Kräfte, einschließlich der Dimensionalität und Zelle Oberflächenspannung 4.3 sind betroffen. Mehrere Ansätze wurden ergriffen, um dreidimensionale Modelle zu entwickeln, dass mehr genau darstellen biologische Gewebe-Architektur 3. Während diese Modelle verfügen über Multi-Dimensionalität und architektonischen betont, ist der Studie die resultierenden Auswirkungen auf Zellen weniger leicht als in zweidimensionalen Zellkultur aufgrund der Einschränkungen der Modelle und der Schwierigkeiten bei der Gewinnung von Zellen für die anschließende Analyse.
Die wichtige Rolle der Mikroumgebung um Tumoren in der Tumorgenese und Tumor-Verhalten is zunehmend erkannt 4. Tumor-Stroma besteht aus mehreren Zelltypen und extrazellulären Molekülen zusammengesetzt. Während der Tumor-Entwicklung gibt es bidirektionale Signale zwischen Tumorzellen und Stromazellen 5. Obwohl einige Faktoren, die an Tumor-Stroma-Co-Evolution identifiziert wurden, gibt es immer noch ein Bedarf an einfachen Techniken systematisch zu identifizieren und untersuchen die volle Palette von diesen Signalen 6 zu entwickeln. Fibroblasten sind die am häufigsten vorkommende Zelltyp im normalen oder Tumor-assoziierten Stroma-Gewebe, und tragen zur Abscheidung und Wartung der Basalmembran und parakrine Wachstumsfaktoren 7.
Viele Gruppen haben dreidimensionale Kultur-Systemen verwendet werden, um die Rolle der Fibroblasten auf verschiedenen zellulären Funktionen, einschließlich Ansprechen des Tumors auf Therapien, Rekrutierung von Immunzellen, Signalmolekülen, Proliferation, Apoptose, Angiogenese und Invasion 8-15 studieren. Wir haben eine einfache Methode zum Arsch optimiertEsser die Auswirkungen von Mamma-Fibroblasten auf Milchdrüsenepithelzellen Verwendung eines kommerziell erhältlichen extrazellulären Matrix Modell dreidimensionalen Kulturen von gemischten Zellpopulationen (Co-Kulturen) 16-22 erstellen. Mit weiterem Co-Kultur wurden die Zellen bilden Sphäroide mit dem Fibroblasten-Clustering im Inneren und die Epithelzellen überwiegend auf der Außenseite der Sphäroide und Bilden mehrzelligen Vorsprünge in die Matrix. Die Manipulation der Fibroblasten, die zu veränderten Epithelzellen führt Invasivität kann leicht durch Änderungen in Zahlen und Länge der epithelialen Vorsprünge 23 quantifiziert werden. Darüber hinaus haben wir ein Verfahren zur Isolierung von Epithelzellen aus der dreidimensionalen Co-Kultur, die Analyse der Auswirkungen von Fibroblasten-Exposition auf epithelialen Verhalten ermöglicht entwickelt. Wir haben gefunden, dass die Wirkungen der Co-Kultur für Wochen noch nach Epithelzelle Isolation ermöglicht ausreichend Zeit, um mehrere Tests durchzuführen. Diese Verfahren ist an Zellenunterschiedlichen malignen Potential und benötigt keine spezielle Ausrüstung. Diese Technik ermöglicht eine schnelle Auswertung der In-vitro-Zell-Modelle unter mehreren Bedingungen, und die entsprechenden Ergebnisse können in in vivo Modellen tierischem Gewebe sowie menschlichen Gewebeproben verglichen werden.
Protocol
1. Einrichtung Dreidimensionale Co-Kulturen
- Am Tag vor Gründung der Co-Kulturen, entfernen Sie das Matrigel aus dem Gefrierschrank und tauen auf Eis in einem 4 ° C Kühlschrank über Nacht.
- Am Tag des Experiments, herzustellen Weg für die Co-Kultur, die mit dem Weg für den Epithelzellen zu verwenden (HMEC Medium in diesem Beispiel entspricht: DME/F12 Medium mit 10% bovinem Kälberserum, 5 mg / ml Insulin , 1 pg / ml Hydrocortison, und 1 ng / ml EGF). Halten Sie das Medium auf Eis mindestens 1 Stunde vor dem Mischen mit Matrigel.
