Preparación de las rebanadas parasagitales para la Investigación de dorsal-ventral Organización de los roedores de corteza entorrinal medial

Summary

Se describen los procedimientos para la preparación y registro electrofisiológico de rodajas de cerebro que mantienen el eje dorsal-ventral medial de la corteza entorrinal (MEC). Debido a que la codificación neural de la localización sigue una organización dorsal-ventral en el MEC, estos procedimientos de facilitar la investigación de los mecanismos celulares importantes para la navegación y la memoria.

Abstract

Ciencia de la Computación en el cerebro se basa en las neuronas que responden adecuadamente a las entradas sinápticas. Las neuronas se diferencian en su complemento y la distribución de los canales iónicos de membrana que determinan la forma en que responden a las entradas sinápticas. Sin embargo, la relación entre estas propiedades y función celular neuronal en animales de comportarse no se entiende bien. Una aproximación a este problema consiste en investigar topográficamente organizadas circuitos neuronales en el que la posición de los mapas de neuronas individuales en la información que codificar o cálculos que llevan a cabo ^1. Los experimentos con este enfoque sugiere principios para el ajuste de las respuestas sinápticas que subyacen a la codificación de información en los circuitos sensoriales y cognitivas ^2,3.

La organización topográfica de las representaciones espaciales a lo largo del eje dorsal-ventral medial de la corteza entorrinal (MEC) ofrece una oportunidad para establecer relaciones entre los mecanismos celulares y cálculos importante para la cognición espacial. Las neuronas de la capa II del MEC roedores codificar la localización del uso de la red-como disparar los campos ^6.4. Para las neuronas que se encuentran en posiciones dorsal en el MEC la distancia entre los campos de tiro individuales que forman una rejilla es del orden de 30 cm, mientras que para las neuronas en las posiciones progresivamente más ventral esta distancia aumenta hasta más de 1 m. Varios estudios han revelado las propiedades celulares de las neuronas en la capa II del MEC que, como la separación entre los campos de la rejilla de cocción, también se diferencian de acuerdo a su posición dorsal-ventral, lo que sugiere que estas propiedades celulares son importantes para el cálculo espacial ^2,7-10.

Aquí se describen los procedimientos para la preparación y registro electrofisiológico de rodajas de cerebro que mantienen la medida de dorsal-ventral de la investigación MEC habilitación de la organización topográfica de las propiedades biofísicas y anatómico de las neuronas del MEC. La posición dorso-ventral del n identificadoseurons en relación con puntos de referencia anatómicos es difícil establecer con precisión con los protocolos que utilizan las rebanadas horizontales de MEC ^7,8,11,12, ya que es difícil establecer puntos de referencia para la exacta ubicación de dorsal-ventral de la rebanada. Los procedimientos aquí descritos permiten la medición precisa y consistente de la ubicación de las celdas grabadas a lo largo del eje dorsal-ventral del MEC, así como la visualización de los gradientes moleculares ^2,10. Los procedimientos se han desarrollado para su uso con ratones adultos (> 28 días) y se han empleado con éxito con ratones hasta 1,5 años de edad. Con ajustes que podría ser utilizado con más jóvenes ratones u otras especies de roedores. Un sistema estandarizado de preparación y de medición ayudará a la investigación sistemática de las propiedades celulares y microcircuitos de esta zona.

Protocol

1. Preparación Slice parasagital

1,1 Disecte hemisferios cerebrales

Todos los experimentos con animales deben seguir de revisión de ética local y las normativas nacionales. En el caso de los experimentos descritos aquí, el trabajo se ajusta a los animales del Reino Unido (Procedimientos Científicos) de 1986. Habitualmente usamos la dislocación cervical sin anestesia para practicar la eutanasia con el ratón antes de retirar el cerebro. Alternativamente, el ratón puede ser bajo anestesia, pero en este caso puede ser necesario para determinar si la elección del anestésico influye propiedades neuronales.

Retire el cerebro del ratón y de inmediato el lugar en frío (4-8 º C) de corte líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (ver Tabla 1 para las composiciones de solución) burbujear a la saturación con carbógeno (95% de O _2, 5% de CO _2).

Después de un máximo de tres minutos, retire con cuidado el cerebro de la cUtting ACSF con una espátula y suavemente coloque en posición vertical (cara dorsal hacia arriba) sobre papel de filtro que se ha humedecido con el corte ACSF (fig. 1A).

