Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Mätning av Faktor V aktivitet i human plasma Med hjälp av en analys Microplate Koagulation

Published: September 9, 2012 doi: 10.3791/3822
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science, University of Ontario Institute of Technology, 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology, 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology

Summary

Denna studie beskriver en ny mikroplatta analys som mäter FV koagulation aktivitet under fibrin koagelbildning i human plasma som inte har rapporterats tidigare. Metoden använder en kinetisk mikroplattläsare att kontinuerligt mäta förändringen i absorbans vid 405 nm under fibrin koagelbildning i humanplasma.

Abstract

Som svar på skada, är blodets koagulation aktiveras och resulterar i generering av koagulering proteaset, trombin. Trombin klyver fibrinogen till fibrin, som bildar ett olösligt koagel som stoppar blödning. Faktor V (FV) i sin aktiverade form, FVa, är en kritisk kofaktor för proteaset FXa och accelerator av trombin under fibrin koagelbildning som en del av protrombinas 1, 2. Manuella FV analyser har beskrivits 3, 4, men de är tidskrävande och subjektivt. Automatiserade FV analyser har rapporterats 5-7, men analysatorn och reagensen är dyra och i allmänhet ger endast koaglet tid, inte hastigheten och omfattningen av fibrinbildning. Mikroplattan plattformen föredrages för mätning enzymkatalyserade händelser på grund av bekvämlighet, tid, kostnad, liten volym, kontinuerlig övervakning, och hög genomströmning 8, 9. Mikroplattor analyser har rapporterats för koagellys 10, trombocytaggregation11, och koagulationsfaktorer 12, men inte för FV aktivitet i human plasma. Målet med metoden var att utveckla en mikroplatta analys som mäter FV aktivitet under fibrinbildning i humanplasma.

Denna nya mikrotiterplatta beskriver en enkel, billig och snabb analys av FV aktivitet i human plasma. Analysen utnyttjar en kinetisk mikroplattläsare att övervaka absorbans förändring vid 405 nm under fibrinbildning i human plasma (Figur 1) 13. Analysen mäter exakt tid, initial hastighet, och omfattningen av fibrin koagelbildning. Det kräver endast il mängder av plasma, är fullständig inom 6 minuter, har hög genomströmning, är känsligt för 24-80pM FV, och mäter mängden av oavsiktligt aktiverade (1-steg aktivitet) och trombin-aktiverat FV (2-steg aktivitet ) för att erhålla en fullständig bedömning av dess totala funktionell aktivitet (2-steg aktivitet - 1-fas aktivitet).

Spridda intravasrör enskilda koagulation (DIC) är en förvärvad koagulopati som oftast utvecklas från befintliga infektioner 14. DIC är associerad med en dålig prognos och ökar dödligheten över den redan existerande patologi 15. Analysen användes för att visa att i 9 patienter med DIC, FV 1-steg, 2-stegs, och totala aktiviteter minskade, i genomsnitt, med 54%, 44%, och 42%, respektive, jämfört med normal poolad human referens plasma (NHP).

FV mikroplatta analysen lätt kan anpassas för att mäta aktiviteten av en koagulationsfaktor. Denna analys kommer att öka vår förståelse av FV biokemi genom en mer korrekt och fullständig mätning av sin verksamhet i forskning och kliniska situationer. Denna information kommer att positivt påverka hälso miljöer genom tidigare diagnos och utveckling av mer effektiva behandlingar för koagulationsstörningar, såsom DIC.

