Summary
Nós descrevemos processos de preparação e de gravação electrofisiológico de fatias do cérebro que mantêm o eixo dorso-ventral do córtex entorrinal medial (MEC). Devido codificação neural da localização seguinte uma organização dorsal-ventral dentro do MEC, estes procedimentos facilitar a investigação dos mecanismos celulares importantes para navegação e de memória.
Abstract
Computação no cérebro depende de neurônios que respondem adequadamente às suas entradas sinápticas. Neurônios diferem em seu complemento e distribuição de canais de membrana de íons que determinam como eles respondem a entradas sinápticas. No entanto, a relação entre estas propriedades celulares e função neuronal em comportando animais não é bem compreendida. Uma abordagem para este problema é investigar topograficamente organizadas circuitos neurais em que a posição de mapas individuais neurônios para codificar informações de que ou os cálculos que realizam 1. Experimentos utilizando esta abordagem sugere princípios para ajuste das respostas sinápticas subjacentes codificação da informação em circuitos sensoriais e cognitivos 2,3.
A organização topográfica das representações espaciais ao longo do eixo dorso-ventral medial do córtex entorrinal (MEC) oferece uma oportunidade para estabelecer relações entre os mecanismos celulares e cálculos important para a cognição espacial. Neurônios na camada II do MEC roedor codificar localização utilizando-grade como disparar campos 4-6. Para os neurónios encontrados nas posições dorsal no MEC a distância entre os campos de queima individuais que formam uma grelha é da ordem de 30 cm, enquanto que para os neurónios em posições progressivamente mais ventrais esta distância aumenta para mais de 1 m. Vários estudos têm revelado propriedades celulares de neurónios na camada II do MEC que, tal como o espaçamento entre os campos de grade de queima, também diferem de acordo com a sua posição dorsal-ventral, sugerindo que estas propriedades celulares são importantes para a computação espacial 2,7-10.
Aqui descrevemos procedimentos de preparação e gravação eletrofisiológico de fatias do cérebro que mantêm a extensão dorso-ventral da investigação MEC permitindo a organização topográfica das propriedades biofísicas e anatômico de neurônios do MEC. A posição dorsal-ventral de n identificadoeurons relativos aos marcos anatômicos é difícil estabelecer com precisão com os protocolos que utilizam fatias horizontais do MEC 7,8,11,12, como é difícil estabelecer pontos de referência para a localização dorso-ventral exato da fatia. Os procedimentos aqui descritos permitem uma medição precisa e consistente com a localização de células registados ao longo do eixo dorso-ventral do MEC, bem como a visualização de gradientes moleculares 2,10. Os procedimentos foram desenvolvidos para utilização com ratos adultos (> 28 dias) e foram empregues com sucesso com ratos até 1,5 anos de idade. Com os ajustes que poderiam ser usados com ratos mais jovens ou outras espécies de roedores. Um sistema padronizado de preparação e medição ajudará investigação sistemática das propriedades celulares e microcircuito desta área.
Protocol
1. Preparação Slice parassagital
1,1 dissecar hemisférios cerebrais
Todos experimentação animal deve seguir revisão ética local e regulamentos nacionais. No caso das experiências descritas aqui, o trabalho está em conformidade com os animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act de 1986. Nós usam rotineiramente deslocamento cervical, sem anestésico para eutanásia o mouse antes de remover o cérebro. Alternativamente, o rato pode ser terminalmente anestesiados, mas neste caso, pode ser necessário para determinar se a escolha do anestésico influencia as propriedades neuronais.
Remover o cérebro do rato e imediatamente lugar no frio (4-8 ° C) de corte do fluido cerebrospinal artificial (ACSF) (ver Tabela 1 para as composições de solução) borbulhar à saturação com carbogénio (95% de O 2, 5% de CO 2).
