Udarbejdelse af parasagittal skiver til undersøgelse af Dorsal-ventrale Organization of the Rodent Medial entorhinal cortex

Summary

Vi beskriver procedurer for forberedelse og elektrofysiologiske optagelse fra hjernen skiver, der opretholder dorsal-ventral akse mediale entorhinal cortex (MEC). Fordi neurale kodning af placeringen følger en dorsal-ventral organisation i MEC, disse procedurer lette efterforskningen af ​​cellulære mekanismer, der er vigtige for navigation og hukommelse.

Abstract

Beregning i hjernen afhængig neuroner reagerer hensigtsmæssigt på deres synaptiske input. Neuroner er forskellige i deres komplement og distribution af membran ionkanaler, der bestemmer, hvordan de reagerer på synaptiske input. Imidlertid er forholdet mellem disse cellulære egenskaber og neuronal funktion i at opføre dyr ikke godt forstået. En løsning på dette problem er at undersøge topografisk organiseret neurale kredsløb, hvor placeringen af de enkelte neuroner kort på de oplysninger, de koder eller beregninger, de foretager ^1. Forsøg med denne fremgangsmåde foreslår principper for tuning af synaptiske reaktioner underliggende oplysninger kodning i sensoriske og kognitive kredsløb ^2,3.

Den topografiske organisering af rumlige repræsentationer langs dorsal-ventral akse mediale entorhinal cortex (MEC) giver en mulighed for at etablere relationer mellem cellulære mekanismer og beregninger important for geografisk kognition. Neuroner i lag II gnaver MEC kode placering ved hjælp af grid-lignende fyre felter ^4-6. For neuroner findes i dorsale positioner i MEC afstanden mellem de individuelle affyringstider felter, som danner et gitter, er af størrelsesordenen 30 cm, hvorimod neuroner ved progressivt mere ventrale positioner denne afstand øges til mere end en meter. Adskillige undersøgelser har afsløret cellulære egenskaber af neuroner i lag II MEC, der som afstanden mellem gitteret fyres områder, også variere i henhold til deres dorsal-ventral position, hvilket antyder, at disse cellulære egenskaber er vigtige for rumlig beregning ^2,7-10.

Her beskriver vi procedurer for forberedelse og elektrofysiologiske optagelse fra hjernen skiver, der opretholder dorsal-ventral omfanget af MEC muliggør undersøgelse af topografiske organisation biofysiske og anatomiske egenskaber MEC neuroner. Dorsal-ventrale position identificeres neurons forhold til anatomiske landmærker er vanskeligt at fastslå præcist med protokoller, som bruger vandrette skiver af MEC ^7,8,11,12, da det er vanskeligt at opstille referencepunkter for den nøjagtige dorsal-ventral placering skive. De procedurer, vi beskriver muliggør nøjagtig og konsistent måling af placeringen af registrerede celler langs den dorsale-ventrale akse MEC samt visualisering af molekylære gradienter ^2,10. Procedurer er blevet udviklet til anvendelse med voksne mus (> 28 dage) og er med held blevet anvendt med mus op til 1,5 år. Med justeringer de kunne bruges med yngre mus eller andre gnaverarter. Et standardiseret system af forberedelse og måling vil hjælpe systematisk undersøgelse af de cellulære og mikrokredsløb egenskaber af dette område.

Protocol

1. Parasagittal Slice Forberedelse

1,1 Skær ud hjernehalvdele

Alle dyreforsøg bør følge lokale etisk vurdering og nationale regler. I tilfælde af forsøgene beskrevet her, er i overensstemmelse arbejdet til de britiske Dyr (Scientific Procedures) Act 1986. Vi rutinemæssigt bruger cervikal dislokation uden bedøvelse for at aflive musen, før du fjerner hjernen. Alternativt musen kan være terminalt bedøvede, men i dette tilfælde kan det være nødvendigt at bestemme, om valget af narkosemiddel påvirker neuronale egenskaber.

Fjernes hjernen fra musen og straks sted i koldt (4-8 ° C) skæring kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) (se tabel 1 for opløsning sammensætninger) bobles til mætning med carbogen _(95% O2, 5% CO _2).

