Summary
Основная цель этого видео, чтобы показать, как выполнять целевые сетчатки впрыска и
Abstract
Куриные эмбриональных сетчатки является отличным инструментом для изучения развития сетчатки у высших позвоночных. Из-за больших размеров и внешнего развития, это сравнительно легко манипулировать куриных эмбриональных сетчатки с использованием рекомбинантной ДНК / РНК технологии. Электропорации ДНК / РНК конструкций в эмбриональной сетчатки имеют большое преимущество для изучения регуляции генов в сетчатку стволовых / прогениторных клеток в процессе развития сетчатки. Различные типы тестов, такие как ген-репортер анализ, ген за выражение, ген сбить (ShRNA) и т.д. можно выполнить с помощью электропорации техники. Это видео демонстрирует целевой сетчатки инъекции и ово электропорации в эмбриональной сетчатки куриного на гамбургер и Гамильтон стадии 22-23, что составляет около 4-й день эмбрионального (Е4). Здесь мы показываем, быстрый и удобный в ово техника электропорации которой ДНК плазмиды, что выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) в качестве маркера доставляется вкуриных эмбриональных субретинальной пространство и затем электрические импульсы, чтобы облегчить поглощение ДНК сетчатки стволовых / прогениторных клеток. Новый метод сетчатки инъекции и электропорации на E4 обеспечивает визуализацию всех типов клеток сетчатки, в том числе позднего происхождения нейроны 1, который было трудно с обычным методом инъекции и электропорации на E1.5 2.
Protocol
Так как некоторые части протокола осуществляется, как описано ранее в других Юпитер видео 2 и статьи 3, с незначительными изменениями мы не будем обсуждать те подробно.
1. Обработка яиц и иглы подготовка
- Яйца можно хранить в винный холодильник примерно на 13 ° C в течение 1 недели. Если температура слишком высокая, эмбрионы начинают развиваться неправильно, в то время как более низкая температура приводит к высокой смертности. Когда вы будете готовы для инкубации брать яйца из холодильника вино и установить яйцо вертикально с большим концом вверх. Храните яйца при комнатной температуре в течение 2 часов, прежде чем положить их в 37,5 ° C инкубатора.
- Инкубировать яйца 96-100 часов, что составляет около 4-й день эмбрионального для получения эмбрионов, которые находятся на гамбургер и Гамильтон стадия 22 4-5.
- Подготовить микропипетки иглы вытащил стеклянные капилляры и сломать наконечник под вскрытия микрообласти с пинцетом, чтобы получить подсказку открытие около 0,1 мкм в диаметре и 20 мм, конус. Иглы с большим советов испытывают трудности пирсинг желточной оболочки в то время как меньшие советов испытывают трудности погрузки и доставки ДНК решение.
- Установите иглу 0,1 мл Гамильтон Газонепроницаемый шприц устанавливается на микроманипулятора. Используйте небольшой кусочек трубки силиконовые Masterplex для крепления иглы шприца. Поскольку надежность соединений нет необходимости добавлять минеральные масла, чтобы запечатать эту привязанность.
- Смешайте 2 мкл репортер плазмиды решение ДНК с концентрацией в пределах 3-6 мкг / мкл и 0,2 мкл быстро зеленого (0,025%) на листе парафильмом. Быстрый зеленый краситель поможет визуализировать инъекций. Медленно, загрузить иглу со смесью.
- Чтобы освободить желточной мембраны из внутренней оболочки вращения яйца нежно около 180 ° и подождать несколько минут, затем повернуть его обратно в исходное положение и установить его для электропорации.
- Протрите НЦВОEPS и яичной скорлупы с 70% этанолом, чтобы избежать инфекции в зародыше.
- Сделайте небольшое отверстие в яйце непосредственно над воздушной камеры с парой щипцов размера AA. Будьте осторожны, чтобы не взломать яичной скорлупы. Удалить мелкие кусочки по одному сделать небольшое окно. Осторожно снимите внутреннюю мембрану помощью пинцета, не касаясь желточной оболочки.
2. Инъекции и Электропорация
- Чтобы предотвратить повреждение головного мозга или сердца, положение иглы против сбоку от основной пучок кровеносных сосудов, попадающие в глаз и указывая на клюв.