Depois de um máximo de três minutos, retire cuidadosamente o cérebro da cUtting ACSF usando uma espátula e delicadamente colocá-lo na posição vertical (lado dorsal virado para cima) em papel filtro que foi umedecido com o ACSF de corte (Figura 1A).
Para facilitar a montagem precisa dos hemisférios, utilizar um aparelho de barbear ou bisturi para remover o máximo do cerebelo quanto possível sem prejudicar o MEC (localizado no extremo caudal do cérebro) e remover o terceiro rostral do cérebro por seccionamento no plano coronal (Figura 1B).
Hemisect o cérebro, tomando cuidado para que a secção é exactamente ao longo do plano vertical da linha média (Figura 1C).
Retornar os hemisférios ao ACSF borbulhar de corte para um minutos e meio.
1,2 Montar os hemisférios em um vibratome
Antes da montagem, assegurar que a aresta de corte da lâmina tem um ângulo vibratome menos 20 graus com a horizontal ( Tendo o cuidado de minimizar o impacto físico, remover cada hemisfério do ACSF de corte com uma espátula e posição de modo que a sua superfície medial repousa sobre a espátula e sua extensão dorsal está voltado para a lâmina de micrótomo. Deslize suavemente cada hemisfério sobre a tira de supercola, tendo o cuidado de garantir que a superfície medial de cada hemisfério é paralela à base micrótomo. Descobrimos que, para melhores resultados a superfície dorsal de cada hemisfério deve ser em paralelo e em frente da lâmina vibratome (Figura 1D). 1.3 Manutenção da preparação durante o corte Na sequência de montagem imediatamente submergir os hemisférios a frio de corte ACSF (4 - 8 ° C). Manter a temperaturee carbogénio saturação durante todo o procedimento de corte. Se o arrefecimento directo e borbulhamento da solução na câmara de corte não é prático, periodicamente reabastecer a solução ACSF de corte na câmara com uma solução gelada e borbulhou fresco. 1,4 pontos de corte Usando um vibratome, remover córtex de ambos os hemisférios no plano sagital até identificar o grau mais lateral do MEC (tipicamente ~ 1 milímetro para baixo a partir da superfície lateral) (Figura 1F). Entre cortes de levantar a lâmina vibratome até ~ 200 mm a evitar arrastando a lâmina de volta e danificar o tecido exposto. Simultaneamente cortar 400 uM secções parassagitais a partir de ambos os hemisférios (se eles estão alinhados, como mostrado na Figura 1D ambos irão ser cortado ao mesmo tempo) até que a extensão medial do MEC é atingido. Isto pode ser identificados pela ausência da banda espessa branca em torno da curva ventro-caudal de tele hipocampo (a cápsula externa), a forma não-convexa da sua fronteira rostral eo angular dorso-caudal 'canto'. Figura 1E ilustra a aparência circular do hipocampo, no plano parasagital lateral ao MEC. Figuras 1F-G ilustram como seções dentro do MEC aparecem em diferentes posições medial lateral-quando cortar. Note-se a progressivamente mais aparência em forma de feijão do hipocampo em posições mais medial. Cada hemisfério normalmente produz dois ou três 400 m de espessura, contendo o MEC. 1,5 fatias Incubar Após cada corte colocar imediatamente as fatias em carbogénio-saturado padrão ACSF mantidas em um banho de água a 35 ° C. Permitir fatias a incubar a 35 ° C durante aproximadamente 15 minutos no ACSF após o corte está completa. Remova o suporte fatia do banho de água e continuar borbulhando com carbogénio à temperatura ambiente durante a lleste 45 minutos. 2. Exemplo Experiment Slice parassagital Uma experiência típica usando esta preparação é a de fazer gravações electrofisiológicos a partir de células estreladas em camada II do MEC. 2.1 Otimizar óptica Antes de gravar, assegurar que o condensador está em foco no plano fatia (Koehler iluminação) e é centrado sob a ampliação elevada (por exemplo, 40x) objectivo. 