Protocol

1. Framställning av FV-brist human plasma

  1. Denna metod är en modifikation av det förfarande som ursprungligen beskrivits av Bloom et al 4.
  2. Skaffa humant helblod från en samtyckande frisk vuxen frivillig (man eller kvinna, ålder 18 till 50 år) som inte tar någon medicin. Använd latexhandskar och en laboratorierock hela förfarandet.
  3. Bered 100 ml 3,2% (vikt / volym) trinatriumcitrat i destillerat vatten. Fyll 6,0 ml av denna lösning i separata 60 ml sprutor. Avlägsna luft genom att trycka kolven försiktigt till 6,0 ml-märket på sprutan.
  4. Använd en spritsudd för att rengöra området kubiska ven mellan biceps och underarm. Anslut 20 apparat gauge fjäril till en 3 ml spruta. Sätt fjäril nål i kubiska ven och dra försiktigt på kolven tills blodet fyller den 3 ml-markeringen. Kasta sprutan med blod. Detta steg utförs för att avlägsna eventuell vävnadsfaktor frigörs från skadade endotel vid nålenskada plats som kan aktivera levringsprocessen och störa beredning av FV-brist plasma.
  5. Anslut fjärilsnål till 60 ml spruta "laddad" med 6,0 ​​ml trinatriumcitrat och dra försiktigt på kolven tills blodet når 60 ml markeringen på sprutan. (Slutlig citratkoncentrationen 10.9mm).
  6. Ta sprutan från fjäril nål och blanda försiktigt sprutan samtidigt en handske finger eller tummen på sprutan utlopp.
  7. Fortsätt att dra blod i 60 ml sprutor vardera fylld med 6,0 ​​ml 3,2% trinatriumcitrat som beskrivits ovan. Man bör förutse återvinning av ca 50% av den citratbehandlade blodvolymen som plasma efter centrifugering och att 50 | il FV-bristplasma krävs per prov i mikroplattan analysen. Vårt laboratorium bearbetar rutinmässigt 300-420 ml citratblod i taget med hjälp 5-7 x 60 ml sprutor med vardera 6,0 ml 3,2% trinatriumcitrat / spruta. Detta är tillräckligt FV-bristplasma för cirka 3.000 mikroplattan analyser (se nedan).
  8. Ta fjärilsnål från övervintrade arm och tryck en steril kompress över platsen för venpunktion i 1,0 minuter. Omslag platsen för venpunktion med ett sterilt förband.
  9. Centrifugera citrerat blod vid 3.300 x g under 20 minuter vid rumstemperatur. Recover övre gula plasma lager till en plastbägare med en omrörarstav med en plast överföringspipett noga med att inte störa den nedre röda och vita lagret blodkroppar.
  10. Mät volym plasma i ml och behålla 100 ^ plasma före EDTA-tillsats på is för framtida protrombintid levra tid (PT) testning (se nedan).
  11. Långsamt lägga fast EDTA till citratplasma med försiktig omrörning vid rumstemperatur för att uppnå 5 mM (slutlig koncentration). När EDTA har lösts, justera pH till 7,0 genom droppvis tillsats av 1,0 M NaOH med försiktig omrörning.
  12. Täck bägaren med Saran Wrap och inkubera under 8-10 timmar utan omrörning vid 37 ° C.
  13. Varje 2 timmar, återhämta 100 ^EDTA-behandlade plasman på is och bestämma PT vid tidpunkten för inkubation med EDTA och jämför PT av plasma före EDTA-tillsats (se ovan).
  14. För PT bestämningar, placera flyttbara 8 och immunomodule remsor i plast mall hållaren och sätt in mikroplattläsare.
  15. Orient immunomodule band i mikroplattavläsare som: tom, tom, prov, tom, tom, prov, tom, och tom från vänster till höger i mallen innehavaren att minimera ljusspridningen störningar från angränsande prov innehåller remsor. Dessutom, använd endast brunnar 2-7 från toppen till botten i varje 8 väl immunomodule band för att minimera ljusspridningen störningar från kanterna av plast mall hållare.
  16. FV mikroplatta analysen är i stånd att mäta fibrinkoagel bildas i minst 12 olika prover samtidigt (6 prover per immunomodule remsa över 2 immunomodule remsor).
  17. Med hjälp av en flerkanalig pipett, tillsätt 50 pl HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) tillvarje mikrotiterplatta väl för varje prov som skall analyseras. Med hjälp av en enda pipett, tillsätt 50 ul normalt poolad human referens plasma (NHP) eller plasma före tillsats av EDTA eller vid olika inkubationstider efter tillsats av EDTA för att separera brunnarna.
  18. Med hjälp av en multikanalpipett, tillsätt 50 ul tromboplastin (Se nedan för förberedelse metod) till alla brunnarna med plasma som skall analyseras. Inkubera i mikroplattläsare vid 25 ° C under 1 min och programmera mikroplattläsare att skaka plattan under 15-25 sek i 1 min inkubation.
  19. Med hjälp av datorn gränssnitt med mikroplattavläsare, tillgång SOFTmax Pro mikroplatta program. Ställ läsaren att Absorbans, våglängd till 405 nm, läge till Kinetic, temperatur till 25 ° C, och programmera mikroplattläsare att skaka i 5 sekunder, och avläs absorbansen vid 405 nm var 5 sekund under 6 min.
  20. Med hjälp av en flerkanalig pipett, tillsätt kalciumklorid (50 | il av 25 mM i destillerat vatten; 2.1MM finaL koncentration) till alla brunnarna, vänta 15 sekunder och tryck på "Start"-ikonen på mikroplattan SOFTmax Pro-menyn för att starta analysen.
  21. Bestäm PT från absorbansen mot tiden profiler i SOFTmax Pro som tiden för att nå den halv maximal ökning i absorbans vid 405 nm (Mittpunkten av den sigmoidala Absorbans mot tid kurva som produceras efter tromboplastin och kalciumklorid tillsats. Se nedan, Figur 1).
  22. Beräkna FV 1-stegs aktivitet från loggen Clot Tid (sek) vs Log FV aktivitet (enheter / ml) som visas nedan i figur 2A. För kvantifiering ändamål är 1Unit av FV aktivitet definieras som aktiviteten i 1,0 ml NHP före avsiktliga aktivering med tillsats trombin (se nedan Analys humanplasma med FV 1-fas och 2-fas mikroplatta koagulationsanalys).
  23. Bered 4.0L av 20 mM HEPES innehållande 0,15 M NaCl i destillerat vatten under försiktig omröring. Justera pH till 7,4 med långsam dropwise tillsats av 5.0M NaOH (HBS, pH 7,4).
  24. Skaffa en tillräckligt lång dialysslang och skölj noggrant med destillerat vatten. Knyt en knut i ena änden av slangen. Överför EDTA behandlade plasman till dialysrör med en plast överföringspipett, ta bort luft och knyt en knut i den andra änden av slangen.
  25. Försiktigt hänga EDTA-behandlade plasman i slangen i HBS med försiktig omrörning. Täck med Saran Wrap och dialysera under 14-16h med försiktig omröring vid 4 ° C.
  26. Ta försiktigt bort EDTA-treated/dialyzed plasma 3,0 ml portioner till 15,0 utjämnade ml skruv rör och behålla 100 ^ för PT-analys av "slutliga" FV-brist plasma på is. Förvara FV-bristplasma i vid -80 ° C tills användning. Under de förhållanden som beskrivits ovan, PTS ökningen från 10 till 15 sekunder innan EDTA Förutom 90-100 sek 8-10 timmar efter EDTA tillsats. FV-bristplasma framställd genom detta förfarande innehåller rutinmässigt mindre än 0,1% av den aktiva FV närvarande i utgångsmaterialetfärsk humanplasma.

