Summary
この研究では、以前に報告されていないヒト血漿中のフィブリンクロット形成の間のFV凝固活性を測定した新規マイクロプレートアッセイを説明しています。この方法は、継続的にヒト血漿中のフィブリン塊形成時の405nmでの吸光度の変化を測定するために運動をマイクロプレートリーダーを使用しています。
Abstract
損傷に応答して、血液凝固が活性化され、凝固プロテアーゼ、トロンビンの生成をもたらす。トロンビンは、出血を停止不溶性血餅を形成するフィブリンにフィブリノゲンを切断する。その活性化された形態、FVA、でV因子（FV）はナーゼ 1、2の一部としてフィブリン塊形成時のトロンビン生成のプロテアーゼFXaおよびアクセラレータのための重要な補因子である。マニュアルのFVアッセイは3、4に記載されているが、彼 らは時間を要し、主観的である。自動化されたFVアッセイは5-7報告されていますが、アナライザおよび試薬は高価であり、一般的に凝固時間ではなく、フィブリン形成の速度と程度を提供してきた。マイクロプラットフォームがあるため利便性の酵素触媒イベントを測定するために好まれる、時間、コスト、小音量、継続的監視、9、8、高スループット。マイクロプレートアッセイは、血栓溶解10、血小板凝集のために報告されている11、および凝固因子12ではなく、ヒト血漿中のFV活性のために。メソッドの目的は、ヒト血漿中のフィブリン形成時のFV活性を測定マイクロプレートアッセイを開発することでした。
この小説マイクロプレート法は、ヒト血漿中のFV活性の、シンプルで安価、かつ迅速な分析方法を概説します。アッセイは、ヒト血漿中のフィブリン形成（ 図1）は、13時の405nmの吸光度変化を監視するために運動をマイクロプレートリーダーを利用しています。アッセイは、正確時刻、初速度、およびフィブリンクロット形成の程度を測定します。これは、プラズマの唯一の添加量が必要で6分で完了し、高スループットであり、24 80pM FVに敏感であり、意図せずに活性化量（1段活性）とトロンビン活性化FV（2段活性を測定1段活動） - ）は、その合計機能活性（2段活動の完全な評価を得ることができる。
播種intravascular凝固症候群（DIC）が最も多く、既存の感染症14から発達取得凝固障害である。 DICは、既存の病理15上記の予後不良と増加の死亡率に関連付けられています。アッセイは、DIC、FV 1段、2段、合計活動患者9例で、通常のプールされたヒトと比較して、それぞれ、54％、44％、42％、平均的には、減少していたことを示すために使用されました参照血漿（NHP）。
FVマイクロプレートアッセイは、どの凝固因子の活性を測定することは容易に適応可能である。このアッセイは、研究と臨床の現場での活動をより正確かつ完全な測定を通して、FV生化学の我々の理解を増加します。この情報は、積極的に早期診断やDICなど凝固障害、のためのより効果的な治療法の開発を通じて医療環境に影響を与えるでしょう。
Protocol
1。 FV-欠乏ヒト血漿の調製
- この方法は、もともとブルームら 4で説明した手順を変更したものです。
- 任意の薬を服用されていない - 同意健常成人ボランティア（50歳男性または女性、18歳）から、ヒト全血を入手してください。作業中はゴム手袋と白衣を着用してください。
- 3.2％（w / v）の蒸留水にクエン酸三ナトリウム100mlを準備します。独立した60mlのシリンジに、この溶液の6.0ミリリットルをロードします。シリンジに6.0ミリリットルマークに慎重に気のめいるプランジャによって空気を除去する。
- 上腕と前腕の間に肘静脈の領域を洗浄する際には、アルコールを含ませた綿棒を使用しています。 3ミリリットルのシリンジに20ゲージの蝶装置を接続します。肘静脈に翼状針を挿入し、血液は3ミリリットルマークにいっぱいになるまでプランジャーを軽く引く。血液と注射器を廃棄します。このステップは、針で損傷した内皮細胞から放出された任意組織因子を除去するために行われる凝固プロセスをアクティブにするとFV欠乏血漿の準備を妨げる可能性があり、損傷部位。
- 6.0ミリリットルのクエン酸三ナトリウムと 'にすると、ロードされ' 60mlのシリンジに翼状針を接続し、血液がシリンジに60mlのマークに達するまでプランジャを軽く引く。 （最終クエン酸塩濃度10.9mM）。
- 翼状針からシリンジを取り外し、注射器をコンセントに手袋をはめた指または親指を保ちながら、穏やかに注射器を混ぜる。
- 前述のように3.2パーセントクエン酸三ナトリウム6.0ミリリットルでそれぞれが満たされた60mlのシリンジに採血を続行します。一つは、遠心分離後とFV欠乏血漿50μlをマイクロプレートアッセイのサンプルあたりの必要とされるプラズマとしてクエン酸血液量の約50％の回収率を予期すべきである。当研究室では、日常的に3.2パーセントクエン酸三ナトリウム/シリンジの6.0ミリリットルと5月7日×60 mlの注射器を使用して、各時点でクエン酸血の300〜420ミリリットルを処理します。これは、約3000マイクロのための十分なFV欠乏血漿であるプレートアッセイ（下記参照）。