- Пирс через желточной оболочки, склеры, сетчатки и стекловидного тела внезапным мягким нажатием иглы. Если игла проникает через другой конец глаз должно быть хорошо, если она разрушает любой крупной вены кровь.
- Медленно потяните иглу в край отверстия и поместите его почти касательной к внешней стенке глазного яблока.
- Inserт иглу под сетчатку пространство между склер и сетчатки.
- Вводите ДНК пока вы не можете себе зеленый раствор заполнения сторону глазного яблока и нажав сетчатки внутрь, создавая выпуклость.
- Если ваша игла размещение не правильно, то вы увидите ДНК решение распространяется внутри стекловидного тела заполнения середине глазного яблока. Кроме того, если вы повредите сетчатку слишком много, то вы увидите, раствор ДНК выходит из глазного яблока.
- Медленно снимите иглу и сразу же разместить электроды параллельно внутри яйца после вымачивания в PBS. Опустите электроды погружаются в амниотической жидкости таким образом, чтобы вводить глаз находится между электродами. Старайтесь не касаться любого крупного кровеносного сосуда или сердца с электродами при размещении их. Отрицательного электрода должна быть в месте инъекции стороне, так что ДНК может быть перевезен из под сетчатку пространства на сетчатку к положительному электроду. Электропоративных сетчатки с 5 импульсов 15В в течение 50 мс с интервалом 950 мс.
- Осторожно снимите электроды и запечатать окна яйца с кусочками скотча ясно.
- Этикетка и дату вводят яйца, прежде чем положить его обратно в инкубатор. Как правило, это занимает от 3 до 5 минут, чтобы завершить весь процесс электропорации.
- GFP выражения можно рассматривать как еще в 8 часов после электропорации. Однако, вы можете подождать, пока эмбрион не достигнет желаемого этапа до сбора урожая.
3. Представитель Результаты
В нашем исследовании мы используем различные плазмиды конструкций для изучения регуляции экспрессии генов, которые участвуют развития сетчатки клетки. В этом видео pCAG-GFP (трансфекции контроля) была использована следовать успешной инъекции и электропорации. Однако, любая конструкция плазмиды с геном репортер (GFP, ППП и т.д.) могут быть использованы. Хотя GFP выражения можно рассматривать как еще в 8 часов после того, как элементыctroporation, мы как правило, начинают сбор яйца на 6 день (E6) и далее. Электропорации сетчатки иссекали эмбриона и проанализированы под флуоресцентным микроскопом рассечение перед вложением и секционирования. Как правило, выражение гена-репортера можно увидеть по крайней мере в 1/4 сетчатки после успешного электропорации (рис. 1). Трансфицированных сетчатки тканей дальнейшем проанализированы с помощью секционирования для четкой визуализации клеточной морфологии. Иммуногистохимическое использование типа клеток специфических маркеров (Brn3a, Pax6 и т.д.) позволили характеристики клеточных конкретных GFP выражении (рис. 2).
Рисунок 1. Успешное электропорации репортер плазмиды результаты положительные выражения GFP. Куриный эмбриональных сетчатки вводили и электропорации на 4-й день эмбрионального и собирают в эмбриональном 6 день. По крайней мере 25% от сетчатки была успешной трансфекции (= вид сверху, B= Вид снизу). Масштаб Bar = 1 мм.
Рисунок 2. Характеристика GFP выражение клеток сетчатки использованием иммуногистохимии. GFP выражения сетчатки тканей в E7 этапе были фиксированными и секционные. Эти разделы были затем окрашивали различных клеточных маркеров. Brn3a был использован для определения ганглиозных клеток (А), в то время как Pax6 был использован для определения горизонтальных, амакринные и ганглиозные клетки (B). Шкала бар = 50 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целевые сетчатки инъекции и электропорации ово в эмбриональные сетчатки на стадии E4 может конкретно сетчатки клеток-предшественников в результате чего способность визуализировать все шесть основных типов клеток сетчатки на одном уровне клетки. В ово электропорации в HH10 (~ E1.5), ориентированная на глазной пузырь способен трансфекции клеток, которые развиваются, чтобы сформировать глаз. Однако, эти клетки имеют очень высокий оборот в это время, и этот метод не является специфичным для клеток сетчатки. Вполне возможно, что высокая скорость обновления клеток предотвращает устойчивый стабильный выражения. По E4, эмбрион развивается достаточно того, что основные структуры глаза все образуется, но достаточно молод, что большинство клеток в сетчатке еще сетчатки стволовыми клетками. Этот метод может быть применен для получения / потери функциональных исследований, где гена могут быть направлены на изучение нормального развития и / или заболеваний сетчатки.