2. Framställning av tromboplastin

  1. Dialys krävs för att avlägsna eventuella kalcium från detta reagens för att tillåta exakt timing fibrin koagelbildning från tiden av kalciumklorid Förutom att initiera koaguleringsprocessen.
  2. Bered 100 ml och 4.0L av 20 mM HEPES och 0,15 M NaCl i destillerat vatten i en plastbägare med försiktig omrörning. Justera pH till 7,4 med långsam droppvis tillsats av 5.0M NaOH (HBS, pH 7,4).
  3. Lägg 6,0 ml HBS, pH 7,4 till varje flaska tromboplastinreagens, byt locket och skaka försiktigt för att lösa. Inkubera reagens i förslutna flaskor i 15 min vid rumstemperatur för att lösa torkat material. Skaka försiktigt för att fullständigt lösa.
  4. Skär en tillräckligt lång dialysrör, skölj väl med destillerat vatten, och fästa ena änden av slangen med en knut. Överför tromboplastin till dialysrör, ta bort luft och fästa andra änden av slangen med en knut.
  5. CArefully hänga dialysrör i 4.0L HBS, pH 7,4 och försiktigt rör täcktes med Saran Wrap vid 4 ° C under 14-16 timmar.
  6. Överför 3,0 ml portioner av den dialyserade tromboplastin till 15 utjämnade ml skruv rör och förvara vid -80 ° C tills de användes.