- ボランティアの腕から翼状針を外して、1.0分間静脈穿刺部位にわたって滅菌ガーゼパッドを押します。滅菌包帯で静脈穿刺部位をカバーしています。
- 室温で20分間3300 xgでクエン酸血を遠心分離します。下段赤と白の血液細胞層を乱さないように注意しながらプラスチックピペットを用いて攪拌棒を備えたプラスチック製ビーカーに、上部黄色のプラズマ層を回復します。
- メジャーミリリットルのプラズマの体積および将来プロトロンビン凝固時間（PT）試験（下記参照）のために氷の上でのEDTAを添加する前に血漿100μlを保持します。
- ゆっくり5mMの達成するために、室温で穏やかに攪拌しながらクエン酸血漿に固体のEDTAを加える（最終濃度）。 EDTAが溶解した後、穏やかに撹拌しながら1.0MのNaOHを滴下してpHを7.0に調整。
- サランラップ、そして37℃で攪拌せずに8から10時間インキュベート℃でビーカーをカバー
- 毎週2時間、100μlを回復するEDTA処理氷上プラズマとEDTAとのインキュベーション時のPTを決定し、事前のEDTAを添加（上記参照）に血漿のPTと比較します。
- 取り外し可能な場所8ウェルイムノストリップマイクロプレートリーダーにプラスチック製のテンプレートホルダとインサートの中には、PTの決定。
- 空、空、サンプル、空、空、サンプル、空、サンプル含有ストリップを隣国からの散乱光の干渉を最小限にするためにテンプレートホルダ内の左から右への空：としてマイクロプレートリーダーでオリエントイムノストリップ。また、プラスチック製のテンプレートホルダの端から散乱光の干渉を最小化するために各8ウェルイムノストリップに上から下へだけ井戸2-7を使用しています。
- FVマイクロプレートアッセイを同時に少なくとも12の異なるサンプル（2イムノストリップ上のイムノストリップあたり6サンプル）中のフィブリンクロット形成を測定することが可能である。
- にHBSの50μL（20mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4）を追加して、マルチチャンネルピペットを用いてよくアッセイするサンプルのそれぞれについて、各マイクロプレート。単一のピペットを使用して、マイクロプレートのウェルを分離するためにEDTAを添加した後にEDTAを添加する前に、または様々なインキュベーション時間で正常ヒトプール参照血漿（NHP）または血漿50μlを加える。
- マルチチャンネルピペットを使用して、アッセイするプラズマですべてのマイクロプレートのウェルに50μlのトロンボプラスチン（調製方法については、以下を参照）を追加します。 1分、1分間のインキュベーションの15〜25秒の間に板を横に振るためのプログラム、マイクロプレートリーダーのために25℃でマイクロプレートリーダーでインキュベートする。
- マイクロプレートリーダー、アクセスSoftMax Proソフトウェアマイクロアプリケーションを使用して連結されたコンピュータを使用した。吸光度を、405nmの波長に、キネティック、温度にモード25℃、プログラム、マイクロプレートリーダーを5秒間振り混ぜ、6分間毎に5秒405nmで吸光度を読み取る。にリーダーを設定する
- 2.1mmのFINA、マルチチャンネルピペットを使用して、（蒸留水で50μlの25mMの塩化カルシウムを追加lの濃度）はマイクロプレートウェルのすべてに、15秒待ってから、検定を開始するマイクロSoftMax社のProメニューの "スタート"アイコンを押します。
- 405nmでの吸光度の最大半減増加に達するまでの時間としてSoftMax社Proの吸光度対時間プロファイルからPTを決定します（トロンボプラスチン及び塩化カルシウムを添加した後生産シグモイド吸光度対時間曲線の中間点。下記を参照してください、 図1）。
- 図2Aに下図のようにログの餅時間（秒）とログのFV活性（単位/ ml）から、FV 1段活性を算出。定量の目的のために、FV活動の装着時は、前に追加され、トロンビン（FV 1段と2段のマイクロ凝固アッセイでヒト血漿サンプルをアッセイ、下記を参照してください）との意図的な活性化に1.0ミリリットルNHPでアクティビティプレゼントとして定義されています。
- 穏やかに撹拌しながら蒸留水に0.15MのNaClを含む20mMのHEPESの4.0リットルを用意します。遅いdropwでpHを7.4に調整し5.0M NaOHのISE加算（HBS、pH 7.4）で。
- 透析チューブの十分な長さを取得し、蒸留水で十分に洗い流してください。チューブの一方の端に結び目を作る。転送EDTAは、プラスチック製のピペットで透析チューブにプラズマを処理された空気を除去し、チューブのもう一方の端に結び目を結ぶ。
