Summary
Det overordnede målet med denne videoen er å vise hvordan man utfører målrettet retinal injeksjon og
Abstract
Kylling embryonale netthinnen er et utmerket verktøy for å studere retinal utvikling i høyere virveldyr. På grunn av stor størrelse og ekstern utvikling, er det forholdsvis lett å manipulere dama embryonale netthinnen ved hjelp av rekombinant DNA / RNA-teknologi. Electroporation av DNA / RNA konstruksjoner inn i embryonale netthinnen har en stor fordel å studere genregulering i netthinnens stamceller / stamceller i løpet av retinal utvikling. Annen type analyser som reporter gen analysen, gen over-uttrykk, genet slå ned (shRNA) etc. kan utføres ved hjelp av electroporation teknikk. Denne videoen viser målrettet retinal injeksjon og i ovo electroporation til embryonale chick netthinnen ved Hamburger og Hamilton scenen 22-23, som handler om embryonale dag 4 (E4). Her viser vi en rask og praktisk i ovo electroporation teknikk der en plasmid DNA som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) som en markør er direkte levert innchick embryonale subretinal plass og etterfulgt av elektriske pulser til rette DNA opptak av netthinnens stamceller / stamceller. Den nye metoden for retinal injeksjon og electroporation ved E4 tillater visualisering av alle netthinnens celletyper, inkludert sen-fødte en nevroner, noe som har vært vanskelig med den konvensjonelle metoden injeksjon og electroporation på E1.5 to.
Protocol
Siden deler av protokollen er utført som tidligere beskrevet i andre Jove videoer 2 og papirer 3 med mindre endring vi ikke vil diskutere dem i detalj her.
1. Egg Håndtering og Needle Forberedelse
- Egg kan lagres i en vin kjøler på ca 13 ° C i opptil en uke. Dersom temperaturen er for høy, vil embryo begynner å utvikle unormalt, mens lavere temperatur fører til høy dødelighet. Når du er klar til å ruge ta ut egg fra vin kjøler og sette eggene vertikalt med den større enden opp. Hold eggene i romtemperatur i minst 2 timer før du setter dem i 37,5 ° C inkubator.
- Inkuber egg til 96-100 timer som er om embryonale dag 4 for å få embryoer som er på Hamburger og Hamilton scene 22 4-5.
- Forbered mikropipette nåler fra trekkes glass kapillærrør og bryte spissen under en dissekere microomfang med en pinsett for å få et tips åpning ca 0,1 mikrometer i diameter og en 20 mm konisk. Nåler med større tips har problemer Piercing vitelline membranen mens mindre tips har problemer med å laste og levere DNA løsningen.
- Fest nålen til en 0,1 ml Hamilton gasstett sprøyte montert på en micromanipulator. Bruk et lite stykke Masterplex silikon tube for å feste nålen til sprøyten. Siden tilkoblinger er tette ingen grunn til å legge mineralolje å forsegle dette vedlegget.
- Bland 2 mL av reporter plasmid DNA løsning med en konsentrasjon som spenner 3-6 mikrogram / mL og 0,2 mL av rask grønn (0,025%) på et stykke Parafilm. Fast grønt fargestoff vil bidra til å visualisere injeksjon. Sakte, laste nålen med blandingen.
- Å frigjøre vitelline membranen fra det indre membranen roter egget forsiktig om 180 ° og vente noen minutter så roter den tilbake til utgangsposisjonen og sett den for electroporation.
- Tørk forceps og egg skall med 70% etanol for å unngå smitte til fosteret.
- Lag et lite hull på egget rett over luften celle med et par av størrelse AA tang. Vær forsiktig så du ikke knekke av eggeskallet. Ta små biter én om gangen for å lage et lite vindu. Fjern forsiktig den indre membranen ved hjelp av tang uten å berøre vitelline membranen.
2. Injeksjon og electroporation
- For å hindre skade på hjernen eller hjertet, posisjonen nålen kontra sideveis til de viktigste bunt av blodårer inn i øyet og peker mot nebbet.
