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Immunology and Infection

फैक्टर मानव प्लाज्मा में वी गतिविधि के मापन एक microplate जमावट परख का उपयोग

Published: September 9, 2012 doi: 10.3791/3822
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science, University of Ontario Institute of Technology, 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology, 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology

Summary

इस अध्ययन के एक उपन्यास microplate परख कि मानव प्लाज्मा में आतंच थक्का गठन है जो पहले नहीं बताया गया है के दौरान FV जमावट गतिविधि उपाय का वर्णन करता है. 405nm पर मानव प्लाज्मा में आतंच थक्का गठन के दौरान लगातार absorbance में बदलने के उपाय के लिए एक गतिज microplate पाठक विधि का उपयोग करता है.

Protocol

1. FV-कमी मानव प्लाज्मा की तैयारी

  1. इस विधि मूल ब्लूम एट अल 4 द्वारा वर्णित प्रक्रिया के एक संशोधन है.
  2. कि किसी भी दवा नहीं ले जा रहा है - एक सहमति स्वस्थ वयस्क (50 वर्ष के पुरुष या महिला, 18 साल की उम्र) स्वयंसेवक से पूरे मानव रक्त से प्राप्त करते हैं. लाटेकस दस्ताने और प्रक्रिया के दौरान एक प्रयोगशाला कोट पहनें.
  3. 3.2% (w / v) आसुत जल में trisodium साइट्रेट के 100 मिलीलीटर तैयार. अलग 60 मिलीलीटर सीरिंज में इस समाधान का 6.0 मिलीलीटर लोड. निराशाजनक सवार द्वारा हवा 6.0 मिलीलीटर निशान सिरिंज पर सावधानी से निकालें.
  4. एक शराब झाड़ू का उपयोग करने के लिए bicep और प्रकोष्ठ के बीच प्रकोष्ठीय शिरा के क्षेत्र को साफ करने के लिए. 20 गेज तितली एक 3 मिलीलीटर सिरिंज तंत्र कनेक्ट. प्रकोष्ठीय शिरा में तितली सुई डालें और सवार पर धीरे आकर्षित जब तक रक्त के 3 मिलीलीटर निशान को भरता है. रक्त के साथ सिरिंज त्यागें. इस कदम के लिए किसी भी ऊतक क्षतिग्रस्त endothelium से सुई में जारी कारक को दूर करने के लिए किया जाता हैचोट साइट है कि जमावट प्रक्रिया को सक्रिय करने और FV कमी प्लाज्मा की तैयारी के साथ हस्तक्षेप हो सकता है.
  5. 60 मिलीलीटर सिरिंज 'लोड' के साथ 6.0 मिलीलीटर trisodium साइट्रेट कनेक्ट तितली सुई और सवार पर धीरे आकर्षित जब तक रक्त सिरिंज पर 60 मिलीलीटर निशान तक पहुँच जाता है. (अंतिम साइट्रेट एकाग्रता 10.9mM).
  6. तितली सुई से सिरिंज निकालें और धीरे सिरिंज मिश्रण जबकि सिरिंज आउटलेट पर एक दस्ताने उंगली या अंगूठे रखने.
  7. 60 मिलीलीटर 3.2% trisodium साइट्रेट के 6.0 मिलीग्राम के रूप में ऊपर वर्णित के साथ भरा प्रत्येक सीरिंज में रक्त ड्राइंग जारी. एक centrifugation के बाद और FV की कमी प्लाज्मा के 50 μl नमूना प्रति microplate परख में आवश्यक है कि प्लाज्मा साइट्रेटेड ब्लड मात्रा का लगभग 50% की वसूली के रूप में आशा करनी चाहिए. हमारी प्रयोगशाला नियमित एक 3.2% trisodium साइट्रेट / सिरिंज के 6.0 मिलीलीटर के साथ 5-7 x 60 मिलीग्राम प्रत्येक सीरिंज का उपयोग कर समय पर 300-420 मिलीलीटर साइट्रेटेड ब्लड प्रक्रियाओं. यह लगभग 3,000 माइक्रो के लिए पर्याप्त प्लाज्मा FV-कमी हैथाली assays (नीचे देखें).
  8. स्वयंसेवक हाथ से तितली सुई निकालें और नस पंचर साइट पर 1.0 मिनट के लिए एक बाँझ धुंध पैड प्रेस. कवर एक बाँझ पट्टी साथ नस पंचर साइट.
  9. XG +३,३०० में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए साइट्रेटेड ब्लड अपकेंद्रित्र. हलचल बार के साथ एक प्लास्टिक बीकर ख्याल रख रही एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करने के लिए कम लाल और सफेद रक्त कोशिका परत को परेशान नहीं करने के लिए ऊपरी पीला प्लाज्मा परत पुनर्प्राप्त.
  10. प्लाज्मा मिलीलीटर में उपाय मात्रा और बर्फ पर भविष्य prothrombin थक्का (पीटी) समय परीक्षण (नीचे देखें) के लिए EDTA अलावा पहले प्लाज्मा के 100 μl बरकरार रहती है.
  11. धीरे धीरे कमरे के तापमान पर कोमल सरगर्मी 5mm को प्राप्त करने के साथ citrated प्लाज्मा ठोस EDTA (अंतिम एकाग्रता). एक बार EDTA को भंग कर दिया है, कोमल सरगर्मी के साथ 1.0M NaOH के dropwise अलावा द्वारा 7.0 पीएच को समायोजित.
  12. सरन लपेटें और सेते साथ 8-10 घंटे के लिए 37 में सरगर्मी के बिना कवर बीकर डिग्री सेल्सियस
  13. हर 2 घंटा, 100 के μl ठीकबर्फ पर EDTA प्लाज्मा और इलाज EDTA के साथ ऊष्मायन के समय में पीटी का निर्धारण और प्लाज्मा के पीटी EDTA अलावा (ऊपर देखें) के लिए पहले की तुलना.