- 丁寧に穏やかに攪拌しながら、HBSにチューブ内のEDTA処理血漿をハング。サランラップで覆い、4℃で穏やかに攪拌しながら14-16時間透析
- 慎重に15.0ミリリットルスクリューキャップチューブに3.0ミリリットルのアリコートにEDTA-treated/dialyzed血漿を除去し、氷の上で '最終' FV欠乏血漿のPTアッセイのための100μlを保持します。 -80℃で使用するまでに、FV欠乏血漿を格納します。上記の条件下で、EDTAの添加後90から100秒8から10時間へのEDTAを添加する前に10から15秒からのPTの増加となりました。この方法によって調製されたFV欠乏血漿は、日常的に開始に積極的にFV現在の0.1％未満を含んでいる新鮮なヒト血漿。
2。トロンボプラスチンの調製
- 透析は、血液凝固プロセスを開始するために塩化カルシウム添加時から正確にタイミングフィブリン血栓形成を可能にするために、この試薬から任意のカルシウムを除去する必要がある。
- 穏やかに撹拌しながら、プラスチック製ビーカーに蒸留水で100mlと4.0リットル20mMのHEPESおよび0.15M NaClを準備します。 5.0MのNaOH（HBS、pH 7.4）でのゆっくり滴下してpHを7.4に調整してください。
- トロンボプラスチン試薬の各バイアルにHBSは、pH7.4の6.0ミリリットルを加え、蓋を交換し、溶解するまで静かに横に振る。乾燥した材料を溶解させるために、室温で15分間かぶったバイアルに試薬をインキュベートする。完全に溶解するまで静かに横に振る。
- 、透析チューブの十分な長さをカットし、蒸留水でよくすすぎ、結び目とチューブの一方の端をオフに接続します。透析チューブにトロンボプラスチンを移し、空気を除去し、結び目とチューブのもう一方の端をオフに接続します。
- のCarefully HBSは、pH7.4の4.0リットルの透析チューブをハング、優しく14から16時間、4℃でサランラップで覆っかき混ぜる。
- 使用するまで-80°Cで15 mlのスクリューキャップチューブ、ストアに透析したトロンボプラスチン3.0mlのアリコートを転送します。
3。 FV 1段マイクロ凝固アッセイアクティビティ標準曲線の作製
- 10分間37℃で、FV欠乏血漿、NHP、およびトロンボプラスチンを解凍します。穏やかに、独立して、FV欠乏血漿及びトロンボプラスチンを混ぜるプラスチック洗濯トレイを分離するために転送し、氷上でインキュベートする。穏やかに混合した後、氷上でNHPを保管してください。室温で独立した洗浄トレイにストア塩化カルシウム（蒸留水で25mm）で。
- 1.5を使用して、HBS（pH7.4）中で、512倍 - - 、2 - 、4 - 、8 - 、16 - 、32 - 、64 - 、128 - 、256、200μlの0からNHPの2倍連続希釈のそれぞれの準備mlのマイクロチューブ。よくボルテックスし、氷上でインキュベートする。
- pに取り外し可能な8ウェルイムノストリップを置きマイクロプレートリーダーにラスチックテンプレートホルダとインサート。
- 空、空、サンプル、空、空、サンプル、空、サンプル含有ストリップを隣国からの散乱光の干渉を最小限にするためにテンプレートホルダ内の左から右への空：としてマイクロプレートリーダーでオリエントイムノストリップ。また、プラスチック製のテンプレートホルダの端から散乱光の干渉を最小化するために各8ウェルイムノストリップに上から下へだけ井戸2-7を使用しています。
- FVマイクロプレートアッセイを同時に少なくとも12の異なるサンプル（2イムノストリップ上のイムノストリップあたり6サンプル）中のフィブリンクロット形成を測定することが可能である。
- マイクロプレートリーダーおよびアクセスSoftMax社のProマイクロプレートアプリケーション·ソフトウェアをオンにします。
- マルチチャンネルピペットを使用して、すべてのサンプルをマイクロプレートのウェルに、FV欠乏血漿（50μL）の同時追加を行う。単一のピペットを使用して、マイクロプレートのウェルを分離するために上記のように調製したNHPの10段階希釈液の50μlを添加する。
- マルチチャンネルピペットを使用すると、すべてのサンプルウェルにトロンボプラスチン（50μl）を追加します。 1分間のインキュベーションの15〜25秒の間に板を振って1分とプログラム、マイクロプレートリーダーのために25℃でマイクロプレートリーダー°Cでインキュベートする。
- マイクロプレートリーダー、アクセスSoftMax Proソフトウェアマイクロアプリケーションを使用して連結されたコンピュータを使用した。波長405nm、その後6分間キネティック、25〜温度で405nmのC、およびプログラムマイクロプレートリーダー塩化カルシウムを添加した後の最初の5秒間振る、メジャー吸光度ごとに5秒のモードに波長、吸光度にリーダーを設定します。間隔を振って5秒は（下記参照）を算出クロット時間には含まれません。
