げっ歯類の内側嗅内皮質の背腹軸機構の調査のための矢状スライスの作成

Summary

我々は内側嗅内皮質（MEC）の背腹軸を維持する脳スライスからの調製および電気生理学的記録のための手順について説明します。場所の神経エンコーディングはMEC内の背腹軸の組織を次のようなので、これらの手順は、ナビゲーションやメモリのための重要な細胞メカニズムの調査を容易にします。

Abstract

脳内の計算は、シナプス入力に適切に応答ニューロンに依存しています。ニューロンは、それらの補数、彼らはシナプス入力に応答する方法を決定する膜のイオンチャネルの分布が異なります。しかし、動物の動作でこれらの細胞の特性と神経機能の関係はよく理解されていません。この問題に対する一つのアプローチは、それらがコード情報、または計算上の個々のニューロンのマップの位置は、彼らが^1を実施している地形的に編成神経回路を検討することである。このアプローチを用いた実験は、感覚や認知回路^2,3内の情報の符号化の基礎となるシナプス応答のチューニングのための原則を示唆している。

内側嗅内皮質（MEC）の背腹軸に沿って空間的な表現の地形組織は、細胞のメカニズムと計算の間の関係を確立する機会を提供していますI空間認知のためにmportant。げっ歯類のMECのレイヤーIIのニューロンは、格子状のフィールド^4-6焼成を使用して場所をエンコードします。次第に腹の位置でニューロンは、この距離より大きい1メートルに増加し、一方MECの背側の位置で見つかった神経細胞のグリッドを形成する個々の焼成のフィールドの間の距離は、30cmのオーダーである。いくつかの研究は、これらの細胞の特性は、空間計算^2,7-10に重要であることが示唆され、グリッド発射フィールド間の間隔と同様、彼らの背腹の位置に応じて異なることMECのレイヤーIIのニューロンの細胞の性質を明らかにした。

ここでは、MECニューロンの生物物理学と解剖学的特性の地形組織のMEC可能にする調査の背腹軸の範囲を維持する脳スライスからの調製および電気生理学的記録のための手順について説明します。識別さnの背腹軸の位置それは、スライスの正確な背腹の位置の基準点を確立することは困難であるとして、解剖学的ランドマークの相対euronsは、MEC ^7,8,11,12の水平スライスを使用するプロトコルを正確に確立することは困難である。我々は記述の手順では、MECと同様に、分子勾配^2,10の可視化の背腹軸に沿って記録された細胞の位置を正確かつ一貫性のある測定を可能にします。手順は、成体マウスで使用するために開発されている（> 28日間）に成功し、最大1.5歳までのマウスで採用されている。調整に彼らは若いマウスまたは他の齧歯類の種と一緒に使用することができます。調製と測定の標準化されたシステムは、この領域の細胞とマイクロ回路の特性の体系的な調査を支援します。

Protocol

1。矢状スライス標本

1.1大脳半球を解剖

すべての動物実験では、地元の倫理審査と国の規制に従ってください。ここで説明する実験の場合には、仕事はイギリス動物（科学的手続き）法1986に準拠しています。我々は日常的に脳を取り外す前に、マウスを安楽死させるために麻酔なしで頸椎脱臼を使用しています。あるいは、マウスが末期麻酔することができますが、このケースでは、麻酔薬の選択はニューロンのプロパティに影響を与えるかどうかを判断する必要があるかもしれません。

マウスから脳を取り出して、すぐに寒さの中の場所（4-8℃）carbogenと彩度（95％O _{2、5％CO 2）}にバブリング人工脳脊髄液（ACSF）を（溶液の組成は表1を参照）を切断。

3分の最大値の後に、慎重にcから脳を削除するutting ACSFは、スパチュラを用いてゆっくりとカットACSF（ 図1A）で湿らされたろ紙の上に直立位置（上向きに直面している背側）に配置します。

半球の取付け正確容易にするために、MECを（大脳の尾極端にある）に影響を与えることなく、できるだけ多くの小脳のを削除して、冠状面で切片による大脳の吻側三分の一を削除するには、カミソリやメスを使用（ 図1B）。