3. Beredning av FV 1-stegs mikroplattor koagulationsanalys Aktivitet standardkurvor

  1. Tina FV-bristplasma, NHP, och tromboplastin vid 37 ° C under 10 minuter. Blanda försiktigt FV-brist plasma och tromboplastin självständigt överföra skilja plast tvätt brickor, och inkubera på is. Förvara NHP på is efter försiktigt omblandning. Lagra kalciumklorid (25 mM i destillerat vatten) i en separat tvätt bricka vid rumstemperatur.
  2. Bered 200 il vardera av 2-faldiga serieutspädningar av NHP från 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-faldigt i HBS, pH 7,4 med användning av 1,5 ml mikrocentrifugrör. Vortexa brunn och inkubera på is.
  3. Placera löstagbara 8 väl immunomodule remsorna i plastic mall hållare och sätt in mikroplattläsare.
  4. Orient immunomodule band i mikroplattavläsare som: tom, tom, prov, tom, tom, prov, tom, och tom från vänster till höger i mallen innehavaren att minimera ljusspridningen störningar från angränsande prov innehåller remsor. Dessutom, använd endast brunnar 2-7 från toppen till botten i varje 8 väl immunomodule band för att minimera ljusspridningen störningar från kanterna av plast mall hållare.
  5. FV mikroplatta analysen är i stånd att mäta fibrinkoagel bildas i minst 12 olika prover samtidigt (6 prover per immunomodule remsa över 2 immunomodule remsor).
  6. Slå på mikroplattavläsare och tillgång SOFTmax Pro mikroplatta programvara.
  7. Med hjälp av en multikanalpipett, göra samtidiga tillsatser av FV-bristplasma (50 pl) till alla prov brunnarna. Använd en enda pipett, tillsätt 50 | il av de 10 serieutspädningar av NHP framställda ovan för att separera brunnarna.
  8. Med hjälp av en flerkanalig pipett, tillsätt tromboplastin (50 pl) till alla provbrunnar. Inkubera i mikroplattläsare vid 25 ° C under 1 min och programmera mikroplattläsare att skaka plattan under 15-25 sek i 1 min inkubation.
  9. Med hjälp av datorn gränssnitt med mikroplattavläsare, tillgång SOFTmax Pro mikroplatta program. Ställ läsaren att Absorbans, våglängd till 405 nm, läge till Kinetic, temperatur till 25 ° C, och programmera mikroplattläsare att skaka den första 5 sekunder efter kalciumklorid tillsats, och mät absorbansen vid 405 nm var 5 sekund under 6 min därefter. Den 5 sek skakar intervall ingår inte i de beräknade koagel gånger (se nedan).
  10. Med hjälp av en multikanalpipett, tillsätt kalciumklorid (50 il 25 mM i destillerat vatten, slutlig koncentration 3,5 mm) till alla prov brunnarna, vänta 15 sekunder, trycker du på "Start" ikonen i mikroplattan ansökan SOFTmax Pro från datorn för att starta analys.
  11. THan koagel tider beräknas som tiden i sekunder för att nå mittpunkten mellan lägsta och högsta absorbans vid 405 nm efter tromboplastin och kalciumklorid tillägg.
  12. De initiala andelen koagelbildning beräknas som hastigheten för ökning i absorbans vid 405 nm (mUnits / minut) som omfattar de första 5 tidpunkterna för koagelbildning i den linjära delen av absorbansen mot tiden kurva.
  13. Omfattningen av koagelbildning beräknades som skillnaden mellan den maximala och minimala absorbans vid 405 nm (enheter) uppnås under koagelbildning händelsen.

4. Analys humanplasma med FV 1-fas och 2-fas mikroplattor koagulationsanalys

  1. Tina FV-bristplasma, NHP, plasma prov, och tromboplastin vid 37 ° C under 10 minuter. Blanda försiktigt FV-brist plasma och tromboplastin självständigt överföra skilja plast ELISA tvätt brickor, och inkubera på is. Förvara NHP och prov plasma på isEfter försiktig blandning. Lagra kalciumklorid (25 mM i destillerat vatten) i en separat ELISA-tvätt fack vid rumstemperatur.
  2. Bered 200 pl vardera av 40-faldiga utspädningar av NHP och prov plasmor i HBS, pH 7,4 med 1,5 ml mikrorör. Vortexa brunn och inkubera på is.
  3. Sätt i ett flyttbart 8 och immunomodule remsorna i plast mall hållaren och sätt in mikroplattläsare.
  4. Alternate tom, tom, prov, tom, tom, prov, tom, och tom immunomodule remsor från vänster till höger i mallen innehavaren att minimera ljusspridningen störningar från angränsande prov som innehåller remsor. Använd endast brunnar 2-7 från toppen till botten i varje immunomodule band för att minimera ljusspridningen störningar från kanterna av plast mall hållare.
  5. Slå på mikroplattavläsare och tillgång SOFTmax Pro mikroplatta programvara.
  6. Med hjälp av en flerkanalig pipett, tillsätt FV-bristplasma (50 pl) till alla prov brunnarna. Använda en single pipett, tillsätt 50 ul 40-faldigt utspädd NHP eller plasma prov framställt ovan för att separera brunnarna.
  7. Med hjälp av en flerkanalig pipett, tillsätt tromboplastin (50 pl) till alla provbrunnar. Inkubera i mikroplattläsare vid 25 ° C under 1 min och programmera mikroplattläsare att skaka plattan under 15-25 sek i 1 min inkubation.
  8. Med hjälp av datorn gränssnitt med mikroplattavläsare, tillgång SOFTmax Pro mikroplatta program. Ställ läsaren att Absorbans, våglängd till 405 nm, läge till Kinetic, temperatur till 25 ° C, och programmera mikroplattläsare att skaka den första 5 sekunder efter kalciumklorid tillsats, och mät absorbansen vid 405 nm var 5 sekund under 6 min därefter. Den 5 sek skakar intervall ingår inte i de beräknade koagel gånger (se nedan).
  9. Med hjälp av en flerkanalig pipett, tillsätt kalciumklorid (50 | il av 25 mM i destillerat vatten, 6.25mM slutkoncentration) till alla prov brunnarna och omedelbart prESS 'Start' ikonen i mikroplattan ansökan SOFTmax Pro från datorn för att starta analysen.
  10. Vid slutet av körningen, bestämma tid, initial hastighet, och omfattningen av koagelbildning för 40-faldigt utspädd NHP och plasmor prov från absorbans vs tid profiler i SOFTmax Pro.
  11. Med hänsyn till 40-faldig utspädning, använd koagel tid för varje prov för att beräkna FV aktiviteten i enheter / ml från FV 1-stegs aktivitet standardkurva över Log Clot Time vs Log FV aktivitet (Figur 2A). Detta representerar FV-1 steg aktivitet eller att utan "avsiktlig" aktivering av trombin.
  12. Eftersom FV aktiveras med trombin till det aktiva kofaktorn är FVa 1, en ​​andra analys efter tillsats och inkubation med trombin kritisk att noggrant mäta FV 2-stegs aktivitet av ett plasmaprov (Med "avsiktlig" aktivering genom trombin tillsattes).
  13. För FV 2-stegs-analys, förbereda 200-300 il renat trombin 18 at 100 nM i HBS, pH 7,4 och inkubera på is. Planerar att använda 10 pl utspädd trombin för varje plasmaprov som skall analyseras med FV 2-stegs-analys.
  14. Späd 120 pl av ovanstående NHP och plasmor prov från 40-faldigt till 100-faldigt med 170 pl HBS, pH 7,4 innehållande 2,8 mm kalciumklorid. Tillsätt 10 | il trombin (10 nM slutlig koncentration) till varje prov. Vortexa väl att blanda och inkubera vid 37 ° C under 1 min.
  15. Späd NHP och plasmor prov till 500-faldigt genom tillsats av 400 | il HBS, pH 7,4, virvel väl, och analys 50 pl av varje plasmaprov i FV 1-stegs mikroplatta analys som beskrivits ovan.
  16. Bestäm koagel tid för NHP och varje plasmaprov analyseras från absorbansen mot tiden profiler i SOFTmax Pro. Med hänsyn till 500-faldig utspädning, använd koagel tid för varje prov för att beräkna FV 2-stegs aktivitet från FV 1-stegs standardkurva över Log Clot Time vs Log FV aktivitet (Figur 2A).
  17. Den totala FV aktiviteterTY kan då beräknas som FV 2-stegs aktivitet - FV 1-stegs aktivitet.