- 塩化カルシウム（蒸留水で25mmの50μlを、最終濃度が3.5ミリメートル）を追加し、マルチチャンネルピペットを用いて15秒待ってから、すべてのサンプルをマイクロプレートのウェルに、開始するには、コンピュータからSoftMax社Proのマイクロアプリケーション内の "スタート"アイコンを押してくださいアッセイ。
- T彼凝固時間は、トロンボプラスチン及び塩化カルシウムを添加した後405nmで最小と最大の吸光度との間の中間点に到達するまでの時間（秒）として計算されます。
- 血栓形成の初期速度を吸光度対時間曲線の直線部分に血栓形成の最初の5つの時点を包含する405nmの吸光度の増加率（mUnits /分）として計算されます。
- 血栓形成の程度は、血栓形成事象の間に達成さ405nmの（単位）で最大と最小の吸光度の差として算出した。
4。 FV 1段と2段のマイクロ波凝固アッセイでヒト血漿サンプルをアッセイ
- 10分間37℃で、FV欠乏血漿、NHP、サンプルプラズマ、及びトロンボプラスチンを解凍します。穏やかに、独立して、FV欠乏血漿及びトロンボプラスチンを混ぜるプラスチックのELISA洗浄トレーを分離するために転送し、氷上でインキュベートする。氷上NHPとサンプルプラズマを保存穏やかに混合した後。室温で別のELISA洗浄トレイ内のストア塩化カルシウム（蒸留水で25mm）で。
- 200μlを1.5 mlのマイクロチューブを使用して、HBS、pH7.4中NHPとサンプルプラズマの40倍希釈液のそれぞれを準備します。よくボルテックスし、氷上でインキュベートする。
- プラスチック製のテンプレートホルダーに着脱可能な8ウェルイムノストリップを挿入し、マイクロプレートリーダーに挿入します。
- サンプル含有ストリップを隣国からの散乱光の干渉を最小限にするためにテンプレートホルダ内の左から右への代替、空の空、サンプル、空、空、サンプル、空、空のイムノストリップ。プラスチック製のテンプレートホルダの端から光散乱干渉を最小限に抑えるため、各イムノストリップに上から下へだけ井戸2-7を使用してください。
- マイクロプレートリーダーおよびアクセスSoftMax社のProマイクロプレートアプリケーション·ソフトウェアをオンにします。
- マルチチャンネルピペットを使用して、すべてのサンプルをマイクロプレートのウェルに、FV欠乏血漿（50μl）を追加します。 SINGLを使用して電子ピペットは、マイクロプレートウェルを分離するために上記のように調製した40倍希釈したNHPまたはサンプルプラズマの50μlを添加する。
- マルチチャンネルピペットを使用すると、すべてのサンプルウェルにトロンボプラスチン（50μl）を追加します。 1分間のインキュベーションの15〜25秒の間に板を振って1分とプログラム、マイクロプレートリーダーのために25℃でマイクロプレートリーダー°Cでインキュベートする。
- マイクロプレートリーダー、アクセスSoftMax Proソフトウェアマイクロアプリケーションを使用して連結されたコンピュータを使用した。波長405nm、その後6分間キネティック、25〜温度で405nmのC、およびプログラムマイクロプレートリーダー塩化カルシウムを添加した後の最初の5秒間振る、メジャー吸光度ごとに5秒のモードに波長、吸光度にリーダーを設定します。間隔を振って5秒は（下記参照）を算出クロット時間には含まれません。
- すべてのサンプルマイクロプレートのウェルに、すぐにPR、マルチチャンネルピペットを用いて、塩化カルシウム（終濃度6.25mM蒸留水に25mmの50μl）を追加アッセイを開始するには、コンピュータからSoftMax社Proのマイクロアプリケーションの[スタート]アイコンをESS。
- 実行の終了時に、時間、初期速度、及びSoftMax社Proで吸光度対時間プロファイルから40倍に希釈したNHPとサンプルプラズマの血栓形成の程度を決定する。
- アカウントに40倍希釈を考慮して、ログ餅時間とログのFV活動のFV 1ステージ活動標準曲線（ 図2A）から単位/ mlでのFV活性を算出し、各試料について凝固時間を使用しています。これは、トロンビンによる "意図的な"活性化の有無に関わらず、FV-1ステージの活動やそれを表しています。
- FVは、アクティブな補因子にトロンビンにより活性化されているので、FVA 1、トロンビンとの加算とインキュベーションした後第二のアッセイは、正確に血漿試料のFV 2段活性（追加トロンビンによる"意図的な"アクティベーション付き）測定することが重要です。
- FV 2段階アッセイのために、トロンビン18精製の200から300μlを準備HBS中トン100nMの、pH7.4及び氷上でインキュベートする。 FV 2段検定で検定する各血漿試料、希釈トロンビン10μlを使用する予定です。