Para facilitar el montaje preciso de los hemisferios, use una navaja de afeitar o un bisturí para extirpar tanto del cerebelo como sea posible sin afectar el MEC (que se encuentra en el extremo caudal del cerebro) y retire la tercera rostral del cerebro por el corte en el plano coronal (Figura 1B).

Hemisect el cerebro, teniendo cuidado de que la sección es exactamente a lo largo del plano vertical de la línea media (Figura 1C).

Volver a los hemisferios de la ACSF burbujas cortar durante unos minutos una vez y media.

1.2 Montar los hemisferios en un vibrátomo

Antes de montar, asegurar que el borde cortante de la cuchilla vibrátomo tiene un ángulo de 20 grados desde la horizontal (

Tomando precauciones para minimizar el impacto físico, salga cada hemisferio de la ACSF de corte con una espátula y la posición de modo que su superficie media se basa en la espátula y su extensión dorsal mira hacia la cuchilla de microtomo. Deslice con cuidado cada hemisferio en la tira de pegamento, con cuidado para asegurarse de que la superficie medial de cada hemisferio es paralela a la base del microtomo. Se ha encontrado que para obtener mejores resultados la superficie dorsal de cada hemisferio debe ser paralelo a la hoja y se enfrentan a vibrátomo (Figura 1D).

1,3 Mantenimiento de la preparación durante el rebanado

Después de montar de inmediato sumergir los hemisferios en el corte en frío ACSF (4 - 8 ° C). Mantener la temperaturey carbógeno saturación durante todo el procedimiento de corte en lonchas. Si el enfriamiento directo y burbujeo de la solución en la cámara de corte no es práctico, periódicamente reponer la solución ACSF de corte en la cámara con una solución fresca enfriada y se burbujeó.

1.4 tramos de corte

El uso de un vibrátomo, quitar la corteza de ambos hemisferios en el plano sagital hasta que identifique el punto más lateral de la MEC (normalmente ~ 1 mm por debajo de la superficie lateral) (Figura 1 F).

Entre los recortes levantar la hoja vibrátomo hasta ~ 200 micras para evitar arrastrar la hoja hacia atrás una y dañar los tejidos expuestos. Simultáneamente cortar secciones 400 micras parasagitales de ambos hemisferios (si están alineados como se muestra en la Figura 1D ambos serán cortados al mismo tiempo) hasta el punto medial de la MEC se alcanza. Esto puede ser identificado por la ausencia de la banda blanca gruesa alrededor de la curva ventro-caudal de tque el hipocampo (la cápsula externa), la forma no-convexa de su límite rostral y el ángulo dorso-caudal 'esquina'. Figura 1E muestra el aspecto circular del hipocampo en el plano parasagital lateral al MEC. Figuras 1F-G ilustran como secciones dentro del MEC aparecen en diferentes posiciones de lateral medial al rebanar. Tenga en cuenta la cada vez más en forma de frijol aparición del hipocampo a posiciones más mediales. Cada hemisferio normalmente produce dos o tres rodajas de 400 micras de espesor que contiene el MEC.

1.5 Incubar las rebanadas

Después de cada corte inmediatamente colocar las rebanadas en carbógeno saturado estándar ACSF mantenidos en un baño de agua a 35 ° C. Permitir rebanadas incubar a 35 ° C durante aproximadamente 15 minutos en el ACSF después de rebanar es completa.

Retire el soporte de corte del baño de agua y continuar con carbogen burbujeo a temperatura ambiente durante al l45 minutos al este.

2. Parasagital Ejemplo Slice Experimento

Un experimento típico con esta preparación consiste en hacer registros electrofisiológicos de las células estrelladas en la capa II del MEC.

2.1 Optimización de la óptica

Antes de grabar, asegúrese de que el condensador está enfocado en el plano de corte (iluminación Koehler) y se centra en el gran aumento (por ejemplo 40x) objetivo.

2.2 Identificar las células de interés

Utilizar un bajo aumento (por ejemplo 4x) objetivo de identificar una región de grabación aproximado dentro de la MEC (Figura 2A-B). Cambiar a un objetivo de gran aumento para identificar células viables dentro de esta región (Figura 2C-D).