После того, как мы опубликовали эту технику в нашпредыдущей статье 1, несколько ученых в этой области обратились к нам за помощью по этой технике. Поэтому мы решили выпускать это видео для визуализации. Кроме того, прогресс в нашей методики, описанные в этом видео.
Для выполнения этой техники успешно, после критических факторов стоит описывать.
Наиболее важным фактором является размещение иглы именно в субретинальной пространства. Во-первых, нужно быть осторожным, чтобы выровнять иглу противопоказаний сбоку от основной пучок кровеносных сосудов, попадающие в глаз и указывая на клюв. Эта позиция почти параллельно сердца и уменьшает вероятность повреждения головного мозга и сердца. При проникновении через желточной оболочки, склеры, сетчатки и стекловидного тела, игла не должна ехать далеко и проникнуть сквозь любую венозной крови. Если игла достаточно острым, то это можно сделать очень легко с нескольких методов. Следующим шагом будет медленно отходили йиглы электронной и поместите его на краю открытия сетчатки. Существует всегда есть шанс, чтобы вытащить его полностью. Если это случится, то можно попробовать еще раз, чтобы положить конец иглы назад на открытии. Размещение иглы в субретинальной пространстве (между склер и сетчатки) требует практики и терпения. В начале, это выглядит очень сложно, но с некоторой практикой это становится легким. В то время как инъекции раствора ДНК в субретинальной пространстве, очень важно соблюдать выпуклость образования. После этого зеленый раствор начинается заполнение контура глаз, что указывает на успешное инъекций. Если раствор диффундирует или начинается заполнение в центре глаза, что указывает на неправильное введение которых не приведет к успешному электропорации.
Вторым фактором является изготовление оптимальной иглу, которая осуществляется через тепло-потянув стекла трубки и нарушение чаевые. Иглы с большим советов испытывают трудности пирсинг Четух желточной оболочки, что увеличивает вероятность повреждения сетчатки. Обычно острые иглы советы лучше всего подходят для этой цели. Тем не менее, игла с очень малым советов испытывают трудности погрузки и доставки ДНК и имеют повышенный шанс сломать внутри глазного яблока. По этой причине мы делаем иглы с наконечником открытие около 0,1 мкм в диаметре и 20 мм Конус 1. Кроме того, при загрузке ДНК смесь из капель на кусочке парафильмом, очень важно, чтобы не загружать последнюю каплю жидкости, поскольку это увеличивает шансы на получение воздуха внутри иглы.
Наконец, размещение электродов имеет очень важное значение для достижения успешного электропорации. Электроды должны располагаться параллельно с тем чтобы развивающиеся глаз находится между электродами. Дополнительное предостережение должно быть взято от прикосновения любым крупных кровеносных сосудов и сердца с электродами. Повреждение любого из них может привести к смерти эмбриона даже после успешного injectiо. Кроме того, два глаза по-разному ориентированы. Таким образом, он должен иметь в виду, чтобы изменить ориентацию электрод (положительный по сравнению с отрицательным), так что отрицательный электрод должен быть всегда на стороне инъекции, чтобы ДНК диффундируют в клетки сетчатки под действием электрического тока.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все эксперименты на животных были утверждены Уходу за животными и услуги комитета на Rutgers University.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить г-на Маац Энвер для использования его камера HD (Cannon VIXIA HFS100). Эта работа была частично поддержана грантами NIH (EY018738), Нью-Джерси комиссии по исследованию спинного мозга (08-3074-SCR-E-0 и 10-3091-SCR-E-0), а Буш биомедицинских исследований Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