  14. पीटी determinations के लिए, जगह हटाने योग्य 8 प्लास्टिक टेम्पलेट और microplate रीडर में धारक डालने में अच्छी तरह से immunomodule स्ट्रिप्स.
  15. Microplate रीडर में ओरिएंट immunomodule स्ट्रिप्स: खाली, खाली नमूना, खाली है, खाली नमूना, खाली है, और बाएँ से टेम्पलेट धारक में सही करने के लिए खाली नमूना युक्त स्ट्रिप्स पड़ोसी से प्रकाश तितर बितर हस्तक्षेप कम से कम. इसके अलावा, केवल ऊपर से 2-7 कुओं प्रत्येक 8 immunomodule पट्टी में नीचे प्लास्टिक टेम्पलेट धारक के किनारों से प्रकाश तितर बितर हस्तक्षेप कम से कम उपयोग करें.
  16. FV microplate परख कम से कम 12 एक साथ अलग अलग नमूने (6 2 immunomodule स्ट्रिप्स से अधिक immunomodule पट्टी नमूने के अनुसार) में आतंच थक्का गठन को मापने के लिए सक्षम है.
  17. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, HBS (20mm HEPES, 150mm NaCl, पीएच 7.4) के 50 μl जोड़नेप्रत्येक microplate अच्छी तरह के लिए नमूने के प्रत्येक assayed किया जाना है. एक एकल विंदुक का प्रयोग, EDTA के अलावा पहले या EDTA जोड़ने के लिए अलग microplate कुओं के बाद विभिन्न ऊष्मायन समय पर सामान्य मानव जमा (संदर्भ NHP) प्लाज्मा या प्लाज्मा के 50 μl जोड़ें.
  18. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, प्लाज्मा सभी microplate कुओं के साथ 50 μl thromboplastin (तैयारी विधि के लिए नीचे देखें) के लिए assayed जोड़ने. 25 डिग्री सेल्सियस पर microplate रीडर में 1 मिनट और microplate पाठक कार्यक्रम 15-25 सेकंड 1 मिनट ऊष्मायन के दौरान प्लेट हिला के लिए सेते हैं.
  19. Microplate रीडर, अभिगम SoftMax प्रो सॉफ्टवेयर microplate आवेदन के साथ interfaced कंप्यूटर का उपयोग करना. Absorbance, 405nm तरंगदैर्ध्य, काइनेटिक तापमान के लिए मोड 25 डिग्री सेल्सियस, और कार्यक्रम microplate पाठक 5 सेकंड के लिए मिलाने के लिए, और 405nm पर हर 5 सेकंड 6 मिनट के लिए absorbance पढ़ने. पाठक सेट
  20. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, कैल्शियम क्लोराइड (आसुत जल में 25mm की 50 μl, 2.1mm finaएल एकाग्रता) microplate कुओं की सभी के लिए, 15 सेकंड प्रतीक्षा करें, और microplate SoftMax प्रो मेनू पर 'आरंभ' आइकन प्रेस करने के लिए परख शुरू.
  21. प्रो SoftMax में Absorbance बनाम समय की प्रोफाइल से अंक निर्धारित समय के रूप में 405nm से कम आधा absorbance में अधिक से अधिक वृद्धि हुई है (sigmoidal Absorbance समय वक्र बनाम thromboplastin और कैल्शियम क्लोराइड इसके अलावा के बाद उत्पादन के मध्य बिंदु नीचे देखें पहुँचने के लिए, चित्रा 1).
  22. चित्रा 2A के रूप में नीचे सचित्र प्रवेश थक्का (सेकंड) बनाम प्रवेश FV गतिविधि समय (इकाइयों / मिलीलीटर) से FV गतिविधि 1-चरण की गणना. Quantitation प्रयोजनों के लिए, FV गतिविधि की 1Unit 1.0 मिलीलीटर NHP में गतिविधि पूर्व जोड़ा थ्रोम्बिन (नीचे देखें, 1 चरण FV और 2 चरण microplate जमावट परख के साथ मानव प्लाज्मा नमूनों परख) के साथ जानबूझकर सक्रियण के उपहार के रूप में परिभाषित किया गया है.
  23. 20mm कोमल सरगर्मी के साथ आसुत जल में 0.15M NaCl युक्त HEPES के 4.0l तैयार करो. 7.4 धीमी dropw साथ पीएच समायोजित5.0M NaOH के ise अलावा (HBS, पीएच 7.4).
  24. डायलिसिस टयूबिंग की एक पर्याप्त लंबाई प्राप्त और आसुत जल के साथ अच्छी तरह कुल्ला. टयूबिंग की एक अंत में एक गाँठ बाँध. एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ स्थानांतरण EDTA डायलिसिस टयूबिंग के लिए प्लाज्मा का इलाज, हवा निकालने के लिए, और टयूबिंग के दूसरे छोर में एक गाँठ बाँध.
  25. ध्यान HBS में कोमल सरगर्मी के साथ टयूबिंग में EDTA इलाज प्लाज्मा लटका. सरन लपेटें के साथ कवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल सरगर्मी के साथ 14 16h dialyze
  26. ध्यान से 3.0 मिलीलीटर aliquots में 15.0 मिलीलीटर पेंच छाया ट्यूबों EDTA-treated/dialyzed प्लाज्मा और हटाने के 'अंतिम' बर्फ पर प्लाज्मा की कमी FV पीटी परख के लिए 100 μl बनाए रखने. -80 डिग्री सेल्सियस तक प्लाज्मा FV-कमी स्टोर. ऊपर वर्णित शर्तों के तहत, 10-15 सेकंड से EDTA के बाद इसके अलावा EDTA 90-100 सेकंड 8-10 घंटे के अलावा पहले अंक वृद्धि हुई है. FV की कमी इस विधि द्वारा तैयार प्लाज्मा नियमित रूप से शुरू करने में सक्रिय FV वर्तमान के 0.1% की तुलना में कम होता हैताजा मानव प्लाज्मा.