セクションでは、正中線の垂直面（ 図1C）に沿って正確であることに注意しながら、脳を二等分する。

1分半のためにバブリング切断ACSFに半球を返します。

1.2ビブラトーム上半球をマウントします。

マウントする前に、ビブラトームブレードの刃先が水平から20度の角度であることを確認します（

物理的な影響を最小限に抑えるために世話をすると、その内側表面はヘラにかかっていると、その背範囲はミクロトームブレードに向くようにへらと位置でカットACSFから各半球を削除します。穏やかに各半球の内側表面はミクロトームベースプレートに平行であることを確認するために世話をして、瞬間接着剤のストリップに各半球をスライドさせます。我々は最良の結果を得るために各半球の背側表面と平行になるとビブラトームブレード（ 図1D）に直面している必要があることを発見した。

スライス時の準備の1.3メンテナンス

すぐに取り付けコールドカットACSF（ - 8°C 4）で水没半球を次に示します。 temperaturを維持するスライシング手続きを通じてeとcarbogen飽和。カッティングチャンバ内の溶液を直接冷却およびバブリングは実用的でない場合は、定期的に新鮮な冷却とバブリング溶液をチャンバー内に切削ACSF溶液を補充する。

1.4カットセクション

あなたはMECの横方向のほとんどの範囲（通常は〜1mmの下側面から）（ 図1F）を識別するまでビブラトームを使用して、矢状面における両半球から皮質を削除します。

カット間を振り返ってブレードをドラッグし、曝露された組織の損傷を防ぐために〜200μm程度までのビブラトームブレードを持ち上げます。 MECの内側の範囲に達するまで、同時に両半球（ 図1Dに示すように、それらが並んでいる場合、それらの両方を同時にカットされます）から400μmの矢セクションを切った。これは、tの腹尾曲線の周りに太い白帯の有無によって識別することができます彼は、海馬（外部カプセル）、その吻側境界の非凸形状と角背尾'コーナー'。 図1Eは、MECに横方向の矢面における海馬の円形の外観を示しています。 数値は、1F-Gを示してどのようにMEC内のセクションでは、スライスの異なる横内側の位置に表示されます。より内側の位置での海馬の徐々に多くの豆形の外観に注意してください。各半球は通常、MECを含む二、三400μmの厚さのスライスを得られます。

1.5インキュベートスライス

各カットの直後に35℃の水浴中に保持さcarbogen飽和標準ACSFのスライスを配置するスライスはスライス後のACSFで約15分間35℃でインキュベートすることができますは完了です。

水浴からスライスホルダーを取り外し、Lの室温でcarbogenでバブリングを続ける東に45分。

2。例矢スライス実験

この調製物を使用する典型的な実験では、MECの層IIの星状細胞からの電気生理学的記録を作成することです。

2.1最適化光学系

録音を開始する前に、コンデンサー、スライス平面上のフォーカス（ケーラー照明）であると高倍率（40倍など）を目的の下に中央に配置されていることを確認します。

興味の2.2識別細胞

MEC（ 図2A-B）内のおおよその記録領域を識別するために、低倍率（4倍など）目的を使用しています。この領域内の生細胞（ 図2C-D）を識別するために高倍率対物レンズに切り替えます。

例として、推定される層II星状細胞は、視覚的にそれらの多角形または卵形の形状と類似したdiameを持つ複数の主要な樹状突起によって識別されます。TER、単一の大径の先端樹状突起^2,13,14の不在。彼らは確実に彼らは豊富であり、しばしば小グループ^2,9（ 図2C-D）に表示されるレイヤーI / IIの境界のエッジ上で識別されます。このような介在と錐体細胞など他の細胞型はまた、識別可能でなければなりません。

この時点で実験が記録されたニューロンへのシナプス入力を有効にするには膜電位または識別されたニューロンからの膜電流、電気的またはoptogeneticメソッドを記録する全細胞パッチクランプの使用例については、実施することができる。ニューロンIDが記録されたニューロンの電気生理学的特性から、細胞内ソリューション内の蛍光標識を含んでいることによって確認することができます。

3。背腹軸に沿った位置を測定する

3.1画像の興味のある場所や周囲のスライス

recorの位置を決定する背腹軸に沿ってDEDニューロンは、最初の画像にスライスとその周辺地域のMECの領域を低倍率対物レンズを使用しています。画像内の記録電極（ 図3A）を含む、例えば、または重複した画像の興味の場所の周りに明るい輪を残すためにフィールド虹彩絞りをステップダウンにより、興味のある場所にマークを付けます。画像内の記録位置を特定するために複製が、録音場所とその周辺（ 図3B）の初期画像に重畳することができます。最大3つの独立した低倍率（4倍）の画像には、腹側の記録位置からMECの背側縁の領域をカバーするために必要となる場合があります。これらの画像は、距離の測定は、（ 図3）から取得することができる画像を提供するための画像処理ソフトウェアを使用して一緒にステッチすることができます。ニューロンの識別と場所の更なる検証を含めることにより、記録後に行うことができこのような細胞内ソリューション内のその後の記録²次の組織の適切な処理を使用してビオシチンまたはAlexa染料として不活性のマーカー。