2.2 identificar as células de interesse Usar uma ampliação baixa (por exemplo 4x) objectivo de identificar uma região de gravação aproximado dentro da MEC (Figura 2A-B). Mudar para um objectivo ampliação elevada para identificar as células viáveis dentro desta região (Figura 2C-D). Como um exemplo, putativos da camada de células estreladas II são visualmente identificados pela sua forma poligonal ou ovóide e múltiplos dendritos primários com diâmetros semelhanteter, ea ausência de um único grande diâmetro apical dendrite 2,13,14. Eles são seguramente identificado na borda da camada fronteira I / II, onde são abundantes e muitas vezes aparecer em pequenos grupos 2,9 (Figura 2C-D). Outros tipos de células, tais como interneurónios e células piramidais também deve ser identificável. Neste ponto experiências pode ser realizada, por exemplo, utilizando de células inteiras de patch-clamp para gravar o potencial de membrana ou membrana de corrente a partir de neurónios identificados, e os métodos eléctricos ou optogenetic para activar entradas sinápticas para o neurónio gravada. Neuron identidade pode ser verificado a partir das propriedades electrofisiológicas do neurónio gravado e através da inclusão de etiquetas fluorescentes dentro da solução intracelular. 3. Meça localização ao longo do eixo Dorso-ventral 3,1 localização da imagem de interesse e fatia em torno Para determinar a posição de um RECORneurônio ded ao longo do eixo dorso-ventral, pela primeira vez um objetivo pequeno aumento para a imagem da região MEC da fatia e áreas circunvizinhas. Marcar a localização de interesse, por exemplo, incluindo o eléctrodo de gravação em uma imagem (Figura 3A) ou por descer o diafragma de íris de campo para deixar um círculo brilhante em torno da localização de interesse em uma imagem duplicada. Para identificar a localização de gravação dentro da imagem do duplicado pode então ser sobreposta sobre a imagem inicial do local de gravação e os seus arredores (Figura 3B). Até 3 ampliação separado baixa (4x) imagens pode ser necessária para cobrir a área a partir de um local de gravação ventral à borda dorsal da MEC. Estas imagens podem então ser cosido em conjunto, utilizando manipulação de imagens de software para fornecer uma imagem que medidas de distância pode ser tomada a partir de (Figura 3). Verificação ulterior do neurónio identidade e localização pode ser realizada seguindo de gravação através da inclusãomarcadores inactivos tais como biocitina ou corantes Alexa dentro da solução intracelular e, em seguida, utilizando o processamento apropriado do tecido seguindo de gravação 2. 3,2 Estabelecer a borda dorsal do MEC A borda dorsal do MEC fornece um marco conveniente para medir dorso-ventral posição. A borda ventral do MEC não está tão bem definido. Figura 4 ilustra como os marcos definidos no MEC celulares Nissl fatias coradas em diferentes médio-lateral posições aparecem sob iluminação DIC. A Figura 4 A mostra o hipocampo circular (Figura 4 (i)) e à falta de uma saliência parasubicular em camada I (Figura 4 (iv)) associado com fatias parassagitais contendo lateral córtex entorrinal (LEC). Figura 4 BC mostram fatias típicas que contêm o MEC. A parte dorsal da região de fronteira proeminente escuro dorsal entorrinal / Parasubicular nas fatias DIC iluminados contém uma área da parasubiculum. A área parasubiculum é claramente revelado por coloração de Nissl nas imagens correspondentes em coluna (iii). A borda dorsal dos MEC (setas pretas em 4B e 4C coluna (iv)) é ventral para o grupo de células parasubicular que se projecta para fora em camada muito I (setas vermelhas no 4B e 4C coluna (iv)). Comparação das Figuras 4B e 4C colunas (ii) e (iii) mostra que a borda dorsal da