2. Thromboplastin की तैयारी

  1. डायलिसिस इस अभिकर्मक से किसी भी कैल्शियम को हटाने के क्रम में ठीक कैल्शियम क्लोराइड इसके अलावा जमावट की प्रक्रिया आरंभ करने के समय से समय आतंच थक्का गठन की अनुमति की आवश्यकता है.
  2. आसुत जल में कोमल सरगर्मी के साथ एक प्लास्टिक बीकर में 100 मिलीग्राम और 4.0l 20mm HEPES और 0.15M NaCl तैयार करो. 7.4 5.0M NaOH (HBS, पीएच 7.4) की धीमी dropwise अलावा के साथ पीएच को समायोजित करें.
  3. Thromboplastin अभिकर्मक की शीशी में से प्रत्येक के लिए HBS, पीएच 7.4 की 6.0 मिलीलीटर जोड़ें, ढक्कन की जगह, और धीरे हिला भंग करने के. छाया शीशियों में कमरे के तापमान पर 15 मिनट सूखे सामग्री भंग के लिए अभिकर्मक सेते हैं. धीरे से मिलाने के लिए पूरी तरह से भंग है.
  4. डायलिसिस टयूबिंग की एक पर्याप्त लंबाई कट, आसुत जल के साथ अच्छी तरह कुल्ला, और टयूबिंग की एक गांठ के साथ एक अंत टाई. डायलिसिस टयूबिंग thromboplastin स्थानांतरण, हवा निकालने के लिए, और टयूबिंग की एक गांठ के साथ दूसरे छोर टाई.
  5. Carefully HBS, 7.4 पीएच के 4.0l में डायलिसिस टयूबिंग रखता है और धीरे से 4 डिग्री सेल्सियस सरन लपेटें के साथ कवर 14-16 घंटे के लिए हलचल.
  6. -80 में 15 मिलीलीटर पेंच ढकी ट्यूब और स्टोर करने के लिए 3.0 dialyzed thromboplastin मिलीलीटर aliquots स्थानांतरण ° C तक इस्तेमाल किया.

3. की तैयारी FV 1 चरण Microplate जमावट परख गतिविधि मानक घटता

  1. FV-कमी प्लाज्मा, NHP, और thromboplastin पिघलना को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए. धीरे FV-कमी प्लाज्मा और thromboplastin स्वतंत्र रूप से मिश्रण, प्लास्टिक ट्रे धोने अलग हस्तांतरण, और बर्फ पर सेते हैं. धीरे मिश्रण के बाद बर्फ पर NHP स्टोर. स्टोर कमरे के तापमान पर एक अलग कपड़े धोने की ट्रे में कैल्शियम क्लोराइड (25mm आसुत जल में).
  2. , 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 -, 256 - 200 μl NHP के 0 से 2 गुना धारावाहिक dilutions की प्रत्येक तैयार, HBS में 512 गुना, पीएच 7.4 1.5 का उपयोग कर मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों. अच्छी तरह से भंवर और बर्फ पर सेते हैं.
  3. पी में हटाये 8 अच्छी तरह immunomodule स्ट्रिप्स प्लेसlastic टेम्पलेट और microplate रीडर में धारक डालने.
  4. Microplate रीडर में ओरिएंट immunomodule स्ट्रिप्स: खाली, खाली नमूना, खाली है, खाली नमूना, खाली है, और बाएँ से टेम्पलेट धारक में सही करने के लिए खाली नमूना युक्त स्ट्रिप्स पड़ोसी से प्रकाश तितर बितर हस्तक्षेप कम से कम. इसके अलावा, केवल ऊपर से 2-7 कुओं प्रत्येक 8 immunomodule पट्टी में नीचे प्लास्टिक टेम्पलेट धारक के किनारों से प्रकाश तितर बितर हस्तक्षेप कम से कम उपयोग करें.
  5. FV microplate परख कम से कम 12 एक साथ अलग अलग नमूने (6 2 immunomodule स्ट्रिप्स से अधिक immunomodule पट्टी नमूने के अनुसार) में आतंच थक्का गठन को मापने के लिए सक्षम है.
  6. Microplate रीडर और अभिगम SoftMax प्रो microplate अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर पर मुड़ें.
  7. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, सभी नमूना microplate कुओं FV की कमी प्लाज्मा (50 μl) के एक साथ जोड़ कर. एक एकल विंदुक का प्रयोग करें, NHP के 10 धारावाहिक dilutions ऊपर तैयार microplate कुओं अलग 50 μl जोड़ें.
  8. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, सभी नमूना कुओं thromboplastin (50 μl) जोड़ने. 1 मिनट और कार्यक्रम microplate पाठक के लिए 25 में microplate पाठक ° सी में सेते 15-25 सेकंड 1 मिनट ऊष्मायन के दौरान प्लेट हिला.
  9. Microplate रीडर, अभिगम SoftMax प्रो सॉफ्टवेयर microplate आवेदन के साथ interfaced कंप्यूटर का उपयोग करना. Absorbance, 405nm तरंगदैर्ध्य को, काइनेटिक, 25 के लिए तापमान ° सी, और कार्यक्रम microplate पाठक कैल्शियम क्लोराइड के बाद इसके अलावा पहले 5 सेकंड के लिए हिला, और 6 उसके बाद मिनट के लिए उपाय absorbance 405nm हर 5 सेकंड के लिए मोड सेट करने के लिए पाठक 5 सेकंड मिलाते अंतराल की गणना थक्का बार में शामिल नहीं है (देखें नीचे) है.
  10. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, कैल्शियम क्लोराइड (आसुत जल में 25mm की 50 μl, अंतिम एकाग्रता 3.5mm) जोड़ने के सभी नमूना microplate कुओं, कंप्यूटर से शुरू करने के लिए के लिए 15 सेकंड, प्रेस microplate आवेदन में SoftMax प्रो में 'आरंभ' आइकन इंतजार परख.
  11. टीवह थक्का बार सेकंड में समय 405nm thromboplastin और कैल्शियम क्लोराइड इसके अलावा के बाद न्यूनतम और अधिकतम absorbance के बीच मध्य तक पहुँचने के रूप में गणना कर रहे हैं.
  12. थक्का गठन के प्रारंभिक दर 405nm पर absorbance में वृद्धि की दर (mUnits / मिनट) कि Absorbance बनाम समय वक्र के रैखिक भाग में 1 5 थक्का गठन के समय अंक धरना के रूप में गणना कर रहे हैं.
  13. थक्का गठन की हद तक थक्का गठन घटना के दौरान हासिल 405nm (यूनिट) में अधिकतम और न्यूनतम absorbance के बीच अंतर के रूप में गणना की गई.