- Um das aufgetaute Matrigel verdünnen, bestimmen die Gesamtzahl der gewünschten Menge an Matrigel: mittel (300 ul pro Well für 24-Well-Platten) und fügen Sie die Hälfte dieses Volumens an eiskaltem HMEC Medium in ein steriles Röhrchen auf Eis. Dann fügen Sie das gleiche halbe Gesamtvolumen von aufgetaute Matrigel an das Rohr, um eine 1:1-Verdünnung zu erreichen. Halten Sie das Röhrchen auf Eis.
- Platz 50 &mgr; l Matrigel: Medium-Gemisch Mitte auch nur in dafür vorgesehenen Vertiefungen einer 24-Well-Platte undInkubation für 10 min in einem 37 ° C Inkubator mit befeuchteten Luft und 5% CO 2.
- Fügen Sie eine weitere 450 ul Matrigel: Medium-Gemisch in die Vertiefungen pipettieren und für weitere 60 Minuten.
- Während der Inkubation Herstellung einer 1:1-Suspension von Fibroblasten (hier h-TERT-immortalisierten Reduktion Mammary Fibroblasten, die GFP) und Epithelzellen (hier h-TERT-immortalisierten humanen Mamma-Epithelzellen exprimiert, RFP) in einer Konzentration von 0,5 x 10 5 Zellen jeweils in 0,5 ml Medium HMEC.
- Nach der 60-minütigen Inkubation Schritt leicht fallen die Zellsuspension auf der Oberseite des erstarrten Gel, und zurück in den Inkubator Kultur.
- Bitte nicht stören, die Kulturen für 2 Tage. Danach kann jedes Medium geändert werden 2-3 Tage mit sehr sanft Ansaugen Medium von der Seite des gut und leicht ersetzt mit frischem Medium HMEC.
- Überwachen Sphäroid Bildung täglich unter dem Mikroskop. Kulturen sind in der Regel nach 10-14 Tagen reifen. Bild alsgegebenenfalls unter Verwendung von Licht-oder Fluoreszenz-Mikroskopie. Spheroid Größe und Auskraglänge kann unter dem Lichtmikroskop gemessen werden.
2. Isolierung von Zellen aus Spheroid Co-Kulturen
- Sehr sanft, pipettieren die Kultur auf und ab 10x mit einer sterilen 2-ml Glaspipette. Alternativ schneiden Sie die Spitze eines 1000 Mikroliter Kunststoff-Pipettenspitze mit einer Schere durch Autoklavieren oder Eintauchen in 70% Ethanol sterilisiert, um die Kultur pipettieren. Übertragen der Kultur mit entweder dem Glas der Pipette oder Pipettenspitze geschnittener Kunststoff in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt und für 5 min bei 2000 rpm bei Raumtemperatur. Die zellulären Sphäroide wird Sediment am Boden.
- Benutzen Sie einen sterilen Pasteurpipette Spitze zur schonenden Entfernung der gestörten Matrigel von der Spitze des zentrifugierten Röhrchen.
- 1 ml Medium zu den HMEC pelletiert Sphäroide, und Abpipettieren 2-3 Mal mit einer sterilen 2 ml Glaspipette und übertragen der Kultur auf eine Mulde einer 24-WellGewebekulturplatte.
- Lassen Sie die Sphäroide in die Schüssel für mindestens 48 Stunden vor Wert auf Wechsel des Mediums. Im Laufe der Zeit werden die Zellen verlassen die kugelige Strukturen und wachsen als Monolayer.
- Passage der Zellkulturen, wenn die Zellen 50% Konfluenz erreichen. Erste Erweiterung der Kultur auf eine 35 mm-Schale (ca. 2-4 Tage), und dann zu einem 100 mm-Schale (ca. 3-5 Tage). Unmittelbar vor jedem Durchgang Schritt, verwenden Sie einen sterilen Pasteurpipette manuell so viele Rest-"Ghost Sphäroiden" wie möglich zu entfernen.
- Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie für Reinheit Bevölkerung mit geeigneten Zelloberflächenmarker und weiteren separaten unterschiedlichen Zellpopulationen durch Fluoreszenz-Zell-Sortierung, wenn nötig. Die isolierten Zellen sind nun für weitere Analysen bereit, wie gewünscht.