Como un ejemplo, la capa II putativo células estrelladas son visualmente identificados por su forma poligonal u ovoide y múltiples dendritas primarias con diámetros similarester, y la ausencia de un diámetro único gran dendrita apical, ^2,13,14. Están identificadas con toda fiabilidad en el borde de la capa I / II de la frontera, donde son muy abundantes y aparecen a menudo en pequeños grupos ^2,9 (Figura 2C-D). Otros tipos de células, tales como interneuronas y células piramidales también deben ser identificables.

En este punto experimentos puede llevarse a cabo, por ejemplo utilizando células enteras parche-abrazadera para registrar el potencial de membrana o corriente de membrana de las neuronas identificadas, y métodos eléctricos o optogenética para activar las entradas sinápticas a la neurona registrada. Neurona se puede verificar la identidad de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas registradas y mediante la inclusión de marcadores fluorescentes dentro de la solución intracelular.

3. Mida ubicación en el eje dorso-ventral

3.1 Ubicación de la imagen de interés y el tramo que rodea

Para determinar la posición de un Recorneurona ded lo largo del eje dorsal-ventral, en primer lugar utilizar un objetivo de bajo aumento a la imagen de la región del MEC de la división y las áreas circundantes. Marcar la ubicación de interés, por ejemplo, incluyendo el electrodo de registro en una imagen (Figura 3A) o por paso a paso hacia abajo el diafragma de iris de campo para dejar un círculo brillante alrededor de la ubicación de interés en una imagen duplicada. Para determinar la ubicación de la grabación de la imagen, el duplicado se puede superpuesta a la imagen inicial del lugar de grabación y sus alrededores (Figura 3B). Hasta 3 aumentos por separado bajo (4x) las imágenes pueden ser necesarios para cubrir la zona desde un lugar de grabación ventral al borde dorsal del MEC. Estas imágenes pueden ser cosidos juntos utilizando la imagen de manipulación de software para proporcionar una imagen que las mediciones de distancia se puede tomar de (Figura 3). Verificación adicional de la identidad y la ubicación neurona puede llevarse a cabo siguiendo la grabación mediante la inclusiónmarcadores inactivos tales como biocitina o Alexa colorantes dentro de la solución intracelular y, a continuación utilizando el procesamiento adecuado del tejido después de la grabación ^2.

3.2 Establecer el borde dorsal del MEC

El borde dorsal del MEC ofrece un punto de referencia conveniente desde el cual medir la posición dorsal-ventral. El borde ventral del MEC no está tan bien definido.

La figura 4 ilustra cómo los puntos de referencia de MEC celulares definidos en Nissl rebanadas teñidas en diferentes posiciones medial-lateral aparecen bajo iluminación DIC.

Figura 4 muestra el hipocampo circular (Figura 4 (i)) y la falta de una protuberancia en la capa parasubicular I (Figura 4 (iv)) asociada con las rebanadas contienen parasagital lateral corteza entorrinal (LEC).

La figura 4 antes de Cristo muestran cortes típicos que contienen el MEC. La parte dorsal de la región dorsal prominente oscura frontera entorrinal / Parasubicular en los cortes iluminados DIC contiene un área de la parasubiculum. El área parasubiculum se revela claramente por tinción de Nissl en las imágenes correspondientes en la columna (iii). El borde dorsal del MEC (flechas negras en la 4B y 4C en la columna (iv)) es ventral al grupo de células parasubicular que sobresale lejos en la capa I (flechas rojas en la 4B y 4C en la columna (iv)).

La comparación de las figuras 4B y 4C columnas (ii) y (iii) muestra que el borde dorsal del MEC en las secciones de Nissl corresponde a un lugar que es ventral al borde dorsal de la región de la frontera oscura entorrinal / Parasubicular en el corte (DIC flechas negras). La ubicación de la frontera puede ser estimada a partir de imágenes DIC y la comparación de las imágenes de referencia (véase también ref. 14). El futuro de la validación de borde dorsal del MEC con los marcadores moleculares mejorará la exactitud de esta estimación. Tomamos nota del that tiñeron secciones de referencia, y las secciones que son procesados ​​para la identificación morfológica de neuronas marcadas, pueden estar sujetos a la contracción considerable. La comparación de distancias absolutas con respecto a puntos de referencia en la DIC y las secciones de referencia por lo tanto, requiere en primer lugar la medición y la corrección de la contracción (véase, por ejemplo ref 2).