4. 1 चरण FV और 2 चरण Microplate जमावट परख के साथ मानव प्लाज्मा नमूनों की परख

  1. FV प्लाज्मा की कमी, NHP, नमूना plasmas, और thromboplastin पिघलना को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए. धीरे FV-कमी प्लाज्मा और thromboplastin स्वतंत्र रूप से मिश्रण, प्लास्टिक एलिसा धोने ट्रे अलग हस्तांतरण, और बर्फ पर सेते हैं. बर्फ पर NHP और नमूना plasmas स्टोरधीरे मिश्रण के बाद. स्टोर कमरे के तापमान पर एक अलग एलिसा वाशिंग ट्रे में कैल्शियम क्लोराइड (25mm आसुत जल में).
  2. 200 μl NHP और नमूना plasmas HBS, पीएच 7.4 में 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब का उपयोग 40 गुना dilutions के प्रत्येक तैयार. अच्छी तरह से भंवर और बर्फ पर सेते हैं.
  3. प्लास्टिक टेम्पलेट धारक में हटाये 8 अच्छी तरह immunomodule स्ट्रिप्स डालें और microplate पाठक में डालने के.
  4. वैकल्पिक खाली है, खाली, नमूना, खाली है, खाली नमूना, खाली है, और खाली छोड़ दिया से टेम्पलेट धारक में सही नमूना युक्त स्ट्रिप्स पड़ोसी से प्रकाश तितर बितर हस्तक्षेप को कम करने के लिए immunomodule स्ट्रिप्स. केवल ऊपर से 2-7 कुओं प्रत्येक immunomodule पट्टी में नीचे प्लास्टिक टेम्पलेट धारक के किनारों से प्रकाश तितर बितर हस्तक्षेप कम से कम प्रयोग करें.
  5. Microplate रीडर और अभिगम SoftMax प्रो microplate अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर पर मुड़ें.
  6. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, सभी नमूना microplate कुओं FV की कमी प्लाज्मा (50 μl) जोड़ने. एक singl का उपयोगई विंदुक, 40 गुना पतला NHP या नमूना ऊपर तैयार microplate कुओं अलग plasmas के 50 μl जोड़ें.
  7. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, सभी नमूना कुओं thromboplastin (50 μl) जोड़ने. 1 मिनट और कार्यक्रम microplate पाठक के लिए 25 में microplate पाठक ° सी में सेते 15-25 सेकंड 1 मिनट ऊष्मायन के दौरान प्लेट हिला.
  8. Microplate रीडर, अभिगम SoftMax प्रो सॉफ्टवेयर microplate आवेदन के साथ interfaced कंप्यूटर का उपयोग करना. Absorbance, 405nm तरंगदैर्ध्य को, काइनेटिक, 25 के लिए तापमान ° सी, और कार्यक्रम microplate पाठक कैल्शियम क्लोराइड के बाद इसके अलावा पहले 5 सेकंड के लिए हिला, और 6 उसके बाद मिनट के लिए उपाय absorbance 405nm हर 5 सेकंड के लिए मोड सेट करने के लिए पाठक 5 सेकंड मिलाते अंतराल की गणना थक्का बार में शामिल नहीं है (देखें नीचे) है.
  9. सभी नमूना microplate कुओं और तुरंत जनसंपर्क, एक multichannel विंदुक का प्रयोग, कैल्शियम क्लोराइड (6.25mM अंतिम एकाग्रता आसुत जल में 25mm की 50 μl) जोड़नेSoftMax प्रो में कंप्यूटर से microplate आवेदन को परख शुरू में 'आरंभ' आइकन ईएसएस.
  10. चलाने के अंत में, समय, प्रारंभिक दर और 40 गुना पतला और SoftMax प्रो में absorbance बनाम समय प्रोफाइल से NHP नमूना plasmas के लिए थक्का गठन की हद तक निर्धारित करते हैं.
  11. खाते में 40 गुना कमजोर पड़ने ले रहा है, प्रत्येक नमूना के लिए थक्का समय का उपयोग करने के लिए इकाइयों / मिलीलीटर से प्रवेश थक्का समय बनाम प्रवेश FV गतिविधि (2A चित्रा) की गतिविधि 1 चरण मानक वक्र FV FV गतिविधि की गणना. यह FV-1 मंच या थ्रोम्बिन द्वारा 'जानबूझकर' सक्रियण के बिना गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है.
  12. चूंकि FV थ्रोम्बिन के साथ सक्रिय cofactor को सक्रिय है, 1 FVA, थ्रोम्बिन के साथ इसके अलावा ऊष्मायन के बाद एक दूसरे परख सही एक प्लाज्मा नमूना के FV गतिविधि 2 चरण (जोडी थ्रोम्बिन 'जानबूझकर' सक्रियण के साथ) को मापने के लिए महत्वपूर्ण है.
  13. FV परख दो चरण के लिए, 18 एक थ्रोम्बिन शुद्ध 200-300 μl तैयारHBS, पीएच 7.4 में टी 100nm और बर्फ पर सेते हैं. प्रत्येक नमूने के लिए प्लाज्मा पतला थ्रोम्बिन के 10 μl का उपयोग करने के लिए FV परख 2 चरण के साथ assayed योजना.
  14. HBS, 7.4 पीएच के 170 μl 2.8mm कैल्शियम क्लोराइड युक्त के साथ 100 गुना 40 गुना से ऊपर NHP और नमूना plasmas के 120 μl पतला. प्रत्येक नमूने के 10 μl थ्रोम्बिन (10nm अंतिम एकाग्रता) जोड़ें. भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  15. 500 गुना HBS, 7.4 पीएच के 400 μl जोड़ने और अच्छी तरह से भंवर, परख 1 चरण microplate परख FV में प्रत्येक प्लाज्मा नमूना के 50 μl के रूप में ऊपर वर्णित NHP और नमूना plasmas पतला.
  16. NHP और प्रत्येक प्लाज्मा SoftMax प्रो में Absorbance बनाम समय प्रोफाइल से assayed नमूना के लिए थक्का समय का निर्धारण करते हैं. प्रवेश थक्का समय बनाम प्रवेश FV गतिविधि के खाते में 500 गुना कमजोर पड़ने ले रहा है, प्रत्येक नमूना के लिए थक्का समय का उपयोग करने के लिए FV FV से गतिविधि 2 चरण की गणना 1 चरण मानक वक्र (2A चित्रा).
  17. कुल FV गतिविधियोंFV गतिविधि एक चरण - फिर ty FV दो चरण गतिविधि के रूप में गणना की जा सकता है.

Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम FV की तैयारी एक चरण microplate जमावट परख गतिविधि मानक घटता -

Microplate रीडर द्वारा उत्पन्न समय पर FV परख में आतंच थक्का गठन के एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 1 में सचित्र है. FV परख सही समय, प्रारंभिक दर और आतंच थक्का गठन की हद उपाय. कुओं की परख पूरा होने पर निरीक्षण की पुष्टि की है कि थक्का गठन हुआ. शुरू करने से पहले absorbance और thromboplastin और कैल्शियम क्लोराइड इसके अलावा के बाद अधिक से अधिक absorbance के बीच 0.45 इकाइयों - सभी प्रतिक्रियाओं absorbance में एक सामान्य परिवर्तन के साथ लगभग थक्का गठन के एक ही 405nm 0.35 हद तक पहुंच गया. FV के प्रतिनिधि उदाहरण 1 चरण लॉग थक्का समय की गतिविधि मानक curves (सेकंड में) बनाम प्रवेश FV गतिविधि (इकाइयों / मिलीलीटर) और थक्का गठन की प्रारंभिक दर प्रवेश है (/ mUnits मिनट में) बनाम प्रवेश FV गतिविधि (इकाइयों / मिलीलीटर NHP के धारावाहिक dilutions के लिए) में दिखाया गया है चित्रा 2B क्रमशः. FV बनाम लॉग - प्रवेश थक्का समय की साजिश फिटिंग 1 गतिविधि रेखीय प्रतीपगमन विश्लेषण के बाद इन चर के बीच एक मजबूत संबंध का संकेत (चित्रा 2A, आर 2 = 0.980). लॉग - प्रवेश FV गतिविधि बनाम थक्का गठन की प्रारंभिक दर की साजिश फिटिंग भी रेखीय प्रतीपगमन विश्लेषण के बाद इन चर के बीच एक मजबूत संबंध का संकेत (चित्रा 2B, आर 2 = 0.983). दोनों प्रवेश थक्का समय के संबंध और बनाम थक्का गठन प्रवेश FV गतिविधि की प्रारंभिक दर प्रवेश रैखिक बने रहे के लिए NHP 512 गुना तक पतला. चूंकि FV 12 40nm लगभग 16 में NHP में circulates, microplate परख NHP में 24-80pM FV लगभग के प्रति संवेदनशील है. यह देखते हुए कि लिपिड के FVA - FXa prothrombinase में बातचीत की लगातार पृथक्करण 1nm लगभग 17 है, FV microplate परख physiologically प्रासंगिक FV स्तरों के माप के लिए पूरी तरह उपयुक्त हैटी prothrombinase में FVA समारोह के लिए एनएम रेंज.

FV microplate परख का उपयोग करना है, यह भी निर्धारित किया गया था के कि FV 1 चरण 15 स्वस्थ नियंत्रण plasmas के गतिविधि परख (पुरुष और महिला, 18-20yrs आयु) में FV गतिविधि के सामान्य श्रेणी (± मानक विचलन, रेंज): 0.96 ± 0.14U/ml, 0.68-1.11U/ml. यह सामान्य स्वस्थ FV गतिविधि और रेंज (0.66-1.14U/ml) कटलर एट अल द्वारा रिपोर्ट के साथ अच्छी तरह से सहमत हैं. FV के लिए एक मंच गतिविधि एक स्वचालित 7 विश्लेषक के साथ निर्धारित है. हद तक, समय के अंतर परख परिवर्तनशीलता और FV 8 अलग अलग दिनों पर 6 कुओं में 1-मंच परख में थक्का गठन के प्रारंभिक दर 3.4%, 4.4%, और 3.1%, क्रमशः था. समय की परिवर्तनशीलता हद तक, अंतर - परख, और FV 8 8 अलग अलग दिनों पर विभिन्न प्रयोगों के 6 कुओं में 1-मंच परख में थक्का गठन की प्रारंभिक दर 7.1%, 7.8%, और 9.2%, क्रमशः था. इस प्रकार, इन तीन measu के अंतर और अंतर - परख परिवर्तनशीलतालाल चर के भीतर और कई नमूने के microplate एक साथ परख के बीच (12) मजबूत परख प्रदर्शन के लिए एक कम और स्वीकार्य स्तर पर था.