- Pierce gjennom vitelline membranen, sklera, netthinnen og glasslegemet ved en plutselig mild trykk på nålen. Hvis nålen skjærer gjennom den andre enden av øyet bør det være greit med mindre det skader noen alvorlig blod åre.
- Trekk tilbake nålen på kanten av åpningen og plassere den nesten tangerer den ytre veggen av øyeeplet.
- Innrykket av annonsent nålen inn i sub retinal rommet mellom sclera og netthinnen.
- Injiser DNA til du kan visualisere den grønne løsningen fylling siden av øyeeplet og skyve netthinnen innover ved å opprette en bule.
- Hvis nålen emisjon ikke er riktig så vil du se DNA løsningen å spre seg i glasslegemet fylle opp midt på øyet ballen. Likeledes, hvis du skade netthinnen for mye så vil du se DNA løsningen kommer ut av øyeeplet.
- Sakte fjerne nålen og umiddelbart plassere elektrodene i parallell inne i egget etter bløtlegging i PBS. Trykk ned elektrodene til å dukke inn i fostervannet på en måte slik at den injiserte øyet er plassert mellom elektrodene. Unngå å berøre noen stor blodåre eller hjertet med elektrodene mens plassere dem. Den negative elektroden bør være på injeksjonsstedet side slik at DNA kan transporteres fra sub retinal mellomrom i netthinnen mot positive elektroden. Electroporate netthinnen med 5 pulser av 15V for 50 ms med 950 ms intervaller.
- Fjern forsiktig elektrodene og forsegle vinduet på egg med biter av klar teip.
- Label og dato den injiserte egget før du setter den tilbake til inkubatoren. Vanligvis tar det ca 3 til 5 minutter å fullføre hele electroporation prosessen.
- GFP uttrykk kan sees så tidlig som 8 timer etter electroporation. Men du kan vente til fosteret har nådd ønsket stadium før høsting.
3. Representative Resultater
I vår studie, bruker vi ulike Plasmid konstruerer å studere regulering av genuttrykk som er involvert retinal celle utvikling. I denne videoen pCAG-GFP (transfeksjon kontroll) ble brukt til å følge en vellykket injeksjon og electroporation. Imidlertid kan noen plasmid konstruksjon med reporteren genet (GFP, RFP etc.) brukes. Selv om GFP uttrykk kan sees så tidlig som 8 timer etter electroporation, vi vanligvis starte slakting av egget på dag 6 (E6) og utover. Electroporated netthinne ble dissekert ut av embryoet og analysert under fluorescerende disseksjon mikroskop før innstøping og snitting. Vanligvis kan reporter genekspresjon sees minst en fjerdedel av netthinnen etter en vellykket electroporation (Fig. 1). De transfekterte retinal vev ble videre analysert gjennom seksjonering for tydelig visualisering av celle morfologi. Immunhistokjemi bruker celletype spesifikke markører (Brn3a, Pax6 etc.) tillates karakterisering av celle-spesifikk GFP uttrykk (Fig. 2).
Figur 1. Vellykket electroporation av reporter plasmid resultatene positive GFP uttrykk. Kylling embryonale netthinne ble injisert og electroporated på embryonale dag 4 og høstet på embryonale dag seks. Minst 25% av netthinnen ble vellykket tilført (A = ovenfra, B= Bunn visning). Scale Bar = 1mm.
Figur 2. Karakterisering av GFP uttrykke netthinnens celler ved hjelp av immunhistokjemi. GFP uttrykke netthinnens vev ved E7 scenen var fast og seksjoneres. Disse delene ble deretter farget med ulike celle spesifikke markører. Brn3a ble brukt til å bestemme ganglieceller (A) mens Pax6 ble brukt til å bestemme horisontal, amacrine og ganglieceller (B). Scale bar = 50 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målrettet retinal injeksjon og i ovo electroporation i embryonale netthinnen E4 stadiet kan spesifikt mot netthinnens stamceller resulterer i evnen til å visualisere alle seks store netthinnen celletyper på celle-nivå. I ovo electroporation på HH10 (~ E1.5) rettet mot Optikken vesikkel er i stand til å transfektere celler som utvikler seg til å danne øyet. Men disse cellene har en meget høy omsetning på denne tiden, og denne metoden er ikke spesifikk for netthinnens celler. Det kan være at den høye cellen omløpshastighet hindrer vedvarende stabil uttrykk. Ved E4, er embryoet utviklet nok til at de store strukturene i øyet er alle dannet, men ung nok til at flertallet av cellene i netthinnen er fortsatt netthinnens stamceller. Denne metoden kan også brukes til å få / tap av funksjon studier hvor et gen av interesse kan være målrettet for å studere normal utvikling og / eller sykdom i netthinnen.
