Summary
Denne metode beskriver kombinatorisk syntese af bionedbrydelige polyanhydrid film og nanopartikler biblioteker og high-throughput påvisning af protein frigivelse fra disse biblioteker.
Abstract
Polyanhydrider er en klasse af biomaterialer med fremragende biokompatibilitet og drug delivery kapaciteter. Mens de er blevet omfattende undersøgt med konventionelle en-prøve-at-a-time synteseteknikker, har en nyere high-throughput fremgangsmåde blevet udviklet muliggør syntese og afprøvning af store biblioteker af polyanhydrider 1. Dette vil lette en mere effektiv optimering og design processen i disse biomaterialer for stof-og vaccine levering applikationer. Fremgangsmåden i dette arbejde beskriver den kombinatoriske syntese af bionedbrydelige polyanhydrid film og nanopartikler biblioteker og high-throughput påvisning af protein frigivelse fra disse biblioteker. I denne robot betjent fremgangsmåde (fig. 1), er lineære aktuatorer og sprøjtepumper kontrolleret af LabVIEW, der muliggør en håndfri automatiseret protokol, eliminerer brugerfejl. Desuden er denne metode giver mulighed for hurtig fremstilling af mikro-skala polymer biblioteker, røducing batchstørrelsen samtidig resulterer i skabelsen af multivariant polymersystemer. Denne kombinatoriske strategi for polymersyntese letter syntesen af op til 15 forskellige polymerer i en ækvivalent mængde tid, det ville tage at syntetisere en polymer konventionelt. Desuden kan det kombinatoriske bibliotek polymer fremstilles til blanke eller protein-loaded geometrier, herunder film eller nanopartikler ved opløsning af polymeren biblioteket i et opløsningsmiddel og udfældning i et ikke-opløsningsmiddel (for nanopartikler) eller ved vakuumtørring (for film). Ved indlæsning af et fluorochrom-konjugeret protein i polymeren biblioteker, kan protein-frigivelseskinetik vurderes til high-throughput under anvendelse af en fluorescens-baseret påvisningsfremgangsmåde (figur 2 og 3) som beskrevet tidligere 1. Denne kombinatoriske platform er valideret med konventionelle metoder 2 og polyanhydridet film og nanopartikler biblioteker er blevet karakteriseret med
Protocol
1. Kombinatorisk Polymer Library Synthesis (Varierende i Polymer Chemistry) - se figur 1 for Robotic Setup
- Opløs hver monomer i det passende opløsningsmiddel (koncentration = 25 mg / ml) og indlæsning hver i en 10cc gastæt sprøjte.
- Fastgør modstandsdygtige over for opløsningsmidler lokke lås kapillarrør til slutningen af hver sprøjte.
- Placer sprøjterne på sprøjtepumper (New Era Programmerbare sprøjtepumper) og lås på plads.
- Indstille de lineære aktuatorer (Zaber) til startpositionen.
- Brug ringfod klemmer, i slutningen af begge kapillarrørene position i start hætteglasset / godt for monomer deposition.
- Indlede LabVIEW programmet, som pumper variable mængder af hver monomer i hver brønd afhængigt af den ønskede copolymersammensætning. Dette opnås i programmet ved at instruere Z-aksen aktuator til at sænke kapillarrørene i hætteglasset / brønd og derefter hver pumpe til at dispensere den ønskede mængde. Next, programmet instruerer Z-aktuatoren at vende tilbage til sin udgangsposition og X-og Y-aktuatorer til at bevæge sig til positionen for det næste hætteglas / brønd. Dette udføres, indtil hver brønd har det ønskede volumen af monomer deponeret i den.
- Efter monomer deposition er multi-brønd eller flere hætteglas monomer biblioteket overføres til en forvarmet vakuumovn og inkuberet under vakuum for varigheden af kondensationsproduktet polymerisationsreaktionen. For CPH: SA-syntese omsætningen udføres ved 180 ° C, 0,3 torr, i 1,5 timer, men disse reaktionsbetingelser vil variere mellem forskellige polymersystemer.