प्रतिनिधि परिणाम - 1 चरण FV और 2 चरण microplate जमावट परख के साथ मानव प्लाज्मा नमूनों की परख

प्रवेश थक्का समय बनाम प्रवेश FV गतिविधि (2A चित्रा) के मानक वक्र NHP और 9 डीआईसी रोगी plasmas में FV गतिविधि जो जोड़ा थ्रोम्बिन (FV गतिविधि 1-चरण) के साथ जानबूझकर सक्रिय थे या जानबूझकर के साथ सक्रिय रहे थे को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था थ्रोम्बिन (FV गतिविधि 2 चरण) और परिणाम तालिका 1 में दिखाया जाता है. सभी 9 डीआईसी रोगी plasmas FV एक मंच गतिविधियों और थक्का गठन के प्रारंभिक दर है कि औसत पर कम थे, 54% और 18%, क्रमशः NHP से, का प्रदर्शन. डीआईसी रोगियों में FV परख 1-चरण में थक्का गठन के विस्तार NHP से काफी हद तक अलग नहीं थे, और औसत पर NHP से 13% से वृद्धि हुई है.

थ्रोम्बिन साथ NHP के सक्रियकरण FV में लगभग 8 गुना वृद्धि उत्पन्न FV गतिविधि एक मंच (1 टेबल) के ऊपर 2 चरण गतिविधि. यह इंगित करता है कि NHP में FV अपने unactivated रूप में मुख्य रूप से उपस्थित थे और पहले की रिपोर्ट पुस्तिका झुकाव ट्यूब FV 3 assays, 4 और स्वचालित FV assays 5-7 का उपयोग कर परिणाम के साथ सहमत हैं. 2 चरण FV और कुल गतिविधि भी औसत पर डीआईसी रोगियों में कम थे, 44% और 42%, क्रमशः NHP से. डीआईसी रोगियों में 2 चरण परख FV में थक्का गठन की प्रारंभिक दरें और विस्तार NHP से काफी अलग नहीं थे, और औसत पर लगभग 9% और 4%, क्रमशः, उस से NHP के साथ मनाया, विविध. इन परिणामों से संकेत दिया कि डीआईसी रोगी plasmas में NHP, FV FV के साथ तुलना में एक लंबे समय में हुई है और आतंच थक्का गठन की दर में कमी और रोगी FV औसत पर, के रूप में अच्छी तरह से थ्रोम्बिन के साथ सक्रिय करने के रूप में केवल 56% थी.

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चित्रा 1 सामान्य जमा मानव संदर्भ गतिज microplate FV 1 चरण जमावट परख के साथ मापा प्लाज्मा में थक्का गठन. आतंच थक्का गठन NHP में लगातार 405nm एक गतिज microplate पाठक का उपयोग पर नजर रखी थी. साजिश 32 गुना पतला NHP, FV-कमी प्लाज्मा, thromboplastin, और एक अच्छी तरह से microplate में कैल्शियम क्लोराइड के एक 6 मिनट प्रतिक्रिया के microplate पाठक उत्पादन है. ऊर्ध्वाधर अक्ष 405nm है कि प्लाज्मा में आतंच गठन के एक परिणाम के रूप में हुई absorbance में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है. आतंच गठन के समय absorbance में आधे से अधिक से अधिक वृद्धि हुई है या वक्र (36.40 सेकंड) के मध्य तक पहुंचने में समय के रूप में परिभाषित किया गया था. थक्का गठन के प्रारंभिक दर 405nm पर 1 5 वक्र (611.88 mUnits / मिनट) के absorbance भाग के रैखिक वृद्धि के समय अंक पर absorbance के परिवर्तन की दर के रूप में परिभाषित किया गया था. पूर्वथक्का गठन के तम्बू 405 एनएम (0.35 यूनिट) में अधिकतम और न्यूनतम absorbance के बीच अंतर के रूप में परिभाषित किया गया था.

चित्रा 2
चित्रा 2 समय और थक्का गठन बनाम सामान्य जमा मानव संदर्भ प्लाज्मा में फैक्टर वी गतिविधि FV 1 चरण microplate परख का उपयोग कर के प्रारंभिक दर के मानक घटता. NHP serially (0 HBS में 512 गुना) पतला था और 1 चरण microplate परख FV साथ assayed प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में. समय और थक्का गठन बनाम FV में FV गतिविधि 1 चरण microplate परख की प्रारंभिक दर के प्रवेश प्रवेश भूखंडों पैनलों में डेटा के ए और बी, क्रमशः रेखीय प्रतिगमन मॉडलिंग के बाद दिखाए जाते हैं.

1 चरण परख प्रारंभिक दर (mUnits / मिनट)
नमूना एक मंच परख गतिविधि (इकाइयों / मिलीलीटर) एक मंच परख का विस्तार (यूनिट) दो चरण परख गतिविधि (इकाइयों / मिलीलीटर) दो चरण परख का विस्तार (यूनिट) 2 चरण परख प्रारंभिक दर (mUnits / मिनट) कुल गतिविधि (इकाइयों / मिलीलीटर)
NHP 1.02 0.363 744.96 7.93 0.433 375.84 6.91
1 रोगी 0.36 0.404 583.80 3.84 0.432 249.96 3.48
2 रोगी 0.67 0.416 704.04 5.28 0.469 323.16 4.61
0.31 0.435 562.08 3.92 0.453 294.96 3.61
4 रोगी 0.39 0.435 617.04 4.14 0.462 372.60 3.75
5 रोगी 0.73 0.401 641.40 5.91 0.433 354.24 5.18
6 रोगी 0.45 0.403 600.72 4.16 0.445 393.96 3.71
7 रोगी 0.49 0.395 575.40 4.89 0.449 357.48 4.40
8 रोगी 0.19 0.448 489.00 2.89 0.450 330.48 2.70
9 रोगी 0.64 0.423 699.48 5.11 0.455 417.24 4.47