Representative Results

Representativa resultat - Förberedelser inför FV 1-stegs mikroplatta koagulationsanalys aktivitet standardkurvor

Ett representativt exempel av fibrin koagelbildning i FV-analysen över tiden genereras av mikroplattavläsare illustreras i figur 1. FV-analysen mäter exakt tid, initial hastighet, och omfattningen av fibrin koagelbildning. Inspektion av brunnarna vid analys avslutad bekräftade att koagelbildning inträffade. Alla reaktioner nådde ungefär samma grad av koagelbildning med en allmän förändring i absorbans vid 405 nm av 0,35 till 0,45 enheter mellan start absorbansen före och den maximala absorbansen efter tromboplastin och kalciumklorid tillsats. Representativa exempel på FV 1-stegs aktivitet standardkurvor från Log Clot Tid (i sekunder) vs Logga FV Aktivitet (enheter / ml) och logga initial hastighet av koagelbildning (i mUnits / min) mot Logga FV Aktivitet (enheter / ml ) för seriespädningar av NHP visas i figur 2B, respektive. Montering av log-log diagram över Clot Tid vs FV 1-aktivitet visade ett starkt samband mellan dessa variabler efter linjär regressionsanalys (Figur 2A, R2 = 0,980). Montering av log-log plot av den initiala koagelbildning vs FV aktivitet också indikerat ett starkt samband mellan dessa variabler efter linjär regressionsanalys (Figur 2B, R2 = 0,983). Förhållandet mellan både Log Clot Tid och logga initial hastighet av koagelbildning vs Log FV aktivitet förblev linjär för NHP utspädd upp till 512-faldigt. Eftersom FV cirkulerar i NHP vid ca 12-40nm 16, är mikroplattan analysen känslig för ca 24-80pM FV i NHP. Med tanke på att dissociationskonstanten för interaktionen av FVa-FXa-lipid protrombinas är ungefär 1 nM 17, är FV mikroplattan analysen helt lämplig för mätning av FV-nivåer i fysiologiskt relevant nM för FVa funktion i protrombinas.

Använda FV mikroplattan analysen var det också fastställt att det normala intervallet för FV aktivitet i FV 1-stegs aktivitet analys av 15 friska kontrollpersoner plasmor (Man och Kvinna, Ålder 18-20yrs) var (medelvärde ± standardavvikelse, Range): 0,96 ± 0.14U/ml, 0.68-1.11U/ml. Detta stämmer väl överens med den normala friska FV aktivitet och räckvidd (0.66-1.14U/ml) rapporterades av Cutler et al. för FV 1-stegs aktivitet bestämdes med en automatiserad analysator 7. Den intra-assay variation av tiden, omfattning och initial hastighet av koagelbildning i FV 1-stegs-analys i 6 brunnar på 8 olika dagar var 3,4%, 4,4%, och 3,1%, respektive. Den mellan analyser variabilitet av tiden, omfattning och initial hastighet av koagelbildning i FV 1-stegs-analys i 6 brunnar med 8 olika experiment på 8 olika dagar var 7,1%, 7,8%, och 9,2%, respektive. Således inom och mellan-analys variabiliteten av dessa tre mätröda variabler var på en låg och acceptabel nivå för robust analys prestanda inom och mellan mikroplatta analys av flera prover samtidigt (upp till 12).