MEC nas secções de Nissl corresponde a um local que é ventral ao bordo dorsal da região de fronteira escuro entorrinal / Parasubicular na fatia DIC ( setas pretas). A localização da fronteira pode ser estimada a partir de imagens DIC e comparação de imagens de referência (ver também ref. 14). Validação Futuro da borda dorsal MEC com marcadores moleculares irá melhorar a precisão da estimativa. Notamos that coradas secções de referência, e secções que são processadas para a identificação morfológica dos neurónios marcados, podem ser sujeitas ao encolhimento considerável. Comparação de distâncias absolutas em relação a marcos em DIC e seções de referência, portanto, requer em primeiro lugar medição ea correcção em retração (ver, por exemplo ref 2). Calibre 3,3 e medir distâncias Para facilitar a medição fácil de distância em imagens, utilizar o objectivo mesma ampliação baixa para a imagem de uma grade de referência para estabelecer um pixel: taxa de conversão de distância. Medir a distância de pixel a partir da borda dorsal da MEC para a localização de interesse ao longo do contorno da MEC usando um programa de gráficos e converter distância pixel para a distância em uM (Figura 5A). Se os neurónios são enchidos com um marcador tal como biocitina, em seguida, localização do neurónio gravado pode então também ser recuperada por processamento apropriado (ver, por exemplo ref 2). 4. ReprResultados esentative A Figura 5A mostra um exemplo de baixa ampliação (4x) imagem composta de uma fatia parasagital depois da gravação, com as localizações dos neurónios gravados e guias de medição sobrepostos. Gravações dos marcadas células estreladas dorsal e ventral são mostrados na Figura 5B. Essas gravações ajudam a estabelecer a identidade das células e ilustrar como as propriedades elétricas do MEC camada de células estreladas II diferem em locais dorsal e ventral. 
Figura 1. Preparação de fatias sagitais. Um cérebro inteiro descansando com o lado dorsal virado para cima em papel de filtro umedecido com corte ACSF. B
Figura 2. Identificação de células da camada II do MEC sob iluminação DIC. Uma imagem Exemplo composto de um par fatia sagital do cérebro em baixa ampliação (4x). As imagens separadas foram alinhados e misturados para remover bordas distracção e vinhetas. Importante marco h áreas: hipocampo, m:. MEC Cortar B de um indivíduo de baixa ampliação (4x) imagem que contém a camada II do MEC, visível como a faixa vertical escura perto da borda direita C MEC camada II em grande aumento (. ) 40x com iluminação DIC. A imagem é um composto alinhados e misturados de várias imagens. A central densa 'coluna' de células é Layer II. D imagem ampliação Único alta DIC mostrando um grupo de células saudáveis estreladas putativos e interneurônios na camada II. Como mostrado aqui, estrelada células geralmente ocorrem em grupos, na fronteira da camada I / II. Células piramidais tendem a ser encontrados mais perto da camada de fronteira II / III. As linhas pontilhadas na AC indicar a extensão da BD, respectivamente. Barras de escala: em A e B 500 mm, em C e D 100 uM.
Figura 3 "src =" files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg / "/>
Figura 3. Medir a posição dorsal-ventral de locais de interesse. Uma ampliação Alinhado baixa (4x) imagens que incluem a extensão dorso-ventral inteira do MEC entre o local de interesse (marcado pela ponta de um eléctrodo de registo) eo ponto de referência região escura entorrinal / Parasubicular fronteira (utilizada para estabelecer a borda dorsal do MEC - ver Figura 4) B Como em A, mas incluindo uma imagem sobreposta com uma parada para baixo campo diafragma (sobreposta com a opacidade reduzida) em vez de um eletrodo de registro para marcar o local de interesse..
Figura 4. Estimativa da borda dorsal do MEC a partir de imagens DIC de cortes sagitais. Seções AC parassagital (lateral para medial) do córtex entorrinal. Seções DIC e Nissl são de microfone diferenteAC e coluna (i):.. Whole fatias sagitais (400 mm de espessura) (alinhados e compostos de misturas de baixa ampliação (4x) imagens) coluna AC (ii): Feche acima do córtex entorrinal com a região de fronteira característica escuro entorrinal / Parasubicular em a área de topo de cada imagem. coluna AC fatias (iii) de Nissl corados (40 mm de espessura) a partir de um rato diferente alinhado com imagens em AC (ii). A camada mais escura, densa de células é a camada II. Comparando as colunas ii) e (iii) mostra como as células coradas de Nissl aparecem em imagens DIC AC coluna (iv):. Detalhe de Nissl fatias coradas. B e C em coluna (iv) incluem células do parasubiculum (parte dorsal da região de fronteira escuro entorrinal / Parasubicular nas imagens DIC) e células de MEC dorsal. Em B (iv) e C (iv) a grande mancha dorsal de células parasubicular que se estende em profundidade camada I é facilmente visível (setas vermelhas). A borda ventral destas manchas corresponde à bo dorsalRDEM do MEC (setas pretas). Num (iv) o adesivo parasubicular está ausente, indicando que a fatia é demasiado lateral para uma preparação padrão fatia parasagital MEC. Em todos os painéis, setas pretas indicam a borda dorsal do MEC. Setas cinzentas indicam a fronteira aproximada ventral do MEC.
Figura 5. Os resultados representativos. Uma porção Misturado e cortada da imagem da Figura 3 A. As posições de uma célula dorsal e ventral uma célula são indicados por azul e verde círculos a cheio, respectivamente. A seta preta marca a fronteira estimada dorsal do MEC e é estendido para as camadas profundas da linha branca pontilhada. A linha de sólido branco é um guia mostrando o caminho de contorno ao longo do qual a medição de pixel de distância a partir da borda dorsal da MEC para a célula ventralmente localizado foi tirada. Barra de escala: 500 mm B Electro.traços fisiológicos das células indicada em A. Da esquerda para a direita - respostas subliminares para as etapas atuais usados para calcular a resistência de entrada, spiking resposta a um passo positivo grande corrente, detalhe espiga.
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Discussion
Para facilitar a investigação das propriedades de circuito MEC que seguem uma organização dorsal-ventral temos descrito aqui em detalhe um procedimento para a produção de uma preparação fatia parasagital que preserva a extensão dorso-ventral do MEC.
As etapas críticas
Remover o cérebro do animal. Tome cuidado especial para evitar a exercer pressão sobre o cérebro. Isto é mais importante do que a remoção rápida do cérebro.
Fatias Slice. Devem ser firmemente coladas no chão da câmara de retenção. O vibratome deve ter z-eixo de vibração <2 micra e deve ser usado com alta amplitude e as configurações de baixa velocidade. As configurações ideais podem diferir entre os modelos e deve ser estabelecida por tentativa e erro.
Monitorar a temperatura da solução. Descobrimos que a qualidade fatia é sensível à temperatura, durante e após o corte. Outsid e da temperatura recomendada varia o número de neurónios saudáveis é reduzida, os neurónios pode tornar-se mais difícil de remendo e as respostas a entrada sináptica pode ser reduzido.
Imaging. Iluminação Koehler e centralização do diafragma de campo íris são importantes para a visualização de células antes da gravação.
Solução de problemas
Fatias contêm poucas células saudáveis. Substitua soluções. Verifique eixo z deslocamento no vibratome. Verifique a temperatura das soluções. Verifique a orientação da fatia quando o corte.
Neurônios da fatia são difíceis de ver. Verifique iluminação Koehler está configurado corretamente. Verifique lentes de um microscópio estão limpos.
Gigaseals dificuldade em formar. Verifique a forma de eletrodos de registro. Examinar fatia de sinais de morte celular, por exemplo, formas de células redondas, células ou de alto contraste.
ve_content "> Imagens da fatia são difíceis de alinhar. Verifique se as fatias estão em foco para capturar o máximo de detalhes. Para o alinhamento automático da imagem> imagem sobreposição de 40% é geralmente suficiente.Limitações
Uma limitação potencial da preparação fatia parasagital é que as conexões sinápticas alcance muito longo dentro do MEC não pode ser executado directamente paralelo ao plano parasagital 9, 15 e assim não pode ser preservada. Mantendo estas ligações podem exigir modificando o procedimento de preparação para alterar o ângulo da fatia cortada por qualquer hemisecting ou montagem dos hemisférios cerebrais no vibratome a um ângulo no plano rostral caudal. Considerações semelhantes podem ser aplicadas para a preservação de outras conexões, por exemplo entradas aferentes do septo medial.
Comparação com horizontais preparativos fatia do MEC
- A medição precisa de dorso-ventral localização é importantepara o estabelecimento de relações quantitativas entre a posição ao longo do eixo dorso-ventral e propriedades fisiológicas. Em preparações de fatia horizontais 7,8,11,12, é difícil determinar a localização exacta dorsal-ventral do corte e isso complica, que estabelece uma localização de referência consistente. Em contraste, na preparação fatia parasagital a borda dorsal da MEC é fácil para estabelecer como um ponto de referência e do conhecimento da profundidade de um neurónio de uma fatia é desnecessária para medir a sua posição dorsal-ventral. Fatias parasagital portanto facilitar grandemente medição exacta do dorso-ventral localização, permitindo investigação mais rápida e precisa de relações quantitativas entre dorsal-ventral localização e as propriedades celulares e do circuito.
- Gradientes moleculares são importantes para a organização de circuito topográfica no MEC e podem ser visualizados usando técnicas de marcação de fluorescência ou de outra. Em comparação com cortes horizontais, em que thsinal e teria de ser comparadas entre fatias em diferentes localizações dorsal-ventrais, a preparação parasagital permite a fácil visualização, mais refinado e mais fiável e quantificação de dorso-ventral gradientes moleculares.
- . Dorso-ventral gradientes em conectividade sináptica pode desempenhar um papel importante na função MEC. A preparação fatia parasagital pode preservar conexões sinápticas entre as áreas dorsais e ventrais dentro do MEC, o que é importante para investigar como ligações diferem dentro e entre os locais distintos ao longo do eixo dorso-ventral do MEC e para manter a integridade do circuito igualmente em diferentes dorsal-ventral locais. Se a conectividade varia substancialmente ao longo do eixo dorso-ventral, fatias horizontais são menos susceptíveis de incluir igualmente inteiras microcircuitos funcionais em cada extremo.
Os futuros desenvolvimentos e aplicações
O conhecimento dos determinantes molecularesde identidade celular no MEC irá permitir a caracterização definitiva da identidade neuronal e permitir uma determinação mais precisa do dorso-ventral localização.
Usando a preparação fatia parassagital, as respostas topograficamente organizadas de tipo celular e atividade de localização específica de múltiplos neurônios poderiam ser observados simultaneamente (por exemplo, usando tensão corantes sensíveis ou de imagem de cálcio) dentro de uma única fatia.
Em combinação com as ferramentas optogenetic, a preparação parasagital permite a activação selectiva em diferentes posições ao longo do eixo dorso-ventral. Perguntando como os micro circuitos em diferentes dorsal-ventral locais responde a ativação espacialmente alvo poderia entregar importantes insights sobre MEC função microcircuito.
Esperamos que esta preparação proporcionará uma base simples, robusto e padronizado para investigar dorso-ventral gradientes nas propriedades fisiológicas e facilitarcompreensão de como esses gradientes contribuir para as propriedades de processamento de informação do MEC.
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Disclosures
Nada de divulgar.
Acknowledgments
Estamos agradecer o seguinte para o seu apoio: Scholarship Commonwealth Comissão Reino Unido financiamento (HP), EPSRC (HP), BBSRC (NMF) e da União Europeia Acções Marie Curie (MFN).
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