3. Repräsentative Ergebnisse
Im dreidimensionalen Sphäroid Co-Kulturen, induzieren Fibroblasten mit technisch TIAM1 Silencing erhöht Invasion in mATrix durch Brustepithelzellen (Abbildung 1, vergleichen D, E, F bis A, B, C). Fibroblasten mit entwickelt Überexpression von TIAM1 induzieren verringerte Matrix Invasion durch die Brustkrebs-Zelllinie SUM159 (Abbildung 1, zu vergleichen, J, K, L bis G, H, I).
Sobald co-kultivierten Sphäroide eingerichtet worden sind, können Zellpopulationen aus Sphäroiden durch erneutes Plattieren in einer zweidimensionalen Rahmen isoliert werden, wie in 2 gezeigt. Je nach den relativen Wachstumsraten der Zellen getestet, kann reine Populationen durch serielle Passage entstehen (wie in Abbildung 3 dargestellt) oder können sortiert mit geeigneten Zell-Marker werden. Nach der Isolierung von 3D Co-Kultur behalten epithelialen Zellen die Eigenschaften von Co-Kultur mit Fibroblasten über längere Zeit übertragenen, so dass reichlich Gelegenheit zur Analyse. In diesem Beispiel induziert Exposition gegenüber TIAM1-defizienten Fibroblasten erhöhte Migration in co-kultivierten HMECs, die für Wochen es weiterhin eineach isoliert von 3D-Co-Kultur (Abbildung 4).
Abbildung 1. Imaging etablierter Sphäroid Co-Kulturen unter Licht-und Fluoreszenzmikroskopie. Spheroid Kulturen werden mit Brustepithelzellen und Fibroblasten-Zelllinien etabliert und man ließ sie in der Kultur für 10-14 Tage wachsen. AF: = HMEC-epithelialen Zellen mCherry. GL: Epithelzellen = SUM159 mCherry-Zellen. AC, GI: = Fibroblasten Kontrolle RMF-GFP-Zellen. DF: Fibroblasten = RMF-GFP mit TIAM1 Silencing. JL: Fibroblasten = RMF-GFP mit TIAM1 Überexpression. Die Pfeile zeigen Epithelzapfen Invasion in Matrix.
Abbildung 2. Serial-Bildgebung der Kulturen unter Licht-und Fluoreszenzmikroskopie nach Isolierung aus Matrigel Kultur. Tag 0 darstellt Bildgebung unmittelbar nach der Isolierung, den Tagen 1, 2 und5 zeigen Tage nach Isolation. Die Korona der Zellen aus dem Sphäroid mit der Zeit zunimmt. Schließlich ein "Geist" Sphäroid mit sehr wenigen Zellen bleibt (Pfeil). Nur sehr wenige Sphäroiden bleiben nach Entfernung Geist und erste Durchgang.
3. Durchflusszytometrie-Analyse von Zellen nach der Isolierung aus Matrigel Co-Kultur. Nach Sphäroids Co-Kulturen gereift sind, werden die Zellen aus dem 3D-Co-Kultur mit Pipettieren und serielle Passage isoliert. Beispiel Aliquote mittels Durchflusszytometrie analysiert (in diesem Beispiel mit grüner Fluoreszenz und rote Fluoreszenz zu identifizieren GFP-exprimierende Fibroblasten und mCherry-exprimierenden Epithelzellen jeweils), um den relativen Häufigkeiten der Epithel und Fibroblasten-Zellen zu bestimmen.
Abbildung 4. Transwell Migration von HMECs besteht, nachdem isolatiauf Matrigel von Co-Kultur. Sobald reine Populationen durch Kultur oder Fluoreszenz Zellsortierung gewonnen worden sein, können Zellen analysiert, wie gewünscht. Hier Migration von HMECs cokultiviert mit beiden Steuerkabel (C) oder TIAM1 schlecht (SHT) in Fibroblasten perforierten Transwells wurde nach 2, 4 und 8 Wochen nach der Isolierung aus Co-Kultur bewertet.