टेबल NHP 1 और 9 रोगियों है कि फैलाया intravascular जमावट (डीआईसी) विकसित में FV गतिविधि 1 चरण FV, 2 मंच, और NHP और 9 डीआईसी रोगी plasmas में कुल गतिविधि 1 चरण FV microplate परख मानक से निर्धारित किया गया है FV गतिविधि (2A चित्रा) बनाम थक्का गठन के समय की अवस्था और इकाइयों / मिलीलीटर में दिया जाता है. प्रारंभिक (1 पाँच mUnits / मिनट में समय अंक पर A405nm में वृद्धि की प्रारंभिक दर) दरों में और विस्तार (अधिकतम A405nm न्यूनतम A401 FV में थक्का गठन के) 5nm और 2 चरण microplate परख भी दिखाए जाते हैं.

Discussion

गतिज microplate परख विधि एक उपन्यास, मानव प्लाज्मा के नमूने जो (FV परख 1-चरण) या नहीं में FV जमावट गतिविधि की माप के लिए तेजी से, सस्ती और सुविधाजनक तकनीक के विकास की रूपरेखा जानबूझकर किया गया है साथ जोड़ा थ्रोम्बिन (FV सक्रिय दो चरण) परख. परख गतिज microplate पाठक का इस्तेमाल करता है और सभी सामग्री और अभिकर्मकों की आवश्यकता है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं या घर में किया जा सकता है. परख लगातार 405nm पर आतंच थक्का गठन के दौरान प्लाज्मा के प्रकाश तितर बितर में परिवर्तन पर नज़र रखता है. microplate परख छोटे प्लाज्मा नमूना संस्करणों (μl) का उपयोग करने का फायदा है और एक साथ एकाधिक नमूने (12) के विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है. ये परख विशेषताओं फायदेमंद हैं जब महंगे उपकरण और अभिकर्मकों (स्वचालित analyzers और फैक्टर कमी plasmas) का उपयोग किया जाता है, केवल छोटा सा नमूना मात्रा उपलब्ध हैं (रोगी plasmas) या FV शुद्धि च के दौरान नमूनों की एक बड़ी संख्या (विश्लेषणरॉम प्लाज्मा).

FV microplate परख जोड़ा लाभ है कि यह सुविधाजनक है, तेज है, और अलगाव और आवश्यक घटक घटकों के शोधन की आवश्यकता नहीं है. पुस्तिका झुकाव ट्यूब 3, 4 और स्वचालित 5-7 FV assays कि सूचना दी गई है के साथ तुलना में, FV microplate परख थक्का बार की तुलना उपयोगी रेंज (25-75 सेकंड) और नमूना में इसी FV स्तर (.5-0.005 इकाइयों / एमएल), और / संवेदनशीलता का पता लगाने सीमा (20-80pM). पुस्तिका झुकाव ट्यूब FV assays जो थक्का गठन 3, 4 के एक व्यक्तिपरक दृश्य मूल्यांकन से पीड़ित के साथ तुलना में, FV microplate परख थक्का समय के उद्देश्य और मात्रात्मक माप, प्रारंभिक दर, और आतंच थक्का गठन की हद तक परमिट. स्वचालित FV assays जो महंगी analyzers और अभिकर्मकों 5-7 की आवश्यकता से पीड़ित के साथ तुलना में, FV microplate परख अभिकर्मकों और सामग्री सस्ती कर रहे हैं और सभी आवश्यक सामग्री purcha हो सकता हैव्यावसायिक तौर पर sed या घर में बनाया. मैनुअल झुकाव ट्यूब 3, 4 और स्वचालित 5-7 FV assays आमतौर पर केवल थक्का गठन के लिए समय प्रदान करते हैं, समय नहीं प्रारंभिक दर, और आतंच थक्का गठन है जो सभी सही FV microplate परख के साथ spectrophotometrically मापा की हद तक. अंत में, झुकाव ट्यूब मैनुअल 3,4 और स्वचालित 5-7 FV assays केवल प्लाज्मा नमूनों में एक समय में एक FV गतिविधि को मापने के लिए सक्षम किया जा रहा से पीड़ित हैं, जबकि FV microplate परख करने के लिए उत्तरदायी है और उच्च throughput 12 नमूने हो सकता है एक साथ assayed.

microplate परख को दिखाना है कि 9 डीआईसी रोगी plasmas में FV कम NHP में देरी थक्का बार और FV परख एक चरण में थक्का गठन के कम शुरूआती दरों का एक संयोजन की वजह से सक्रिय था करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. डीआईसी रोगी plasmas में FV परख दो चरण में थक्का गठन की प्रारंभिक दरें NHP से नहीं बदला गया था. डीआईसी Patien में थक्का गठन का विस्तारटी plasmas भी 1 चरण FV और 2 चरण assays में NHP से बदल नहीं किया गया. FV कम एक चरण, 2 - मंच, और कुल गतिविधियों अन्य अध्ययन के साथ इस अधिग्रहीत रक्त विकार के रोगजनन दौरान अनुसार वृद्धि की FV खपत 19 और / या छह निष्क्रियता के कारण हो सकता है. डीआईसी plasmas में थक्का गठन की हद NHP के साथ मनाया के रूप में एक ही था को देखते हुए, इस चर FV की कमी प्लाज्मा में फाइब्रिनोजेन एकाग्रता का एक परिणाम होने की संभावना है और रोगी plasmas की विशेषताओं के लिए संबंधित नहीं था.

microplate परख से परिणाम संकेत दिया है कि मानव प्लाज्मा के नमूने में FV गतिविधि के माप थक्का गठन के समय और प्रारंभिक दर FV परख एक चरण से और थक्का और दो FV से कुल गतिविधि गठन के समय से प्राप्त किया जा सकता है - मंच परख. यह संभव करने के लिए एक प्लाज्मा नमूने में टी में थक्का गठन की सीमा के आधार पर FV गतिविधि के मात्रात्मक माप प्राप्त नहीं था1 FV वह और 2 चरण assays या FV परख दो चरण में थक्का गठन के प्रारंभिक दर. सभी प्रतिक्रियाओं लगभग 0.35 का थक्का गठन के उसी हद तक पहुँच को देखते हुए पहले प्रारंभिक के absorbance और thromboplastin और कैल्शियम क्लोराइड इसके अलावा के बाद अधिक से अधिक absorbance के बीच 0.45 इकाइयों, थक्का गठन की हद तक की माप में एक FV गतिविधि के मात्रात्मक आकलन प्रदान नहीं करता है प्लाज्मा नमूना दिया.