Representativa resultat - Analys av humana plasmaprover med FV 1-fas och 2-fas mikroplatta koagulationsanalys

Standardkurvan över Log Clot Time vs Log FV aktivitet (figur 2A) användes för att mäta aktiviteten FV i NHP och 9 DIC plasmor patienter som inte avsiktligt aktiverades med tillsatt trombin (FV 1-stegs aktivitet) eller var avsiktligt aktiveras med sattes trombin (FV 2-stegs aktivitet) och resultaten visas i tabell 1. Alla 9 DIC patienter plasma uppvisade FV 1-stegs verksamhet och inledande priser för koagelbildning som minskade i genomsnitt med 54% respektive 18% respektive från NHP. De omfattning av koagelbildning i FV 1-fas analys i DIC patienter var inte till stor del skiljer sig från NHP, och ökade i genomsnitt med 13% från NHP.

Aktivering av NHP med trombin genererat en ungefärlig 8-faldig ökning i FV 2-stegs aktivitet över FV 1-stegs aktivitet (tabell 1). Detta tyder på att FV i NHP främst närvarande i sin oaktiverad form och håller med de tidigare rapporterade resultat med hjälp av manuella tilt-rör FV-analyser 3, 4 och automatiserade FV analyser 5-7. FV 2-stegs och total aktivitet också minskade i DIC patienter i genomsnitt, med 44% och 42%, respektive, från NHP. De första priser och utsträckningar av koagelbildning i FV 2-stegs-analys i DIC patienterna skilde sig inte signifikant från NHP, och varierade i genomsnitt med ca 9% och 4%, respektive, från den som observerades med NHP. Dessa resultat indikerade att jämfört med FV i NHP, FV i DIC patienten plasma resulterade i en förlängd tid och minskad hastighet av fibrin koagelbildning och att patienten FV var i genomsnitt endast 56% som aktiverbart med trombin samt.

ENT "FO: keep-together.within-page =" alltid "> Figur 1
Figur 1. Koagelbildning i normal poolad human plasma referens uppmätt med kinetiska mikroplattan FV 1-stegs koagulationsanalys. Fibrin koagelbildning i NHP övervakades kontinuerligt vid 405 nm med användning av en kinetisk mikroplattläsare. Handlingen är mikroplattläsaren utsignalen från en 6 min reaktion av 32-faldigt utspädd NHP, FV-bristplasma, tromboplastin, och kalciumklorid i en mikroplatta väl. Den vertikala axeln representerar förändringen i absorbans vid 405 nm som uppstod som ett resultat av fibrinbildning i plasma. Tiden för fibrinbildning definierades som tiden för att nå den halv maximal ökning i absorbans eller mittpunkten av kurvan (36,40 sek). Den initiala hastigheten för koagelbildning definierades som förändringshastigheten av absorbans vid 405 nm under de första 5 tidpunkterna för den linjära ökningen av absorbans delen av kurvan (611,88 mUnits / min). Den före dettatält av koagelbildning definierades som skillnaden mellan högsta och lägsta absorbans vid 405 nm (0,35 enheter).

Figur 2
Figur 2. Standardkurvor tid och initial hastighet av koagelbildning vs Faktor V-aktivitet i normal poolad human referens plasma med FV 1-stegs mikroplatta analys. NHP serieutspäddes (0 - till 512-faldigt i HBS) och analyserades med FV 1-stegs mikroplatta analys såsom beskrivits i protokollet. Log-log diagram av tid och initial hastighet för koagelbildning vs FV aktivitet i FV 1-stegs mikroplatta analys visas efter linjär regression modellering av data i panelerna A och B, respektive.