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Discussion
Die hier vorgestellte Methode stellt einen einfachen Ansatz zur Analyse der Auswirkungen von stromalen Fibroblasten auf Epithelzellen, einschließlich Tumorzellen. Es ermöglicht die direkte Zell-Zell-Wechselwirkung in einem dreidimensionalen Rahmen durch extrazelluläre Basalmembran-Matrix unterstützt und gleichzeitig einfachem Gewinnung der Zellen aus der Matrix für die weitere Analyse. Dies ist auf die Untersuchung von Tumor-assoziiertem Stroma angewendet werden, wie Fibroblasten-Linien manipulieren kann, um die Signalwege von Auswahl und Epithellinien in das invasive Potential variieren, wie in 1 gezeigt zu beeinflussen. Die 3D-Kokultur-Modell ermöglicht die visuelle Überprüfung, ob Veränderungen in der Zelle Invasivität induziert wurden. Die Isolierung Protokoll ermöglicht für die Extraktion von Zellen aus den 3D-Kulturen mit einem Minimum an Handhabung und vermeidet die Verwendung von Trypsin oder Matrix auflösende Mittel, die Zelleigenschaften beeinflussen könnte. Die Auswirkungen der Exposition gegenüber Fibroblasten im 3D-Co-Kultur in den Epithelzellen achtern andauerner isoliert von 3D-Co-Kultur, die Erleichterung anschließende Analyse (Abbildung 4). Während die hier gezeigten Beispiel zeigt Auswirkungen auf die Zellwanderung, kann jeder Assay für wachsende Zellen in 2D auf den isolierten Zellen verwendet werden. Wir haben dieses Verfahren verwendet, um die Wirkungen der Variation Fibroblasten TIAM1 Expression auf das Verhalten der zugehörigen Brustepithelzellen analysieren. TIAM1 Mangel in Fibroblasten fördert Mammatumorzelllinien Invasion und Metastasierung in 3D Kultur und Tiertumormodellen 23. Diese Methode ermöglicht es uns, potenzielle beteiligten Signalwege mit Hilfe molekularer, biochemischer und funktionelle Assays (Liu und Buchsbaum, in press) zu analysieren.
Es ist wichtig, dass nur Zelllinien bei guter Gesundheit zu verwenden und strengen sterilen Bedingungen zu halten, um eine Kontamination von Kulturen während des Prozesses zu verhindern. Die besten Ergebnisse erhalten werden unter Verwendung von Zellen vom frühen als späten Passagen (genaue Anzahl der Passagen hängt von den spezifischenIC-Zelllinie) und aus den Zellen bei Dichten zwischen 50-80% Konfluenz geerntet. Präzise Handhabung von Matrigel gemäß dem Protokoll ist der Schlüssel, um sowohl vollständige Verflüssigung vor Erleichterung Festlegung Co-Kulturen und Durcherstarrung der Matrix vor der Zugabe der Zellen zu gewährleisten. Unzureichende Menge oder Verfestigung der Matrix wird in Zellen, die als Monoschicht als in Sphäroiden in den Kulturen führen. Bei der ersten Gründung der Sphäroid Co-Kulturen, ermöglicht die Platzierung von einer anfänglichen 50 pl Stecker in die gut für die feste Verankerung und gleichmäßigere Erstarrung der letzten Matrix, die Schlüssel zu gleichmäßig verteilt Sphäroid Bildung ist. Die Beseitigung aller Gespenst Sphäroide bei post-Isolierung Durchgang Schritte ist kritisch, wenn automatisierte Zellsortierung ist, verwendet werden, um gemischte Populationen zu trennen. Die hier gezeigten Beispiele verwenden Phenolrot-frei Matrigel mit Protein-Zusammensetzung von ca. 10 mg / ml. Die Phenol-Rot frei Vorbereitung ermöglicht eine Farberkennung in Assays, wie Fluoreszenz.
Diese Technik kann auf einen Bereich von Zelltypen eingesetzt werden, um die Auswirkungen von Stromazellen Fibroblasten auf zugehörigen epithelialen Tumoren oder umgekehrt die Auswirkungen der Tumorzellen assoziierten Fibroblasten zu studieren. Diese Technik ermöglicht eine schnelle Auswertung der In-vitro-Zell-Modelle unter mehreren Bedingungen, und die entsprechenden Ergebnisse können dann zur in-vivo-Modelle tierischem Gewebe sowie menschlichen Gewebeproben verglichen werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
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