Etter at vi publiserte denne teknikken i vårforrige papir 1, kontaktet flere forskere i dette feltet med oss for ytterligere assistanse på denne teknikken. Så vi bestemte oss for å produsere denne videoen for visualisering. I tillegg er fremskritt i teknikken vår beskrevet i denne videoen.
For å utføre denne teknikken med hell, følgende kritiske faktorer er verdt å beskrive.
Den mest kritiske faktoren er å plassere nålen nettopp i subretinal plass. For det første må man være nøye med å justere nålen kontra-lateral til de viktigste bunt av blodårer inn i øyet og peker mot nebbet. Denne posisjonen er nesten parallell til hjertet og reduserer sjansen for å skade hjernen og hjertet. Når piercing gjennom vitelline membran, sklera, netthinnen og glasslegemet, bør nålen ikke reise langt og pierce gjennom noe blod blodåre. Hvis nålen er skarp nok da dette kan gjøres veldig enkelt med få praksis. Neste steg er å sakte trekke tilbake the nål og plasser den på kanten av åpningen av netthinnen. Det er alltid en sjanse til å trekke den helt ut. Hvis det skulle skje, så kan man prøve igjen å sette nålespissen tilbake ved åpningen. Plassering nålen i subretinal rommet (mellom sclera og retina) krever øvelse og tålmodighet. I begynnelsen ser det veldig vanskelig, men med litt trening blir det lett. Mens injisere DNA løsningen inne i subretinal plass, er det svært viktig å observere bule formasjonen. Etterpå starter den grønne løsningen fylle omrisset av øyet, som indikerer en vellykket injeksjon. Dersom løsningen diffunderer vekk eller begynner å fylle inn i midten av øyet, indikerer at en feil injeksjon som ikke vil gi en vellykket electroporation.
Den andre faktoren er fabrikasjon av en optimal nål som er gjort via varme-trekking et glass kapillarrør og bryte spissen. Nåler med store tips har problemer piercing through den vitelline membran som øker sjansen for å skade netthinnen. Vanligvis skarpeste nål tips er best for dette formålet. Men nålen med svært små tips har problemer med å laste og levere DNA og ha økt sjanse til å bryte ned inne i øyeeplet. Av denne grunn gjør vi nåler med en spiss åpning på rundt 0,1 mikrometer i diameter og en 20 mm konisk en. Også, mens lasting DNA blandingen fra en dråpe på et stykke Parafilm, er det svært viktig å ikke laste den siste bit av væske som det øker sjansene for å få luft inni nålen.
Endelig plassering av elektrodene er svært kritisk for å oppnå vellykket electroporation. Elektrodene skal plasseres i parallell, slik at utviklingslandene øyet ligger mellom elektrodene. Ekstra forsiktighet bør tas fra berøre noen store blodårer eller hjerte med elektroder. Skade noen av disse kan føre døden til embryoet selv etter en vellykket sprøytepå. Videre de to øynene er annerledes orientert. Så har det å holdes i bakhodet for å endre elektroden orientering (positiv vs negativ) slik at den negative elektroden bør alltid være på injeksjonsstedet side å tillate DNA diffuse inn i netthinnens celler under elektrisk strøm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og fasiliteter komité ved Rutgers University.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Mr. Ma'as Enver for bruk av hans HD kamera (Cannon VIXIA HFS100). Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra NIH (EY018738), New Jersey Commission on Spinal Cord Forskning (08-3074-SCR-E-0 og 10-3091-SCR-E-0), og Busch Biomedical Research Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