3.3 Calibrar y medir las distancias

Para facilitar la medición de las distancias en las imágenes, utilice el mismo objetivo de bajo aumento a la imagen de una red de referencia para establecer un píxel: Relación de distancia de la conversión. Medir la distancia de píxel desde el borde dorsal del MEC para la ubicación de interés a lo largo del contorno de la MEC mediante un programa de gráficos y convertir distancia píxeles a distancia en micras (Figura 5A). Si las neuronas están llenos con un marcador tal como biocitina, a continuación, la ubicación de la neurona registrada entonces puede también ser recuperado por tratamiento apropiado (ver ref por ejemplo 2).

4. Repr.Resultados esentative

La figura 5A muestra un ejemplo bajo aumento (4x) imagen compuesta de una rebanada parasagital después de la grabación, con las ubicaciones de las neuronas grabadas y guías de medición superpuestas. Las grabaciones de las células estrelladas marcados dorsal y ventral se muestran en la Figura 5B. Estas grabaciones ayudar a establecer la identidad de las células e ilustrar cómo las propiedades eléctricas de las células de la capa II del MEC estrelladas difieren en puntos dorsales y ventrales.

Figura 1. Preparación de rebanadas parasagitales. Un total del cerebro en reposo con la cara dorsal hacia arriba en papel de filtro humedecido con el corte de ACSF. B C hemiseccionaron listos para el montaje. D montada hemisferios en la tira de pegamento paralela al filo de la cuchilla vibrátomo previo a la inmersión en la reducción de ACSF y rebanar. E Aspecto de la sección que contiene LEC en la apariencia rebanar procedimiento después de la extracción de tejido lateral y F no todavía suficientemente medial para un estándar rebanada MEC parasagital. de "lateral" parte del MEC después de eliminar otros 400 micras de tejido (la superficie es de 400 micras medial a la mostrada en . (F)) Apariencia G de la 'media' de la MEC después de un corte parasagital 400 micras se ha reducido Esquemas de HI FI, respectivamente, indicando puntos de referencia anatómicos, c:. cerebelo, L: lateral de la corteza entorrinal (LEC), m: Medial corteza entorrinal (MEC), h: el hipocampo, el naranja: cápsula externa, azul: cuerpo calloso, cian: giro dentado, green: CA3 y CA1. La aparición de los límites rostral del hipocampo en sectores que contengan LEC es cóncava (flecha negro en H), mientras que en sectores que contienen solamente el MEC, el límite puede ser lineal (flecha roja en la I) o cóncava (flecha roja en la J). Las formas aproximadas de los puntos anatómicos de colores se obtuvieron a partir de las anotaciones en el Atlas Allen del Cerebro ( http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html ).

Figura 2. La identificación de las células de la capa II del MEC bajo iluminación DIC. Una imagen Ejemplo compuesto de un párrafo corte sagital del cerebro a bajo aumento (4x). Imágenes separadas se han alineado y se mezcla para eliminar los bordes de distracción y las viñetas. Áreas hito importante h: el hipocampo, el m:. MEC B de cultivos de un individuo de bajos aumentos (4x) la imagen que contiene la capa II del MEC, visible como la banda oscura vertical cerca del borde derecho C MEC capa II con una gran ampliación (. ) 40x con iluminación DIC. La imagen es un compuesto alineados y mezclado de varias imágenes. La central densa "columna" de las células es la Capa II. D Una imagen de gran aumento DIC mostrando un grupo de supuestos sanos las células estrelladas y las interneuronas de la capa II. Como se muestra aquí, células estrelladas con frecuencia ocurren en los grupos en la frontera de la capa I / II. Células piramidales tienden a encontrarse más cerca de la capa II / III frontera. Las líneas de puntos en la CA indicar el grado de BD, respectivamente. Las barras de escala: en el A y B de 500 m, en C y D de 100 micras.