3.2はMECの背側の境界線を確立する

MECの背側縁は背腹軸の位置を測定するのに便利なランドマークを提供しています。 MECの腹側の境界線も同様に定義されていません。

図4は、別の内側·外側の位置でニッスル染色したスライスで定義されたMEC携帯ランドマークDIC照明の下に表示される方法を示しています。

図4は、円形の海馬（ 図4（I））と層I（ 図4（IV））横方向の嗅内皮質（LEC）を含む矢状スライスに関連付けられているにparasubicular突起の欠如を示しています。

図4 BCは、MEを含む典型的なスライスを表示するC.は、DIC照らされたスライスの著名な暗い背Parasubicular /内嗅野境界領域の背側の部分はparasubiculumの領域が含まれています。 parasubiculum領域がはっきりと列の対応する画像のニッスル染色（III）によって明らかにされています。 MEC（4B及び4C列（IV）の黒矢印）の背側縁は、レイヤI（4B及び4C列（IV）の赤い矢印）にはるかに突き出しparasubicularセルのグループに腹です。

ニッスルセクションでMECの背側境界はDICスライスの暗いParasubicular /内嗅野境界領域の背側縁に腹な場所に対応している図の4B及び4C列の比較（ii）および（iii）に示す（黒矢印）。境界線の位置は、DIC画像と参照画像と比較して（また、refを参照してください。14）から推定することができます。分子マーカーと背MEC国境の将来の検証では、この見積もりの​​精度が向上します。我々は、股関節に注意してくださいtは、参照セクションを染色し、標識されたニューロンの形態学的識別のために処理されたセクションでは、かなりの収縮を受ける可能性があります。 DICおよびリファレンスセクションではランドマークの相対的な絶対的な距離の比較は、したがって、最初の測定及び収縮の補正（例えば、文献2を参照してください）​​が必要です。

3.3距離のキャリブレーションと測定

距離変換比：画像の距離の簡単な測定を容易にするために、イメージにピクセルを確立するためのリファレンスグリッドを同じ低倍率対物レンズを使用しています。グラフィックスプログラムを使用して、MECの輪郭に沿って興味のある場所にMECの背側境界からピクセルの距離を測定し、程度の距離（ 図5A）にピクセル距離に変換します。ニューロンはそのようなビオシチンなどのマーカーで満たされている場合は、記録されたニューロンの位置は、その後も（例えば、文献2を参照）、適切な処理によって回収することができます。

4。のrepresentative結果

図5Aは、記録されたニューロンと重ね合わせた測定ガイドの場所で、記録後の矢状スライスの例、低倍率（4倍）合成画像を示しています。マークされた背と腹星状細胞からの記録は、 図5Bに示されています。これらの録音は、細胞のアイデンティティーを確立し、MEC層II星細胞の電気的特性は、背側と腹側の場所で異なる方法を説明するのに役立ちます。

図1。矢状スライスの準備。ろ紙上に上向きに直面している背側で休んで全脳がACSFをカットで湿らせた。Bを 。C Hemisected脳の小脳と吻側のサードを除去した後trong>脳マウントするための準備ができました。Dは前のACSFとスライスを切るの浸水にビブラトームブレードの刃先に平行に接着剤ストリップ上半球をマウントした。中にLECを含むセクションのE外観組織のさらなる400μmの（表面に示されている内側400μmである除去した後、MECの"外側"の部分の横方向の組織を除去した後の手順をスライスし、標準的な矢MECスライスのまだ十分に内側はありません。F外観（F））MECの"内側"の部分のGの外観は、400μmの矢状スライスがカットされた後、それぞれの解剖学的ランドマークは、cを示すEFのHI回路図 ：小脳、L：横方向の嗅内皮質（LEC）は、m：内側は、嗅内皮質（MEC）、H：海馬、オレンジ色：外部カプセル、青：脳梁、シアン：海馬歯状回、GREEN：CA3＆CA1。吻側のみMEC含まれているスライスには、境界が線形であることができるのに対し、LECが凹面である（Hの黒い矢印）を含むスライスの海馬の境界（Iの赤い矢印）または凹面（Jの赤い矢印）の外観。着色された解剖学的ランドマークのおおよその形状は、アレン脳アトラス（の注釈から得られたhttp://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html ）。