1-fas analys Initial Pris (mUnits / min)
Prov 1-enstegsanalys aktivitet (enheter / ml) 1-fas analys Omfattning (enheter) 2-stegs-analys Aktivitet (enheter / ml) 2-stegs-analys Omfattning (enheter) 2-stegs-analys Initial Pris (mUnits / min) Total aktivitet (enheter / ml)
NHP 1,02 0,363 744,96 7,93 0,433 375,84 6,91
Patient 1 0,36 0,404 583,80 3,84 0,432 249,96 3,48
Patient 2 0,67 0,416 704,04 5,28 0,469 323,16 4,61
0,31 0,435 562,08 3,92 0,453 294,96 3,61
Patient 4 0,39 0,435 617,04 4,14 0,462 372,60 3,75
Patient 5 0,73 0,401 641,40 5,91 0,433 354,24 5,18
Patient 6 0,45 0,403 600,72 4,16 0,445 393,96 3,71
Patient 7 0,49 0,395 575,40 4,89 0,449 357,48 4,40
Patient 8 0,19 0,448 489,00 2,89 0,450 330,48 2,70
Patient 9 0,64 0,423 699,48 5,11 0,455 417,24 4,47

Tabell 1 FV aktivitet i NHP och 9 patienter som utvecklade disseminerad intravaskulär koagulation (DIC). Fv 1-fas, 2-fas, och den totala aktiviteten i NHP och 9 DIC plasmor patienten bestämdes från FV 1-stegs mikroplatta analys standard kurva av tiden för koagelbildning vs FV aktivitet (Figur 2A) och anges i enheter / ml. De initiala priser (Initial ökningstakt i A405nm över de fem första tidpunkter i mUnits / min) och utsträckning (Maximum A405nm - Minsta A405 nm) av koagelbildning i FV 1 - och 2-steg mikroplatta analysen visas också.

Discussion

Den kinetiska mikrotiterplatta analysförfarande beskriver utvecklingen av en ny, snabb, billig och lämplig teknik för mätning av FV koagulering aktivitet i prover av mänskligt plasma som inte har (FV 1-stegs-analys) eller avsiktligt har aktiverats med tillsatt trombin (FV 2-stegs-analys). Analysen utnyttjar en kinetisk mikroplattläsare och allt material och nödvändiga reagens är kommersiellt tillgängliga eller kan göras internt. Analysen övervakar kontinuerligt förändringen i ljusspridning av plasma under fibrin koagelbildning vid 405 nm. Mikroplattan analys har fördelen med att använda små volymer plasmaprov (il) och är mottaglig för analys av multipla prover samtidigt (upp till 12). Dessa analysbetingelser attribut är fördelaktiga när dyr utrustning och reagens används (Automated analysatorer och Faktor-brist plasma), endast små prowolymer är tillgängliga (Patient plasmor) eller analys av ett stort antal prover (Under FV rening from plasma).

FV mikroplatta analysen har den extra fördelen att det är bekvämt, snabbt och kräver inte isolering och rening av de nödvändiga ingående komponenter. Jämfört med manuell tilt-rör 3, 4 och automatiserade 5-7 FV-analyser som har rapporterats har FV mikroplattan analysen jämförbar användbar utbud av koagel gånger (25-75 sek) och motsvarande FV nivåer i provet (0,5 till 0,005 enheter / ml) och känslighet / detektionsgränser (20-80pM). Jämfört med manuell tilt-rör FV analyser som lider av en subjektiv visuell bedömning av koagelbildning 3, 4, tillåter FV mikroplattan analysen objektiv och kvantitativ mätning av koagel tid, initial hastighet, och omfattningen av fibrin koagelbildning. Jämfört med automatiserade FV analyser som lider av kravet på dyra analysatorer och reagenser 5-7, FV mikroplattor analysreagensen och material är billiga och alla nödvändiga material kan inköpssed kommersiellt eller görs i egen regi. Manuell tilt-röret 3, 4 och automatiserade 5-7 FV analyser i allmänhet endast ge tiden för koagelbildning, inte tid, initial hastighet, och omfattningen av fibrin koagelbildning som alla noggrant uppmätt spektrofotometriskt med FV mikroplattan analysen. Slutligen, manuell tilt-rör 3,4 och automatiserad 5-7 FV analyser lider bara kunna mäta FV aktiviteten i plasmaprover en i taget, medan FV mikroplattan analysen är mottaglig för hög kapacitet och 12 prover kan vara analyserades samtidigt.

Mikroplattan analys användes för att visa att FV 9 DIC patientens plasma var mindre aktiv än i NHP grund av en kombination av fördröjda koagel och lägre initiala satser för koagelbildning i FV 1-enstegsanalys. De första andelen koagelbildning i FV 2-stegs-analys i DIC patienter plasma inte ändrats från NHP. De omfattning av koagelbildning i DIC patient plasma har inte heller ändrats från NHP i FV 1-stegs och 2-stegs-analyser. Minskad FV 1-stegs, 2-stegs och totala verksamhet kan ha berott på en ökad FV konsumtion 19 och / eller inaktivering 6 i enlighet med andra studier under patogenesen av detta förvärvade blodsjukdom. Med tanke på omfattningen av koagelbildning i plasma DIC var densamma som observeras med NHP, var denna variabel sannolikt ett resultat av fibrinogenkoncentrationen i FV-bristplasma och inte relaterad till egenskaperna hos patienten plasma.