उपन्यास microplate परख FV गतिविधि के मानव और मानव और पशुओं के प्लाज्मा से शोधन के दौरान प्लाज्मा fractions के नमूने में माप के लिए अनुसंधान और नैदानिक ​​सेटिंग में उपयोग मिल जाएगा. microplate परख के लिए समय, प्रारंभिक दर और थक्का गठन की हद तक को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मानकों को एक साथ पुस्तिका झुकाव ट्यूब assays और स्वचालित जमावट analyzers में आम तौर पर निगरानी नहीं की. यह जानकारी थक्का गठन घटना के दौरान FV की भागीदारी की एक पूरी मात्रात्मक मूल्यांकन के अधिक प्रदान करता हैमानव प्लाज्मा में से पहले किया गया है 3-7 की सूचना दी. यह जानकारी दोनों अनुसंधान और नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब प्लाज्मा के नमूनों में FV गतिविधि में या FV या FVA शुद्ध महत्वपूर्ण बदलाव को मापने. FV microplate परख भी विशेषताएँ और यौगिकों कि को सक्रिय या निष्क्रिय हो सकता है FV और FVA उपाय शिरापरक घनास्त्रता के लिए जोखिम में रोगियों में FV गतिविधि को मापने के FV Leiden उत्परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में 20, 21 और की गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है FV प्लाज्मा से अपनी शोधन के दौरान.

FV microplate आसानी से बाह्य, आंतरिक, या आम मार्ग में किसी भी जमावट कारक की गतिविधि को मापने के लिए अनुकूलनीय परख उपयुक्त प्लाज्मा कारक की कमी का उपयोग कर रहा है और आतंच गठन के लिए अभिकर्मकों की शुरुआत कर रहा है. परख अनुसंधान और नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं में अपनी गतिविधि के और अधिक सटीक और पूर्ण माप के माध्यम से FV जैव रसायन की हमारी समझ में वृद्धि होगी. परमly, इस जानकारी पहले निदान और डीआईसी के रूप में जमावट विकारों, से पीड़ित व्यक्तियों के लिए और अधिक प्रभावी उपचार के विकास के माध्यम से सकारात्मक वातावरण स्वास्थ्य को प्रभावित करेगा.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

अनुसंधान के ओंटारियो प्रौद्योगिकी संस्थान (UOIT) विश्वविद्यालय से व्यावसायिक विकास और अनुसंधान स्टार्टअप फंड डॉ. जॉन ए Samis और स्वास्थ्य अनुसंधान स्वास्थ्य पेशेवर छात्र अनुसंधान Irina Levit पुरस्कार के एक कनाडाई संस्थानों के साथ समर्थन किया था. लेखक उसे वीडियो तैयार करने में सहायता के लिए शान्नोन Everett (शिक्षण और लर्निंग सैंटर, UOIT) को स्वीकार करते हैं. लेखकों उसकी सदस्यता, अंतर्दृष्टि और उपयोगी विचार विमर्श के लिए डॉ. माइकल ई. Nesheim (जैव रसायन विभाग, रानी के विश्वविद्यालय, किंग्स्टन, पर) को स्वीकार करते हैं. लेखकों को भी डीआईसी रोगी अध्ययन में इस्तेमाल plasmas प्रदान करने के लिए डा. चेंग ओल (Roald Dahl Haemostasis और घनास्त्रता केन्द्र, रॉयल लिवरपूल विश्वविद्यालय अस्पताल, लिवरपूल, ब्रिटेन) तो स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kinetic microplate reader Molecular Devices Spectra Max 190 SOFTmax PRO 4.3 LS software
Normal pooled human reference plasma Precision Biologicals CCN-10
Trisodium citrate Becton Dickenson B10242
EDTA Becton Dickenson B10093
FV-deficient human plasma4 Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C.
3 and 60 ml syringes Becton Dickenson 309585 and 136898
Butterfly apparatus Vacutainer 367251 20 gauge
HEPES Sigma/Aldrich H-3375
NaCl Fisher BP358-212
Thromboplastin Trinity Biotech T1106 Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C.
Calcium chloride Becton Dickenson B10070
Human thrombin15 From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol.
Dialysis membrane Fisher 21-152-6 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m.
Template holder and removable 8 well strips. Nunc 14-245-63 and 469957
ELISA washing trays BioRad 224-4872
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. Sarstedt 72690 and 62554205
Multichannel pipette Fisher 2703630 8 channel model.

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References

  1. Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
  2. Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
  3. Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
  4. Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
  5. Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
  6. Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
  7. Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
  8. Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
  9. Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
  10. Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
  11. Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
  12. Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
  13. Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
  14. Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
  15. Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
  16. Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
  17. Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
  18. Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
  19. Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
  20. Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
  21. Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).

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इम्यूनोलॉजी 67 अंक कारक वी Microplate जमावट परख मानव प्लाज्मा intravascular जमावट (डीआईसी) रक्त के थक्के फैलाया
फैक्टर मानव प्लाज्मा में वी गतिविधि के मापन एक microplate जमावट परख का उपयोग
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Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).

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