図2。 DIC照明の下でMEC層II細胞を同定する。パラの例合成画像低倍率（4倍）で、矢の脳スライス。別の画像が邪魔エッジとケラレを削除するには、整列とブレンドされています。重要なランドマークエリアH：海馬、M：。高倍率での右端の近くに暗い縦ストライプのように見える、MEC MEC C層IIの層IIを（含まれている個々の低倍率（4倍）の画像からMEC B作物 DIC照明との組み合わせで最大40倍）。イメージは、複数の画像の位置合わせとブレンド複合体である。細胞の密な中央の'カラム'層IIの健全な推定星状細胞と介在のグループを示すレイヤII。Dシングル高倍率DICイメージです。ここに示すように、星状細胞は、多くの層の第I / IIの境界上のグループで発生します。錐体細胞は、近いレイヤーII / IIIの境界に発見される傾向があります。 ACの点線のアウトラインは、それぞれ、BDの程度を示す。スケールバー：AとBは500μmで、CとDは100μmインチ

図3 "SRC =" / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg "/>
図3。興味のある場所の背腹軸の位置を測定します。アライン低倍率（4倍）興味のある場所（記録電極の先端でマーク）と暗い内嗅野/ Parasubicular境界領域のランドマーク（背側の境界線を確立するために使用される間にMECの全体の背腹のエクステントを含む画像MECの- Bは同様に）図4を参照して、フィールド虹彩絞り（減少不透明でオーバーレイ）の代わりに、興味のある場所をマークする記録電極を停止して重ね合わせた画像を含む。

図4。矢のスライスDIC画像からMECの背側縁を推定する。嗅内皮質からAC矢のセクションでは、（内側の横）。 DICおよびニッスルのセクションでは、さまざまなマイクからです。電子AC列（I）：全体矢スライス（400μm厚）（整列と低倍率（4倍）、画像のブレンド複合材料） のAC列（ⅱ）：で特徴ダークParasubicular /内嗅野境界領域と嗅内皮質のクローズアップ各画像の上部領域。AC（II）のイメージに合わせ異なったマウスからAC列（iii）のニッスル染色したスライス（40μmの厚さ）。細胞の暗い、緻密層は、層IIです。比較列（ii）および（iii）ニッスル染色した細胞はDICの画像に表示される方法を示しています。AC列（IV）：ニッスル染色したスライスの詳細。 BとC列（IV）はparasubiculum（DIC画像の暗いParasubicular /内嗅野境界領域の背側部分）と背MECから細胞由来の細胞が含まれています。 B（IV）とC（IV）層の奥深くまで拡張parasubicular細胞の大きな背のパッチで私は（赤い矢印）を簡単に表示されます。これらのパッチの腹側縁は背BOに対応MECのrder（黒い矢印）。 （iv）にparasubicularパッチは、スライスは、標準の矢MECスライスの準備のために余りに側面であることを示す、存在しない。すべてのパネルでは、黒い矢印はMECの背側の境界線を示しています。灰色の矢印は、MECのおおよその腹側の境界線を示しています。

図5。代表的な結果をブレンドし、 図3の画像のトリミング部分は背側細胞と腹側の細胞の位置は、それぞれ青と緑の黒丸で示されています。黒い矢印は、MECの推定背側縁をマークし、白い点線で深い層に拡張されています。白い実線はMECの背側縁から腹側にあるセルまでの距離のピクセル測定が行われたに沿って輪郭のパスを示すガイドです。スケールバー：500μmのBエレクトロ。細胞からの生理的なトレースは左から右にAで示された - 入力抵抗を計算するために使用されている現在のステップへのスレッショルドの応答を、大きな正の電流ステップ、スパイクの詳細への応答をスパイク。

Discussion

我々はここで詳細にMECの背腹軸の範囲を維持する矢状スライス標本を製造するための手順を記載している背腹組織に従うMEC回路特性の調査を容易にする。

重要なステップ

動物から脳を削除します 。脳に作用する圧力を避けるために、特に注意してください。これは、脳の急速な除去よりも重要である。

スライス。スライスがしっかりと保持室の床に接着する必要があります。ビブラトームは、z軸の振動<2μmのを持つ必要があり、高振幅、低速度の設定に使用する必要があります。最適な設定はモデル間で異なることがあり、試行錯誤によって確立されている必要があります。