- 2.8mmの塩化カルシウムを含むHBS、pH7.4の170μlの100倍〜40倍から上記NHPとサンプルプラズマの120μlを希釈します。各サンプルに10μlのトロンビン（10nMで最終濃度）を追加します。ボルテックスよく1分間37℃で混合し、インキュベートする。
- 上記のように1段マイクロプレートアッセイFV内の各血漿試料50μlを、HBS、pH7.4の400μlを添加し、ボルテックスウェル、アッセイにより500倍にNHPとサンプルプラズマを希釈します。
- NHPとSoftMax社Proで吸光度対時間プロファイルから測定し、各血漿試料のための凝固時間を決定します。アカウントに500倍希釈を考慮して、ログの餅時間とログのFV活動のFV 1段標準曲線（ 図2A）からFV 2段活性を算出し、各サンプルのため凝固時間を使用しています。
- 合計FV活動FV 1段活動 - TYは、その後、FV 2段の活性として算出してもよい。
Representative Results
代表的な結果 - FV 1段マイクロ凝固アッセイアクティビティ標準曲線の作製
マイクロプレートリーダーを用いて生成された時間以上のFVアッセイにおけるフィブリン血栓形成の代表的な例を図1に示します。 FVアッセイは、正確時刻、初速度、およびフィブリンクロット形成の程度を測定します。アッセイの終了時に井戸の検査は血栓形成が起きていることを確認した。以前に開始された吸光度とトロンボプラスチン及び塩化カルシウムを添加した後の最大吸光度の間に0.45単位 - 全ての反応は0.35の405nmでの吸光度の一般的な変化に伴う血栓形成とほぼ同じ程度に達した。 FVの代表的な例としては、1段ログクロット時間の活動の標準曲線（秒単位）とログのFV活性（単位/ ml）と血栓形成の初期速度をログに記録する（mUnits /分）とログのFV活性（単位/ ml NHPの連続希釈用）は、以下の例で示され
FVマイクロプレートアッセイを使用して、それはまた、15人の健康な対照プラズマのFV 1段活性アッセイ（男性と女性、年齢18-20yrs）でFV活動の正常範囲（平均値±標準偏差、範囲）であったことが判明した： 0.96±0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml。これはカトラーらによって報告され、通常の健康なFVの活動および範囲（0.66-1.14U/ml）とよく一致している。自動分析装置7で決定FV 1段活性のために。時間のアッセイ内変動性、範囲、および8つの異なる日に6ウェル内のFV 1段階アッセイにおける血栓形成の初期速度は、それぞれ3.4％、4.4％、および3.1％であった。時間のアッセイ間変動性、範囲、および8つの異なる日には8つの異なる実験の6ウェル内のFV 1段階アッセイにおける血栓形成の初期速度は、それぞれ7.1％、7.8％、および9.2％であった。したがって、これら3 measuのイントラ及びアッセイ間変動性赤変数（最大12）内と、同時に複数のサンプルのマイクロプレートアッセイの間に強固なアッセイ性能は低く、許容できるレベルであった。
代表的な結果 - FV 1段と2段のマイクロ凝固アッセイによるヒト血漿サンプルをアッセイ
ログ餅時間とログのFV活性の標準曲線（ 図2A）を意図的に添加されたトロンビン（FV 1段活性）により活性化されていなかったか、意図的に活性化したNHPと9 DIC患者プラズマ中のFV活性を測定するために使用されたトロンビン（FV 2段活性）を追加し、結果を表1に示す。全9 DIC患者プラズマは、FV 1ステージ活動およびNHPから、それぞれ、54％、18％、平均で減少した血栓形成の初期速度を示した。 DIC患者におけるFV 1段階アッセイにおける血栓形成のエクステントがNHPと大きく異なっていなかった、とNHPから13％、平均で増加した。
トロンビンとNHPのアクティベーションは、FVで約8倍に増加して生成されたFV 1段階の活動（表1）上記2段活動。これはNHPでFVはその活性化されていない形で主に存在していたと5-7マニュアルチルトチューブFVアッセイ3,4、および自動FVアッセイを使用して以前に報告された結果と一致することを示しています。 FV 2段、総活性はまた、NHPから、それぞれ、44％および42％、平均でDIC患者で減少した。 DIC患者におけるFV 2段アッセイにおける血栓形成の初期速度、エクステントはNHPで観察されたものから、それぞれ、NHPから有意差は認められなかったと、約9％と4％で、平均的に変化した。これらの結果は、NHPでFVと比べて、DIC患者プラズマにおけるFVは長時間をもたらし、フィブリン塊形成の速度を低下させ、患者FVは同様にトロンビンで活性化可能なように、平均でわずか56％であったことが示された。
ENT "のfo：キープtogether.withinページ=" always "を>