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Figura 3. La medición de la posición dorsal-ventral de los lugares de interés. Un aumento Alineados baja (4x) imágenes que incluyen la totalidad del dorso-ventral medida del MEC entre la ubicación de interés (marcado por la punta de un electrodo de grabación) y el punto de referencia límite oscuro región entorrinal / Parasubicular (utilizado para establecer el borde dorsal del MEC - ver figura 4) B Al igual que en A, pero que incluye una imagen superpuesta con un campo de abajo dejó de diafragma de iris (superpuesta con la opacidad reducida) en lugar de un electrodo de registro para marcar la ubicación de su interés..

Figura 4. La estimación del borde dorsal del MEC a partir de imágenes de cortes parasagitales DIC. AC secciones parasagitales (lateral a medial) de la corteza entorrinal. DIC y secciones de Nissl son de micrófono diferentecolumna e de CA (i):.. rebanadas enteras parasagitales (400 m de espesor) (alineado y materiales compuestos de mezclas de bajo aumento (4x) imágenes) en la columna de CA (ii): Cerca de la corteza entorrinal con características región oscura frontera entorrinal / Parasubicular en el área superior de cada imagen. AC columna (iii) rebanadas Nissl teñidas (40 m de espesor) de un ratón diferente alineado con imágenes en AC (ii). Cuanto más oscura, densa capa de células es la capa II. La comparación de las columnas (ii) y (iii) muestra cómo las células teñidas de Nissl aparecen en las imágenes DIC columna de CA (IV):. Detalle de Nissl rebanadas de colores. La columna B y C (iv) incluir las células de la parasubiculum (parte dorsal de la región de la frontera oscura entorrinal / Parasubicular en las imágenes DIC) y las células del MEC dorsal. En B (IV) y C (iv) el gran parche dorsal de las células parasubicular que se extiende profundamente en la capa que es fácilmente visible (flechas rojas). El borde ventral de estos parches se corresponde con el dorsal de borden del MEC (flechas negras). En A (iv) el parche parasubicular está ausente, lo que indica que la rebanada es demasiado lateral para un estándar de preparación parasagital rebanada MEC. En todos los paneles, las flechas negras indican el borde dorsal del MEC. Flechas grises indican la frontera aproximada ventral del MEC.

Figura 5. Los resultados representativos. Una porción combinada y recortada de la imagen en la Figura 3 Una. Las posiciones de una célula dorsal y ventral de una célula se indican con azul y verde, respectivamente círculos rellenos. La flecha negro marca la frontera estimada dorsal del MEC y se extiende a las capas profundas de la línea de puntos blancos. La línea blanca sólida es una guía que muestra la ruta de contorno a lo largo de la cual se tomó la medida en píxeles de la distancia desde el borde dorsal del MEC a la celda situada ventralmente. Barra de escala: 500 m B Electro.huellas fisiológicas de las células que indican en A. De izquierda a derecha - las respuestas subliminales a las medidas actuales utilizados para calcular la resistencia de entrada, respuesta a clavar un gran paso de corriente positiva, detalle pico.

Discussion

Para facilitar la investigación de las propiedades del circuito MEC que siguen a una organización dorsal-ventral que hemos descrito aquí con detalle un procedimiento para producir una preparación de corte parasagital que preserva la medida dorsal-ventral del MEC.

Los pasos críticos

Extracción del cerebro del animal. Tenga especial cuidado para evitar ejercer presión sobre el cerebro. Esto es más importante que la rápida eliminación del cerebro.

Cortando. Slice debe estar firmemente pegados al suelo de la cámara de retención. El vibrátomo debe tener el eje Z de vibración menores de 2 micras y se debe utilizar con gran amplitud y la configuración de baja velocidad. Los valores óptimos pueden variar entre los modelos y debe ser establecido por prueba y error.

Control de temperatura de las soluciones. Encontramos que la calidad del corte es sensible a la temperatura durante y después del corte. Outsid e la temperatura recomendada oscila el número de neuronas sanas se reduce, las neuronas pueden llegar a ser más difícil de parche y las respuestas a la entrada sináptica puede ser reducido.

De imágenes. Iluminación Koehler y centrado del diafragma de iris de campo son importantes para la visualización de las células antes de la grabación.

Solución de problemas

Las rebanadas contienen pocas células sanas. Vuelva a colocar las soluciones. Ver eje z desplazamiento en el vibrátomo. Revise la temperatura de las soluciones. Compruebe la orientación de la división durante el corte.

Las neuronas de la porción son difíciles de ver. Verifique la iluminación Koehler está configurado correctamente. Revise las lentes del microscopio están limpios.