2. Kombinatorisk Blank og Protein-loaded Polymer Nanopartikel og Film Library Fabrication - se figur 1 for Robotic Setup
- Sprøjten i den første programmerbare sprøjtepumpe er fyldt med et opløsningsmiddel (blank bibliotek), eller et opløsningsmiddel med protein dispergeret i det (protein-loaded bibliotek), mens sprøjten i den anden sprøjtePumpen er tomt. Rør til nanopartikel fabrikation i den tilstødende prøveholderen er fyldt med ikke-opløsningsmidlet (mellem opløsningsmiddel og ikke-opløsningsmiddel er 1 til 100). For film fremstilling en tom multi-brønds plade anvendes i stedet for rørene i hosliggende prøveholder.
- Brug af LabVIEW programmet, opløsningsmidlet deponeres i alle polymer hætteglas / brønde af biblioteket (koncentration = 20 mg / ml) og inkuberes i 1-5 min. En valgfri lydbehandlingstrin (30 s ved 40 Hz) kan indføres for at sikre fuldstændig polymer opløsning.
- Next, ved at iværksætte en separat LabVIEW program prøven trækkes ind i den tomme sprøjte og deponeres i det tilsvarende rør af ikke-opløsningsmiddel (nanopartikler) eller tom brønd (film) i den tilstødende prøveholder.
- Denne proces udføres for hver sammensætning af den diskrete polymer biblioteket.
- Nanopartikel eller filmbibliotek anbringes derefter i et vakuumkammer for opløsningsmiddel og ikke-opløsningsmiddel fjernelse (nanopartikel LibraRy kan også genvindes ved hjælp af vakuumfiltrering).
3. High-throughput protein frigivelseskinetik
- Til undersøgelse high-throughput protein frigivelseskinetik af en polymer bibliotek, en 96 deep-strømmede (2 ml / brønd), er polypropylen plade modificeret således, at den øverste 1/3 af brøndens væg i tilstødende søjler (ex: A og B, C og D, E og F, G og H) er fjernet for at støde op brøndene. De protein-fyldte film skal fremstilles i eller nanopartikler overføres til denne plade for at udføre højt gennemløb frigivelseskinetik undersøgelser. Protein-loaded nanopartikel eller film prøverne skal kun anbringes i en brønd i de tilstødende søjler (ex: A, C, E og G). Se figur 4 for detaljer.
- Efter overførsel af nanopartikler til 96 deep-strømmede release plade er partiklerne lov til at bundfælde. PBS-puffer (0,1 mM, pH 7,4) sættes langsomt til hver prøvebrønd (kolonne A, C, E og G) og derefter til hver tilstødende brønd (kolonne B, D, F og H), indtil fordybningerne er fyldt, og pufferen er fritflydende mellem tilgrænsende brønde. For nanopartikler, må denne proces skal udføres med ekstra forsigtighed for at sikre, at partiklerne forbliver i bunden af prøvebrønden (kolonne A, C, E og G) og blive overført til det tilstødende release godt (kolonne B, D, F og H). I nogle tilfælde er centrifugering nødvendigt at lokalisere nanopartikel prøver i bunden af prøvebrønden (kolonne A, C, E og G).
- Dernæst udløsningspladen lukket med låg og placeres ved den ønskede temperatur (dvs. 37 ° C) under omrøring under hele forsøget.
- Ved trinvise tidspunkter (dvs. 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 og 30 dage) mængden af frigivet fluorokrom-konjugeret protein kvantificeres under anvendelse af en 9400 Typhoon Flatbed Fluorescent Scanner ( GE Healthcare). Frigivelsen plade er placeret på scannerens overflade, scannet ved hjælp af passende excitations laser og emission filters, og fluorescensintensiteten af det frigivne protein i frigivelsen brønde (kolonne B, D, F og H) kvantificeres (Image Quant). Det foreslås, at proteinstandarder af kendte koncentrationer indgå i brønde til beregning protein mængde og tegner sig for fluorochrom quenching.