溶液の温度を監視します 。我々は、スライスの質が切断中と後の温度に敏感であることがわかります。 Outsid eが推奨温度は、健康な神経細胞の数が削減され、ニューロンはシナプス入力にパッチと応答がより困難になる可能性が減少することができます範囲である。

フィールド虹彩絞りのイメージング。ケーラー照明とセンタリングは、録音前の細胞の可視化のために重要である。

トラブルシューティング

スライスは、少数の健康な細胞が含まれています。ソリューションを交換してください。ビブラトーム上のz軸の変位を確認してください。溶液の温度を確認してください。切断スライスの向きを確認してください。

スライス内のニューロンは、参照することが困難である。ケーラー照明が正しく設定されていることを確認。顕微鏡レンズが汚れていない確認してください。

gigasealsを形成する難しさ。記録電極の形状を確認してください。細胞死は、例えば円形細胞の形状や、コントラストの高い細胞の兆候スライスを調べます。

スライスの ve_content "> 画像を整列することが困難である。スライスが最大の詳細をキャプチャするためにフォーカスされていることを確認します。自動画像調整> 40％の画像の重なりのために通常は十分です。

制限事項

矢状スライス標本の1つの潜在的な制限は、MEC内の非常に長い距離シナプスの接続が保持されない場合がありますので、矢状面^9、15に直接並列実行し、ないかもしれないということです。これらの接続を維持することはどちら吻側 - 尾側平面の角度でビブラトーム上での脳半球をhemisectingまたはマウントすることで、カットスライスの角度を変更するには、準備手順を変更する必要があります。同様の考慮事項は、内側中隔からの例の求心性入力の場合、他の接続の保全を申請することができます。

水平MECスライス標本との比較

1. 背腹軸の位置の正確な測定が重要である背腹軸および生理学的特性に関する沿った位置との間の量的関係を確立するため。水平方向のスライス標本^7,8,11,12では、カットの正確な背腹軸の位置を決定することは困難であり、これは一貫した基準位置を確立する複雑になります。対照的に、矢状スライス標本でMECの背側の境界線が基準点とスライスのニューロンの深さの知識は、その背腹軸の位置を測定する必要はありませとして確立するのは簡単です。矢スライスしたがって、非常に背腹軸の位置と、携帯電話や回路の特性との間の量的関係をより迅速かつ正確な調査を可能にする、背腹軸の位置の正確な測定を容易にします。
2. 分子勾配はMECの地形回路組織のために重要であり、蛍光または他の標識技術を用いて可視化することができます。水平スライスと比較して、その目で電子信号が別の背腹軸の位置でスライス間で比較されなければならない、矢準備が背腹軸の分子勾配を簡単に、よりきめの細かい、より信頼性の高い可視化および定量化が可能になります。
3. 。シナプスの接続に背腹軸勾配はMEC機能に重要な役割を果たす可能性があります。矢状スライス標本では、接続内および異なる場所の間にMECの背腹軸に沿って、さまざまな背腹で均等に回路の整合性を維持するためにどのように異なるか調査するために重要であるMEC内背側と腹側の領域の間のシナプス結合を保持することができます場所。接続が背腹軸に沿って実質的に変化する場合、水平方向のスライスは同じようにそれぞれの極端な全体の機能的なマイクロを含む可能性が低くなります。

将来の開発とアプリケーション

分子決定因子の知識MECの細胞のアイデンティティのニューロンのアイデンティティの決定的な特性を有効にして、背腹軸の位置のより正確な決定を許可します。

矢状スライス標本を用いて、複数のニューロンの細胞型および位置特異的活性の地形主催応答は1つのスライス内（電圧感受性色素やカルシウムイメージングを用いた例）を同時に観察することができた。

optogeneticツールとの組み合わせで、矢状製剤は、背腹軸に沿った異なる位置で選択的活性化を可能にします。別の背腹軸の位置で超小型回路が空間的に標的と活性化にどのように応答するかを尋ねると、MECマイクロ回路の機能に重要な洞察を提供することができます。

我々は、この準備は生理学的特性に背腹軸勾配を調査するための、シンプル、堅牢で標準化された基盤を提供し、促進することを期待してこれらの勾配がMECの情報処理特性に寄与する方法を理解する。