Gigaseals dificultad para formar. Compruebe la forma de los electrodos de registro. Examine corte en busca de signos de muerte celular, por ejemplo, formas de células redondas, o células de alto contraste.

ve_content "> Imágenes de la división son difíciles de alinear. Asegúrese de que los cortes están en el foco para capturar el máximo detalle. Para la alineación automática de la imagen> 40% de superposición de imágenes suele ser suficiente.

Limitaciones

Una limitación potencial de la preparación rebanada parasagital es que las conexiones sinápticas del área de distribución muy largos dentro de la MEC no se puede ejecutar directamente en paralelo al plano parasagital ^{9, 15} y así no puede ser conservado. El mantenimiento de estas conexiones pueden requerir la modificación del procedimiento de preparación para cambiar el ángulo de la rebanada sea cortado por hemisecting o el montaje de los hemisferios cerebrales en la vibrátomo en un ángulo en el plano rostral-caudal. Consideraciones similares se pueden aplicar para la preservación de otras conexiones, por ejemplo, las entradas aferentes del tabique medial.

La comparación con los preparativos horizontales rebanada del MEC

1. La medición precisa de la dorsal-ventral ubicación es importantepara establecer relaciones cuantitativas entre posición a lo largo del eje dorsal-ventral y las propiedades fisiológicas. En las preparaciones rebanada horizontales ^7,8,11,12 es difícil determinar la exacta localización dorsal-ventral del corte y esto complica el establecimiento de una ubicación de referencia constante. En contraste, en la preparación rebanada parasagital el borde dorsal del MEC es fácil establecer como punto de referencia y el conocimiento de la profundidad de una neurona en una rebanada es innecesaria para medir su posición dorsal-ventral. Cortes parasagitales por lo tanto, facilitan enormemente la medición exacta de la ubicación dorsal-ventral, lo que permite una investigación más rápida y precisa de las relaciones cuantitativas entre dorsal-ventral ubicación y las propiedades celulares y el circuito.
2. Gradientes moleculares son importantes para la organización del circuito topográfico en el MEC y pueden ser visualizadas mediante técnicas de fluorescencia de etiquetado o de otra índole. En comparación con las rebanadas horizontales, en los cuales ªseñal de correo tendría que ser comparado entre cortes en diferentes lugares dorsal-ventral, la preparación parasagital permite una más fácil, la visualización de grano más fino y más fiable y cuantificación de dorsal-ventral gradientes moleculares.
3. . Dorsal-ventral en los gradientes de la conectividad sináptica pueden desempeñar un papel importante en la función del MEC. La preparación corte parasagital puede preservar las conexiones sinápticas entre las zonas dorsal y ventral en el MEC, lo cual es importante para la investigación de cómo las conexiones dentro y entre las diferentes ubicaciones distintas a lo largo del eje dorsal-ventral del MEC y para el mantenimiento de la integridad del circuito por igual a diferentes dorsal-ventral lugares. Si la conectividad varía sustancialmente a lo largo del eje dorsal-ventral, rebanadas horizontales son menos propensos a incluir igualmente enteras microcircuitos funcionales en cada extremo.

Futuros desarrollos y aplicaciones

El conocimiento de los determinantes molecularesde la identidad celular en el MEC permitirá la caracterización definitiva de la identidad neuronal y permite la determinación más precisa de la ubicación dorsal-ventral.

Uso de la rebanada preparación parasagital, respuestas topográficamente organizadas de tipo celular y la ubicación específica de la actividad de múltiples neuronas se puede observar de manera simultánea (por ejemplo, con tensión tintes sensibles o imágenes de calcio) en un único segmento.

En combinación con las herramientas de optogenética, la preparación parasagital permite la activación selectiva en diferentes posiciones a lo largo del eje dorsal-ventral. Preguntar cómo los microcircuitos en los diferentes dorsal-ventral lugares responde a la activación de objetivos espaciales podría ofrecer pistas importantes sobre la función del MEC microcircuito.

Esperamos que esta preparación servirá de base simple, robusto y estandarizado para la investigación de dorsal-ventral gradientes en las propiedades fisiológicas y facilitar lacomprensión de cómo estos gradientes contribuyen a las propiedades de procesamiento de información del MEC.