図1運動マイクロFV 1段階凝固アッセイを用いて測定し、通常のプールされたヒト標準血漿における血栓形成。 NHPにおけるフィブリン血栓形成を連続キネティックマイクロプレートリーダーを用いて405nmでモニターした。プロットはウェルマイクロプレートでFV欠乏血漿、トロンボプラスチン、塩化カルシウム、32倍希釈したNHPの6分間反応のマイクロプレートリーダーの出力です。縦軸は、血漿中のフィブリン形成の結果として発生した波長405nmにおける吸光度の変化を表しています。フィブリン形成の時間は吸光度や曲線の中点（36.40秒）の半分の最大増加に達するまでの時間として定義されていました。血栓形成の初期速度は曲線（611.88 mUnits /分）の吸光度の部分の線形増加の最初の5つの時点にわたって405nmでの吸光度の変化率と定義した。前の血栓形成のテントは405 nm（0.35単位）での最大値と最小値の吸光度の差として定義されていました。
図2：時間とFV 1段マイクロプレートアッセイを使用して、通常のプールされたヒト標準血漿における血栓形成対V因子活性の初期速度の標準曲線。 NHPは連続的に希釈した（0から512倍までHBS中）され、プロトコルで説明したように、FV 1段マイクロプレートアッセイでアッセイ。 FV 1段マイクロプレートアッセイにおける血栓形成対FV活動の時間と初期速度のlog-logプロットはそれぞれ、パネルAおよびBのデータの線形回帰モデルの後に表示されています。
| サンプル | 1段アッセイ活性（単位/ ml） | 1段アッセイ範囲（単位） | 2段検定アクティビティ（単位/ ml） | 2段アッセイ範囲（単位） | 2段検定初速度（mUnits /分） | 総活性（単位/ ml） | |
| NHP | 1.02 | 0.363 | 744.96 | 7.93 | 0.433 | 375.84 | 6.91 |
| 患者1 | 0.36 | 0.404 | 583.80 | 3.84 | 0.432 | 249.96 | 3.48 |
| 患者2 | 0.67 | 0.416 | 704.04 | 5.28 | 0.469 | 323.16 | 4.61 |
| 0.31 | 0.435 | 562.08 | 3.92 | 0.453 | 294.96 | 3.61 | |
| 患者4 | 0.39 | 0.435 | 617.04 | 4.14 | 0.462 | 372.60 | 3.75 |
| 患者5 | 0.73 | 0.401 | 641.40 | 5.91 | 0.433 | 354.24 | 5.18 |
| 患者6 | 0.45 | 0.403 | 600.72 | 4.16 | 0.445 | 393.96 | 3.71 |
| 患者7 | 0.49 | 0.395 | 575.40 | 4.89 | 0.449 | 357.48 | 4.40 |
| 患者8 | 0.19 | 0.448 | 489.00 | 2.89 | 0.450 | 330.48 | 2.70 |
| 患者9 | 0.64 | 0.423 | 699.48 | 5.11 | 0.455 | 417.24 | 4.47 |
表1 NHPと播種性血管内凝固症候群（DIC）を開発9患者におけるFVの活動。FV 1段、2段、およびNHPと9 DIC患者プラズマの総活性は、FV 1段マイクロプレートアッセイ標準から決定した血栓形成対FV活動の時間の曲線（ 図2A）と単位/ mlで与えられる。初期速度（mUnits /分の最初の5つの時間点以上A405nmの増加の初期速度）およびエクステント（最大A405nm - 最小A40FV 1における血栓形成の5nmの） - および2段マイクロプレートアッセイも示されている。
Discussion
カイネティックマイクロプレートアッセイ法は、安価、迅速、小説の展開について概説、およびFv凝固活性を測定するための便利な手法ではない持っているヒト血漿の試料（FV 1段階アッセイ）で、または意図的に添加トロンビン（FVで活性化されている2段アッセイ）。アッセイは、キネティックマイクロプレートリーダーを利用し、必要なすべての材料および試薬は市販されているか、社内で行うことができる。アッセイは、継続的に405nmのフィブリン塊形成時のプラズマの光散乱の変化をモニタします。マイクロプレートアッセイは、小さな血漿サンプルボリューム（μl）を使用することの利点を持っており、同時に複数のサンプル（最大12）の分析のために適している。高価な機器や試薬は（自動分析および因子欠損プラズマ）を使用している場合は、これらのアッセイの属性が有利であり、わずかなサンプル量が利用可能です（患者プラズマ）またはFV浄化fの間に多数のサンプルを（分析ROMプラズマ）。
FVマイクロプレートアッセイは、高速、便利であることが追加された利点を持っており、必要な構成成分の単離·精製を必要としません。マニュアルチルトチューブ3、4と報告されている自動化された5月7日 、FVアッセイと比較して、FVマイクロプレートアッセイでは、血栓倍の匹敵する有用な範囲（25から75秒）と、試料中の対応するFVレベル（0.5から0.005単位を持っている/ ml）を加え、感度/検出限界（20〜80pM）。血栓形成3、4の主観的な視覚的評価に苦しむマニュアルチルトチューブFVアッセイと比較して、FVマイクロプレートアッセイでは、凝固時間の客観的かつ定量的な測定は、初期速度、およびフィブリンクロット形成の程度を可能にします。 5月7日高価な分析器と試薬の要件に苦しむ自動FVアッセイと比較して、FVマイクロプレートアッセイ試薬および材料は、安価であり、必要なすべての材料がpurchaかもしれません市販sedや社内で行われた。マニュアルチルトチューブ3、図4および5月7日自動FVアッセイは、一般のみ血栓形成のための時間を提供し、時間ではなく、初速度、およびすべての正確FVマイクロプレートアッセイに分光光度計で測定され、フィブリン塊形成の程度。最後に、3,4チルトチューブ、手動および自動の5から7のFVアッセイは血漿検体ずつではFV活性を測定することができるという苦しむ; FVマイクロプレートアッセイ、ハイスループットに従順であり、12のサンプルは、かもしれないのに対し、同時にアッセイ。
マイクロプレートアッセイは9 DIC患者プラズマにおけるFVは遅れのため凝固時間とFV 1段アッセイにおける血栓形成の低い初期レートの組み合わせのNHPに比べて活性が低かったことを証明するために使用されていました。 DIC患者プラズマにおけるFV 2段アッセイにおける血栓形成の初期のレートはNHPから変更されていませんでした。 DIC patienにおける血栓形成のエクステントトンプラズマはまた、FV 1段と2段のアッセイでNHPから変更されていませんでした。減少し、FV 1段、2段、合計活動はこの買収血液疾患の病態時に他の研究に応じて増加FV消費19および/ または不活化6に起因している可能性があります。 NHPで観察されたように、DICプラズマにおける血栓形成の程度を考えると同じだった、この変数には、最も可能性の高い患者プラズマの特性に関連し、FV欠乏血漿およびnot inフィブリノーゲン濃度の結果であった。
マイクロプレートアッセイからの結果は、ヒト血漿試料中のFV活性の測定は、時間とFV 1段アッセイとFV 2からの血栓形成および総活性の時から血栓形成の初期速度から得ることができることが示された - 段階アッセイ。これは、tの血栓形成の程度に基づいて、血漿試料中のFV活性の定量的な測定値を得ることができませんでした彼FV 1 - および2段アッセイまたはFV 2段アッセイにおける血栓形成の初期速度。約0.35の血栓形成の同程度に達し、すべての反応を考えると - トロンボプラスチン及び塩化カルシウムを添加した後、初期吸光度の間に0.45ユニットの前と最大の吸光度を、血栓形成の程度の測定がでFV活動の定量的評価を提供していません血漿試料を与えられた。
小説マイクロプレートアッセイは、ヒトおよび動物の血漿からの精製過程でヒト血漿と分数のサンプルではFV活性の測定のための研究と臨床の現場で使用されています。マイクロプレートアッセイは、時間、初期速度、及び血栓形成の程度を測定するために使用されるかもしれません。パラメータは、通常、手動チルトチューブアッセイおよび自動血液凝固分析器で同時に監視されません。この情報は、血栓形成イベント中にFVの関与を完全に定量的評価の多くを提供していますヒト血漿中には、以前よりも3-7を報告されている。血漿のサンプルにおいてまたは精製FVまたはFVAとFV活性の有意な変化を測定する際に、この情報は、研究と臨床検査室の両方で特に重要です。 FVマイクロプレートアッセイはまた、特徴づけ、測定FVおよびFVAをアクティブまたは非アクティブにすることができる化合物を、静脈血栓症のリスクがある患者では、FV活性を測定FVライデン変異の結果として、20、21との活動を監視するために使用されるかもしれませんプラズマからの精製中FV。
FVマイクロプレートアッセイは、適切な因子欠乏血漿を使用していて、フィブリン形成のための試薬を開始する外因性、内因性、または共通の経路に任意の凝固因子の活性を測定することは容易に適応可能である。アッセイは、研究と臨床の研究室で、その活動をより正確かつ完全な測定を通して、FV生化学の我々の理解を増加します。究極のLYは、この情報は積極的に早期診断やDICなど凝固障害、に苦しんで個人のためのより効果的な治療法の開発を通じて医療環境に影響を与えるでしょう。
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
研究はオンタリオ工科（UOIT）の大学から博士ジョンA. SAMISとイリーナ·レヴィットに保健研究保健専門学生研究賞のカナダの協会にプロフェッショナル開発と研究のスタートアップ資金でサポートされていました。著者らは、ビデオを準備する彼女の援助のためのシャノンエベレット（教育および学習センター、UOIT）を認める。作者は彼の指導、洞察力、および有用な議論博士マイケルE. Nesheim（生化学科、オンクイーンズ大学、キングストンを）認める。著者はまた、研究で使用されDIC患者プラズマを提供するための博士チェンホック桃李（ロアルド·ダールの止血および血栓症センター、ロイヤル·リヴァプール大学病院、リヴァプール、イギリス）を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
| Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
| Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
| EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
| FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
| 3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
| Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
| HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
| Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
| Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
| Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
| Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
| ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
| 1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
| Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |
References
- Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
- Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
- Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G.
- Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
- Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
- Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
- Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
- Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
- Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
- Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
- Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
- Pratt, C. W., Monroe, D. M.
- Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
- Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
- Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
- Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
- Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G.
- Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
- Mammen, E. F.
- Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
- Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).