Efter højst tre minutter, fjern forsigtigt hjernen fra CUtting ACSF anvendelse af en spatel og forsigtigt anbringe det i en opret stilling (dorsalsiden opad) på filtrerpapir, som er blevet fugtet med den skærende ACSF (figur 1A).

For at lette nøjagtig montering af halvkugler, anvendes en skraber eller skalpel for at fjerne så meget af cerebellum som muligt uden at påvirke MEC (placeret ved den caudale ekstreme af cerebrum) og fjern den rostrale tredjedel af cerebrum ved sektionering i det koronale plan (figur 1B).

Hemisect hjernen, idet man, at den del er nøjagtigt langs det vertikale plan af midterlinjen (figur 1C).

Returnér halvkugle til den boblede skære ACSF for en og et halvt minut.

1,2 Monter halvkugler på en vibratome

Før montering, at den skærende kant af vibratome bladet er vinklet ved 20 grader fra vandret (

Omhyggeligt minimere fysisk påvirkning, fjerne hver hemisfære fra det skærende ACSF med en spatel og position, således at dens mediale overflade hviler på spatel og dorsale udstrækning vender mod mikrotom klingen. Forsigtigt skubbe hver hemisfære på strimlen af ​​superlim, idet det sikres, at den mediale flade af hver hemisfære er parallel med mikrotom base. Vi har fundet, at de bedste resultater dorsale overflade af hver hemisfære bør være parallel med og vender mod vibratome bladet (figur 1D).

1,3 Vedligeholdelse af forberedelse i udskæring

Efter montering straks nedsænkes hjernehalvdele i koldskæring ACSF (4 - 8 ° C). Vedligehold temperature og carbogen mætning hele udskæring procedure. Hvis direkte køling og boblende af løsningen i skærekammeret ikke er praktisk muligt, periodisk genopbygge skære ACSF løsning i kammeret med frisk afkølet og boblede løsning.

1.4 Snit

Ved hjælp af en vibratome, cortex fjernes fra begge halvkugler i sagittalplanet indtil identificere den laterale mest omfang MEC (typisk ~ 1 mm ned fra den laterale overflade) (figur 1F).

Mellem snit løfte vibratome bladet op ~ 200 um for at undgå at trække bladet tilbage over og beskadige det eksponerede væv. Samtidigt at skære 400 um parasagittal sektioner fra begge hemisfærer (hvis de er linet op, som vist i figur 1D, vil begge blive skåret på samme tid), indtil den mediale omfanget af MEC er nået. Dette kan identificeres ved fraværet af den tykke hvide bånd omkring Ventro-caudal kurve tHan hippocampus (den ydre kapsel), ikke-konvekse form af rostralt grænse og den vinkelmæssige dorso-caudal hjørne. Figur 1E illustrerer den cirkulære udseende af hippocampus i parasagittal planet lateralt for MEC. fig 1F-G viser hvordan sektioner i MEC vises ved forskellige laterale-mediale positioner, når udskæring. Bemærk gradvist mere bønne-formede udseende af hippocampus på flere mediale positioner. Hver halvkugle giver typisk to eller tre 400 um tykke skiver indeholdende MEC.

1.5 Inkuber skiver

Efter hvert snit anbringes straks skiverne i carbogen-mættet standard ACSF holdt i et vandbad ved 35 ° C. Tillader skiver til at inkubere ved 35 ° C i cirka 15 minutter i ACSF efter udskæring er fuldført.

Fjerne udsnittet holderen fra vandbadet og fortsætte gennembobling med carbogen ved stuetemperatur i løst 45 minutter.

2. Eksempel parasagittal Slice Experiment

Et typisk forsøg med dette præparat er at elektrofysiologiske optagelser fra stjerneformige celler i lag II MEC.

2.1 Optimer optik

Før optagelse sikre, at kondensatoren er i fokus på skive plan (Köhler belysning), og er centreret under stor forstørrelse (f.eks 40x) mål.

2.2 identificere celler af interesse

Anvende en lav forstørrelse (f.eks 4x) mål for at identificere en omtrentlig optagelse region i MEC (figur 2A-B). Skifte til en stor forstørrelse mål at identificere levedygtige celler i denne region (figur 2C-D).

Som et eksempel er putative lag II stjerneformige celler identificeres visuelt ved deres polygonal eller ægformede og multiple primære dendritter med lignende diater, og fravær af en enkelt stor diameter apikal dendritceller ^2,13,14. De er sikkert identificeret på kanten af Layer I / II grænsen, hvor de er rigelige, og optræder ofte i små grupper ^2,9 (Figur 2C-D). Andre celletyper, såsom interneuroner og pyramidale celler bør også kunne identificeres.

På dette tidspunkt eksperimenter kan udføres for eksempel ved hjælp af hel-celle patch-clamp at optage membranpotentiale eller membran strøm fra identificerede neuroner og elektriske eller optogenetic metoder til at aktivere synaptiske input til den optagne neuron. Neuron identitet kan efterprøves af de elektrofysiologiske egenskaber registreret neuron og herunder fluorescerende mærker i intracellulære opløsning.

3. Mål placering langs dorso-ventrale akse

3,1 Billede placering af renter og omgivende skive

At bestemme positionen af ​​en RECORDED neuron langs dorsal-ventral akse, først bruge en lav forstørrelse mål at billedet MEC region skive og de omkringliggende områder. Markere placeringen af interesse, for eksempel, herunder elektrode i et billede (figur 3A) eller ved at træde ned på irisblænden at efterlade et lyst cirkel omkring placeringen af interesse i en kopi af billedet. At lokalisere registreringen sted i billedet dubletten kan derefter overlejret på det oprindelige billede af optagelsen beliggenhed og dens omgivelser (figur 3B). Op til 3 separate lav forstørrelse (4x) billeder kan være nødvendigt at dække området fra en ventral optagelse placering til dorsale kant af MEC. Disse billeder kan derefter syet sammen ved hjælp af billed-manipulation software for at tilvejebringe et billede, der afstandsmålinger kan tages fra (figur 3). Yderligere kontrol af neuron identitet og placering kan udføres efter optagelse ved at inkludereinaktive markører såsom biocytin eller Alexa farvestoffer i intracellulære opløsning og derefter bruge passende behandling af vævet efter optagelse ^2.

3,2 Etablere dorsale grænsen til MEC

Den dorsale kant af MEC tilvejebringer en bekvem lokalitet fra at måle dorsal-ventral position. Den ventrale grænse MEC ikke så godt defineret.

Figur 4 illustrerer, hvorledes MEC cellulære landmærker defineret i Nissl farvede skiver med forskellige medial-laterale positioner vist under DIC belysning.

Figur 4 A viser den cirkulære hippocampus (fig. 4 (i)) og mangel på en parasubicular fremspring ind i laget I (fig. 4 (iv)) forbundet med parasagittal skiver indeholdende Lateral entorhinale cortex (LEC).

Figur 4 f.Kr. viser typiske skiver, der indeholder MEC. Den dorsale del af fremtrædende mørke dorsale entorhinale / Parasubicular grænseområdet i DIC belyste skiverne indeholder et område af parasubiculum. Den parasubiculum området tydeligt fremgår af Nissl-farvning i de tilsvarende billeder i søjle (III). Den dorsale kant af MeC (sorte pile 4B og 4C kolonne (iv)) er ventral den gruppe parasubicular celler, der rager langt ud i laget I (røde pile 4B og 4C kolonne (iv)).

Sammenligning af figurerne 4B og 4C søjler (ii) og (iii) viser, at den dorsale kant af MEC i Nissl afsnit svarer til en placering, der er ventral for den dorsale kant af mørke entorhinale / Parasubicular grænseområdet i DIC skive ( sorte pile). Placeringen af ​​grænsen kan estimeres fra DIC billeder og sammenligning med reference billeder (se også ref. 14). Fremtidig validering af dorsale MEC grænsen med molekylære markører vil forbedre nøjagtigheden af ​​dette skøn. Vi bemærker THAt farves henvisning sektioner og sektioner, som behandles for morfologisk identifikation af mærkede neuroner, kan være behæftet med en betydelig svind. Sammenligning af absolutte afstande i forhold til milepæle i DIC og reference sektioner derfor først kræver måling og korrektion for krympning (se fx ref 2).

3,3 Kalibrer og måle afstande

For at lette nem måling af afstand i billeder, bruge den samme lave forstørrelse målsætning om at billedet en henvisning gitter til at etablere en pixel: afstand konvertering. Måle pixelafstand fra den dorsale kant af MEC til placeringen af interesse langs konturen af MEC anvendelse af en grafikprogram og konvertere pixelafstand på afstand i um (figur 5A). Hvis neuroner er fyldt med en markør såsom biocytin, derefter placering af den indspillede neuron kan derefter udvindes ved passende behandling (se f.eks ref 2).

4. Representative Resultater

Figur 5A viser et eksempel lav forstørrelse (4x) sammensat billede af en parasagittal skive efter optagelse, med placeringen af registrerede neuroner oven og måling vejledninger. Optagelser fra de afmærkede dorsale og ventrale stjerneformige celler er vist i figur 5B. Disse optagelser medvirke til at fastslå identiteten af ​​cellerne og illustrere, hvordan elektriske egenskaber af MEC lag II stjerneformige celler adskiller sig på dorsale og ventrale steder.

Figur 1. Fremstillinq af parasagittal skiver. En hel hjerne hviler med dorsalsiden opad på filtrerpapir fugtet med skærende ACSF. B C Hemisected hjernen klar til montering. D monteret halvkugler på limstrimmel parallelt med forkant af vibratome bladet forud for nedsænkning i skære ACSF og udskæring. E Udseende af afsnit med LEC under udskæring procedure efter fjernelse af laterale væv og endnu ikke er tilstrækkeligt mediale en standard parasagittal MEC skive. F udseende "lateral" del af MEC efter fjernelse yderligere 400 um af væv (overfladen er 400 um mediale, der er vist i . (F)) G udseende "medial" del af MEC efter en 400 um parasagittal skive er blevet skåret HI Skematisk af EF henholdsvis indikerer anatomiske landmærker, c:. lillehjernen, L: lateral entorhinal cortex (LEC), m: MedialLink entorhinal cortex (MEC), h: hippocampus, orange: ydre kapsel, blå: corpus callosum, cyan: dentate gyrus, green: CA3 og CA1. Fremkomsten af rostralt grænsen af hippocampus i skiver, der indeholder LEC er konkav (sort pil i H) mens det i skiver, der kun indeholder MEC, kan grænsen være lineær (rød pil i I) eller konkav (rød pil i J). De omtrentlige form af farvede anatomiske pejlemærker blev indhentet fra de anmærkninger i Allen Brain Atlas ( http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html ).

Figur 2. Identifikation MEC lag II-celler under DIC belysning. En Eksempel sammensat billede af en para sagittal hjerne skive ved lav forstørrelse (4x). Separate billeder er blevet tilpasset og blandet til at fjerne distraherende kanter og vignettering. Vigtig milepæl områder h: hippocampus, m:. MEC B Crop fra en individuel lav forstørrelse (4x) billede, der indeholder lag II MEC, synlig som den mørke lodret stribe nær den højre kant C MEC lag II ved høj forstørrelse (. 40x) med DIC belysning. Billedet er en linie og blandet sammensætning af flere billeder. Den tætte centrale 'kolonnen "af celler er Layer II. D Single stor forstørrelse DIC billede, som viser en gruppe af raske formodede stjerneformige celler og interneuroner i lag II. Som vist her, stjerneformige celler ofte forekomme i grupper på grænsen af ​​laget I / II. Pyramidale celler tendens til at være tættere på Layer II / III grænse. De stiplede linjer i AC angiver omfanget af BD hhv. Målestoksforhold: i A og B 500 um, i C og D 100 um.

Figur 3 "src =" / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg "/>
Figur 3. Måling af dorsal-ventral stilling steder af interesse. En Aligned lav forstørrelse (4x) billeder, som omfatter hele dorso-ventrale omfanget af MEC mellem placeringen af interesse (markeret med spidsen af en elektrode), og den mørke entorhinale / Parasubicular grænseområdet lokalitet (anvendt til at etablere den dorsale kant af MEC - se figur 4) B Som i A, men med en overlejret billede med en stoppet ned felt irisblænde (overlejret med reduceret opacitet) i stedet for en elektrode til at markere placeringen af interesse..

Figur 4. Estimering af dorsale kant af MEC fra DIC billeder af parasagittal skiver. AC parasagittal sektioner (lateral til mediale) fra den entorhinale cortex. DIC og Nissl sektioner er fra forskellige mice AC kolonne (i):.. Hele parasagittal skiver (400 um tyk) (justeret og blandede kompositter med lav forstørrelse (4x) billeder) AC kolonne (ii): Nærbillede af entorhinal cortex med karakteristiske mørke entorhinal / Parasubicular grænse region i det øverste område af hvert billede. AC søjle (III) Nissl farvede skiver (40 um tykke) af en anden mus linie med billeder i AC (ii). Den mørkere, tæt lag af celler lag II. Sammenligning af søjler (ii) og (iii) viser, hvordan Nissl farvede celler vises i DIC billeder AC kolonne (iv):. Detalje af Nissl farvede skiver. B og C-søjle (iv) omfatter celler fra parasubiculum (dorsale del af mørke entorhinale / Parasubicular grænseområdet i DIC billeder) og celler fra dorsale MEC. I B (iv) og C (iv) den store dorsale plaster parasubicular celler, som strækker sig dybt ind lag I er let synlig (røde pile). Den ventrale kant disse plastre svarer til den dorsale border af MEC (sorte pile). I A (iv) parasubicular plasteret er fraværende, hvilket indikerer, at skiven er for lateral en standard parasagittal MEC skive præparat. I alle paneler, viser sorte pile den dorsale grænsen til MEC. Grå pile angiver den omtrentlige ventrale kant af MEC.

Figur 5. Repræsentative resultater. En blandet og beskæres del af billedet i figur 3A. Positionerne af en dorsal celle og en ventral celle er angivet ved blå og grønne udfyldte cirkler hhv. Den sorte pil markerer den estimerede dorsale kant af MEC og er forlænget i de dybere lag af den hvide stiplede linie. Den faste hvide streg er en guide viser konturen bane, langs hvilken pixel måling af afstanden fra den dorsale kant af MEC til ventralt placeret cellen blev taget. Målestok: 500 um B Electrop.hysiological spor fra cellerne angivet i A. Fra venstre til højre - under tærskelværdien reaktioner aktuelle trin anvendes til at beregne indgangsmodstand, spiking reaktion på en stor positiv aktuelle trin, spike detaljer.

Discussion

For at lette undersøgelse af MEC kredsløb egenskaber, der følger en dorsal-ventral organisation, vi har beskrevet her i detaljer en fremgangsmåde til fremstilling af en parasagittal skive præparat, der bevarer den dorsale-ventrale omfang MEC.

Kritiske trin

Fjernelse af hjernen fra dyret. Vær særlig omhyggelig med at undgå at lægge pres på hjernen. Dette er mere vigtigt end hurtig fjernelse af hjernen.

Udskæring. Slice bør være limet fast til bunden af holdekammeret. Den vibratome bør have z-akse vibrationer under 2 um, og anvendes med høj amplitude og lav hastighedsindstilling. De optimale indstillinger kan variere mellem modeller og skal etableres ved trial and error.

Overvågning opløsningstemperaturer. Vi finder, at slice kvalitet er følsomt overfor temperaturen under og efter skæring. Outsid e den anbefalede temperatur spænder antallet af sunde neuroner er reduceret, kan neuroner blevet sværere at patch og reaktioner over for synaptisk input kan reduceres.

Billeddannelse. Koehler belysning og centrering af feltet irisblænden er vigtige for visualisering af celler før optagelse.

Fejlfinding

Skiver indeholder få raske celler. Udskift løsninger. Se z-aksen forskydning på vibratome. Kontrollér temperatur på løsninger. Kontroller orientering af skiven, når du skærer.

Neuroner i skive er svære at se. Check Köhler belysningen er korrekt konfigureret. Check mikroskop linser er rene.

Sværhedsgrad danner gigaseals. Check form af optagelse elektroder. Undersøg skive for tegn på celledød, f.eks runde celle former, eller høj kontrast celler.

ve_content "> Billeder af skiven er vanskelige at justere. Sørg for, at skiverne er i fokus at indfange maksimal detaljegrad. For automatisk billedet justering> 40% billede overlap er typisk tilstrækkeligt.

Begrænsninger

En mulig begrænsning af parasagittal skive præparatet er, at meget lange række synaptiske forbindelser i MEC ikke kan løbe direkte parallelt med parasagittal flyet ^{9, 15} og så ikke kan bevares. Opretholde disse forbindelser kan kræve ændring af fremstillingsmetoden for at ændre vinklen af ​​den skive skæres ved enten hemisecting eller montering af hjernehalvdel på vibratome i en vinkel i rostrum-cauda-planet. Lignende betragtninger kan ansøge om bevarelse af andre sammenhænge, ​​for eksempel afferente input fra den mediale septum.

Sammenligning med vandrette MEC skive præparater

1. Nøjagtig måling af dorsal-ventral placering er vigtigtil fastsættelse af kvantitative forhold mellem position langs den dorsale-ventrale aksen og fysiologiske egenskaber. I vandrette skive præparater ^7,8,11,12 er det vanskeligt at fastslå den nøjagtige dorsal-ventral placeringen af udskæringen og dette komplicerer oprettelse af en konsekvent henvisning placering. I modsætning hertil dorsale kant af MEC i parasagittal skive præparatet er nemt at indføre et referencepunkt og kendskab dybden af ​​en neuron i et stykke er unødvendigt at måle dets dorsal-ventral position. Parasagittal skiver derfor i høj grad lette nøjagtig måling af dorsal-ventral sted, så hurtigere og mere præcis undersøgelse af kvantitative relationer mellem dorsal-ventral placering og cellulære og kredsløb egenskaber.
2. Molekylære gradienter er vigtige for topografiske kredsløb organisation i MEC og kan visualiseres under anvendelse af fluorescensemitterende eller andre mærkningsteknikker. I forhold til vandret skiver, hvor the-signal skulle sammenlignes mellem skiver på forskellige dorsal-ventrale steder, det parasagittal forberedelse giver mulighed for nemmere, mere finkornet og mere pålidelig visualisering og kvantificering af dorsal-ventrale molekylære gradienter.
3. Dorsal-ventrale gradienter i synaptisk tilslutning kan spille en vigtig rolle i MEC funktion. Den parasagittal skive præparat kan bevare synaptiske forbindelser mellem dorsale og ventrale områder i MEC, hvilket er vigtigt for at undersøge, hvordan forbindelser varierer inden for og mellem forskellige steder langs dorsal-ventrale akse MEC og opretholdelse kredsløbsintegritet lige ved forskellige dorsal-ventrale steder. Hvis tilslutning varierer væsentligt langs dorsal-ventrale akse, horisontale skiver er mindre tilbøjelige til at også omfatte hele funktionelle mikrokredsløb ved hver ekstrem.

Fremtidig udvikling og applikationer

Viden om de molekylære determinanter forcellulære identitet i MEC vil muliggøre endelig karakterisering af neuronal identitet og tillader mere præcis bestemmelse af dorsal-ventrale placering.

Brug af parasagittal skive forberedelse, kunne topografisk organiseret svarene fra celletype-og sted-specifik aktivitet af flere neuroner observeres samtidigt (for eksempel ved hjælp af spænding følsomme farvestoffer eller calcium imaging) inden for en enkelt skive.

I kombination med optogenetic værktøjer, tillader parasagittal præparatet selektiv aktivering ved forskellige positioner langs den dorsale-ventrale akse. Spørge, hvordan det microcircuitry ved forskellige dorsal-ventrale steder reagerer på rumligt målrettet aktivering kan levere vigtige indsigt i MEC mikrokredsløb funktion.

Vi forventer, at denne forberedelse giver en enkel, robust og standardiseret grundlag for at undersøge dorsal-ventrale gradienter i fysiologiske egenskaber og lette understanding af, hvordan disse gradienter bidrager til de informationsbehandlingssystemer egenskaber MEC.