4. Repræsentative resultater
Ved fremstilling af polymeren biblioteket, er karakterisering blevet udført med 1H-NMR, GPC og FTIR at validere denne kombinatorisk fremgangsmåde 1,7,8,11. Molekylvægte området fra 10.000-20.000 g / mol, polydispersitetsindeks varierer fra 1,5 til 3,0, den kemiske sammensætning har vist sig at være præcis og i overensstemmelse med konventionelle fremgangsmåder til polyanhydrid syntese 12-15. Tilsvarende SEM billeder af nanopartikler bibliotekerne viste lignende overflademorfologi, størrelse og størrelsesfordeling som for konventionelt fremstillede nanopartikler 2. Protein release kinetics fra polyanhydrid nanopartikler eller film udføres i en modificeret brønds plade som beskrevet tidligere 1. Resultaterne viste en omtrentlig nulteordens frigivelse med eller uden en burst afhængig af proteinbelastning og polymerkemi (figur 2 og 3) 1,12,14,16.
Figur 1.. Combinatorial polymerfilm og nanopartikler fremstilling apparat.
Figur 2 Højkapacitetsforskning frigivelse af Texas Red okseserumalbumin (TRBSA) fra en CPH:. SA polymer nanopartikel bibliotek. SA-rige polymer kemier frigiver indkapslet TRBSA den mest hurtigt, mens CPH-rige polymer kemier frigive den langsomste. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsetion og n = 4. Genoptrykt med tilladelse fra Petersen et. al. en. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figur 3 Højkapacitetsforskning frigivelse af Texas Red okseserumalbumin (TRBSA) fra en CPTEG:. CPH polymerfilm bibliotek. CPTEG-rige polymer kemier frigiver indkapslet TRBSA den mest hurtigt, mens CPH-rige polymer kemier frigive den langsomste. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelse og n = 3.
Figur 4. Billedet viser to nabolande brønde "før" og "efter" ændringer i den 96 dybe vældede polypropylen plade. The "efter" modifikation billede til højre viser også tilføjelsen af en polymerfilm (nederst til venstre brønd) med et indkapslet fluorescerende molekylefrigives mellem de to brønde i en pufferopløsning. Den frigjorte fluorescerende molekyle påvises derefter i højre brønd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kendskab til de nødvendige syntesebetingelserne og glasovergangstemperaturer (Tg s) af polymererne, der syntetiseres, er afgørende for biblioteket fabrikation. Hvis Tg s er under stuetemperatur, kan nanopartikel fremstillingstrin skal udføres i et temperaturkontrolleret miljø under Tg af polymererne. Desuden bør der udvises forsigtighed for at sikre, at alt udstyr, der kommer i kontakt med høje temperaturer og de opløsningsmidler, skal være egnet til at håndtere disse betingelser. Flere af de parametre i denne protokol kan justeres (dvs. temperatur, vakuum, inkubationstider, opløsningsmidler, ikke-opløsningsmidler, polymerkoncentration, opløsningsmiddel og ikke-opløsningsmiddel-forhold, osv.) til at rumme forskellige polymersystemer til syntese eller partikel / film fabrikation. I nogle tilfælde er nanopartikler ikke stabilt i opløsningsmidler i lange tidsperioder (tilstrækkeligt til fjernelse af opløsningsmiddel ved vakuumtørring), så to alternative solvent removale fremgangsmåder kan anvendes. 1) Partiklerne kan langsomt centrifugeret, supernatanten opløsningsmidlet dekanteret, og de resterende partikler tørret eller 2) partiklerne kan adskilles ved vakuumfiltrering og derpå tørret. Efter fremstilling af blanke eller protein-loaded nanopartikler / film, high-throughput karakterisering eller afprøvning kan gennemføres at screene biomaterialer til protein, cellulære eller vært interaktioner. Denne high-throughput metode muliggør hurtig optimering af biomateriale ydelse for den ønskede anvendelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender ONR-Muri Award (NN00014-06-1-1176) og den amerikanske Army Medical Research og Materiel Kommando (Grant No W81XWH-10-1-0806) om økonomisk støtte. Dette materiale er baseret på arbejde, støttet af National Science Foundation under Grant No EØF 0552584 og 0.851.519.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
- Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
- Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
- Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
- Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
- Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
- Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