Resultaten från mikroplattan analys visade att mätning av FV aktivitet i prover av human plasma kan erhållas från tiden och initiala hastigheten för koagelbildning från FV 1-enstegsanalys och tiden för koagelbildning och total aktivitet från FV 2 - enstegsanalys. Det var inte möjligt att erhålla kvantitativa mätningar av FV-aktivitet i ett plasmaprov baserad på omfattningen av koagelbildning i tHan FV 1 - och 2-stegs-analyser eller den initiala koagelbildning i FV 2-stegs-analys. Med tanke på alla reaktioner nådde ungefär samma grad av koagelbildning av 0,35 till 0,45 enheter mellan den initiala absorbansen före och den maximala absorbansen efter tromboplastin och kalciumklorid Dessutom ger mätning av omfattningen av koagelbildning inte en kvantitativ bedömning av FV aktivitet i en givet plasmaprov.

Den nya mikroplatta analysen finner användning i forskning och kliniska miljöer för mätning av FV aktivitet i prover av human plasma och fraktioner under dess rening från människor och djur plasma. Mikroplattan analysen kan användas för att mäta tiden, initial hastighet, och omfattningen av koagelbildning, parametrar allmänhet inte övervakas samtidigt i manuella tilt-rör analyser och automatiserade analysatorer koagulation. Denna information ger mer av en fullständig kvantitativ bedömning av engagemang FV under koagelbildning händelseni human plasma än har tidigare rapporterats 3-7. Denna information är särskilt viktigt i både forskning och kliniska laboratorier vid mätning betydande förändringar i FV aktivitet i prover av plasma eller med renat FV eller FVa. FV mikroplatta analysen kan också användas för att karakterisera och mäta föreningar som kan aktivera eller inaktivera FV och FVa, mäta FV aktivitet hos patienter med risk för ventrombos följd av FV Leiden-mutation 20, 21 och övervaka aktiviteten hos FV under dess rening från plasma.

FV mikroplatta analysen lätt kan anpassas för att mäta aktiviteten av en koagulationsfaktor i den yttre, inre, eller gemensamma vägen med hjälp av lämplig faktor-bristplasma och initiera reagens för fibrinbildning. Analysen kommer att öka vår förståelse av FV biokemi genom en mer korrekt och fullständig mätning av sin verksamhet i forskning och kliniska laboratorier. Ultimately, kommer denna information att påverka positivt vårdmiljöer genom tidigare diagnos och utveckling av mer effektiva behandlingar för personer som drabbats av koagulationsrubbningar såsom DIC.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Forskningen stöddes med Professionell utveckling och forskning Startup medel från University of Ontario Institute of Technology (UOIT) Dr John A. samer och en kanadensisk Institutes of Health Research Health Professional Student Research Award till Irina Levit. Författarna erkänner Shannon Everett (Undervisning och lärande Centre UOIT) för hennes hjälp att förbereda videon. Författarna erkänner Dr Michael E. Nesheim (Institutionen för biokemi, Drottning universitetar, Kingston, ON) för hans mentorskap, insikt och hjälp diskussioner. Författarna erkänner också Dr Cheng Hock Toh (Roald Dahl Haemostasis and Thrombosis Center, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, Storbritannien) för att tillhandahålla de DIC patienten plasmor som används i studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kinetic microplate reader Molecular Devices Spectra Max 190 SOFTmax PRO 4.3 LS software
Normal pooled human reference plasma Precision Biologicals CCN-10
Trisodium citrate Becton Dickenson B10242
EDTA Becton Dickenson B10093
FV-deficient human plasma4 Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C.
3 and 60 ml syringes Becton Dickenson 309585 and 136898
Butterfly apparatus Vacutainer 367251 20 gauge
HEPES Sigma/Aldrich H-3375
NaCl Fisher BP358-212
Thromboplastin Trinity Biotech T1106 Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C.
Calcium chloride Becton Dickenson B10070
Human thrombin15 From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol.
Dialysis membrane Fisher 21-152-6 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m.
Template holder and removable 8 well strips. Nunc 14-245-63 and 469957
ELISA washing trays BioRad 224-4872
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. Sarstedt 72690 and 62554205
Multichannel pipette Fisher 2703630 8 channel model.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
  2. Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
  3. Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
  4. Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
  5. Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
  6. Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
  7. Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
  8. Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
  9. Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
  10. Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
  11. Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
  12. Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
  13. Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
  14. Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
  15. Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
  16. Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
  17. Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
  18. Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
  19. Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
  20. Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
  21. Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).

Tags

Immunologi Faktor V Microplate koagulationsanalys Human plasma disseminerad intravaskulär koagulation (DIC) blodkoagulering
Mätning av Faktor V aktivitet i human plasma Med hjälp av en analys Microplate Koagulation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A.… More

Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter