Summary
هنا، نحن تصف بروتوكولات لحصاد الضامة السنخية الفئران، التي يقيمون الخلايا المناعية الفطرية في الرئة، ودراسة تفعيل استهلاكهم في استجابة لثقافة بالتعاون مع النانوية polyanhydride.
Abstract
ظهرت النانوية القابلة للتحلل كمنصة متعددة لتصميم وتنفيذ اللقاحات الجديدة داخل الأنف ضد الأمراض المعدية في الجهاز التنفسي. على وجه التحديد، polyanhydride النانوية المؤلفة من حمض sebacic الأليفاتية (SA)، والعطرية 1،6 مكرر (ف carboxyphenoxy) الهكسين (CPH)، أو amphiphilic 1،8 مكرر (ف carboxyphenoxy) -3،6-dioxaoctane (CPTEG) عرض الجزء الأكبر حركية فريدة من نوعها وتآكل سطح 1،2 ويمكن استغلالها لاطلاق سراح ببطء الجزيئات الحيوية وظيفي (على سبيل المثال، المضادات البروتين، والمناعية وغيرها) في الجسم الحي 3،4،5. هذه الجسيمات النانوية أيضا تمتلك نشاط المواد المساعدة الذاتية، مما يجعلها خيارا ممتازا لقاح منصة تسليم 6،7،8.
من أجل إلقاء الضوء على الآليات التي تحكم تنشيط المناعة الفطرية بعد التطعيم المخاطية داخل الأنف، لا بد من تقييم الاستجابات الجزيئية والخلوية في ص مستضدامتعض خلايا (ناقلات الجنود المدرعة) المسؤولة عن الشروع في الاستجابات المناعية. الخلايا الجذعية هي ناقلات الجنود المدرعة الرئيسية وجدت في إجراء الخطوط الجوية القطرية، في حين الضامة السنخية (AMɸ) هي السائدة في لحمة الرئة 9،10،11. AMɸ ذات كفاءة عالية في تنظيف الرئتين من مسببات الأمراض الميكروبية وحطام خلية 12،13. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا نوع من الخلايا تلعب دورا هاما في نقل مولدات المضادات الجرثومية إلى الغدد الليمفاوية استنزاف، والذي هو خطوة أولى مهمة في بدء الاستجابة المناعية التكيفية 9. AMɸ أعرب أيضا عن مستويات مرتفعة من نمط الاعتراف الفطرية ومستقبلات زبال، وسطاء تفرز الموالية للالتهابات، ورئيس والخلايا التائية السذاجة 12،14. ويمكن بسهولة ان سكان نقي نسبيا من AMɸ (على سبيل المثال، أكبر من 80٪) يمكن الحصول عليها عن طريق غسيل الرئة للدراسة في المختبر. مقيم تحصد AMɸ من الحيوانات المختصة المناعي توفير النمط الظاهري ممثل الضامة التي من شأنها أن encounteص لقاح الجسيمات المستندة في الجسم الحي. هنا، نحن تصف البروتوكولات المستخدمة لموسم الحصاد والثقافة AMɸ من الفئران ودراسة النمط الظاهري تفعيل الضامة بعد العلاج مع النانوية polyanhydride في المختبر.
Protocol
1. حصاد الضامة السنخية (AMɸ) من الفأر باستخدام غسيل الرئة
- ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) مثل معطف المختبر، والقفازات القابل للتصرف، والمناسبة لحماية العين.
- تحضير كامل AMɸ (cAMɸ) متوسطة قبل بدء موسم الحصاد. إضافة 2.5 مل من الستربتوميسين / البنسلين (القلم / بكتيريا) حل، 250 ميكرولتر من المركابتويثانول-β (2-المركابتويثانول)، و 25 مل من المصل حرارة المعطل بقري جنيني (FBS) إلى 222.25 مل من النسر Dulbelcco للمتوسط المعدل (DMEM). فلتر تعقيم cAMɸ المتوسطة باستخدام 0.2 ميكرومتر زجاجة حجم المسام مرشح أعلى في ظل فراغ.
- الموت ببطء ماوس صحي خنقا CO 2 في غرفة euthanization. وعلى الرغم من استخدام الفأرة C57BL / 6 (6-8 أسابيع من العمر) لأغراض هذا المشروع، يمكن تنفيذ هذه التقنية غسيل الرئة في أي سلالة من الماوس. باستخدام اسطوانة غاز مضغوط، واسمحوا تدفق الغاز الى داخل القاعة لمدة 1 دقيقة قبل وضع الماوس في الفصلالعنبر لضمان مشحونة بالكامل مع غرفة CO 2. ضع الماوس في غرفة لا يقل عن دقيقة واحدة إلى الموت ببطء الماوس. وبالإضافة إلى ذلك، يستنزف كل الماوس عبر ثقب في القلب كوسيلة من وسائل مادية لتأكيد وفاة الماوس كما هو موضح في 1.4.
- وضع الفأرة على ظهرها (الجانب الظهري)، رذاذ مع الايثانول 70٪، وحدد موقع القص، وبزاوية 30 درجة من البطن، اضافة الى وجود إبرة عيار 23 (تعلق على حقنة مل 1) حوالي 50 مم في التجويف الصدري . مع التنسيب المناسب للإبرة، وينبغي أن يكون من الممكن جمع بين 0،4-1 مليلتر من الدم اعتمادا على حجم من الفأرة. فحص الحيوان لوقف العلامات الحيوية.
- مكان الماوس على المختبرات بحيث أنه يكذب على البطن (الجانب البطني). رذاذ الفأر مع الايثانول 70٪ لتعقيم بيئة العمل. قرصة الجلد حوالي منتصف الطريق إلى أسفل العمود الفقري من الفأرة. باستخدام مقص تشريح التي تم تعقيمها مع الايثانول 70٪، وجعل شق صغير من خلال الجلد. </ لى>
- انتزاع الجلد على جانبي الشق، وسحب الجلد في اتجاهين متعاكسين على امتداد محور الجمجمة، الذيلية من الفأرة. عندما يتم بشكل صحيح، سيتم إزالة الجلد من الذبيحة الكامنة.
- يجب على العنق من الفأرة تظهر الآن العضلات المكشوفة والغدد. قطع بعناية أن الأنسجة وتسحبه نحو الأمامي للفأر باستخدام ملقط، مما يعرض الحنجرة والقصبة الهوائية، والمريء من الفأرة. تجنب قطع حبل الوريد أو الشريان السباتي.
- القصبة الهوائية هي الآن واضحة وغير محددة كما في الأنسجة الغضروفية مع حلقات من حوله. عقد بدقة القصبة الهوائية مع ملقط ورفع بلطف وفصل من القصبة الهوائية والمريء، والذي يقع على الجانب الظهري.
- جعل الأمامي شق صغير إلى واحد حيث يحمل القصبة الهوائية لكن الخلفي إلى الحنجرة. وينبغي أن يتم شق في حوالي الساعة بزاوية 45 درجة مئوية. أيضا، لا القطع تماما القصبة الهوائية، حيث سيؤدي ذلك إلى منعها من التراجع فيتجويف الجسم.
- شغل حقنة سم مكعب 1 مزودة القسطرة القط توم مع برنامج تلفزيوني العقيمة في إعداد لادخال قسطرة في تجويف القصبة الهوائية. عقد القصبة الهوائية باستخدام ملقط وبيدك عقد القسطرة على مقربة من الحافة إلى زيادة مراقبة وضعه برفق في موقع شق القصبة الهوائية. إدراج بلطف قسطرة في القصبة الهوائية حوالي 20 ملم. قبضة القصبة الهوائية التي هي في جميع أنحاء أنبوب قسطرة، وتحرير من جهة أخرى.
- باستخدام حقنة 1 مل مزودة القسطرة، لبث بلطف 0.75 مل من درجة حرارة الغرفة، عقيم في برنامج تلفزيوني في الرئتين ومن ثم نضح بلطف ظهر في برنامج تلفزيوني في حقنة. كرر هذه العملية ثلاث مرات في حين خارجيا تدليك الصدر. قطع المحقنة من القسطرة والاستغناء السائل غسيل في أنبوب الطرد المركزي 15 مليلتر. بعد ملء محقنة مع 0.75 مل من برنامج تلفزيوني جديد وإعادة المحقنة إلى القسطرة، كرر الخطوات من 1.9 و 1.10 ضعف عن كل فأر. قد يكون السائل انتعاش جزئي، والحصول على أقل من فولوم غرست. إذا جمع الخلايا من أكثر من الماوس، ووضع أنبوب 15 مليلتر مع الخلايا التي تحصد على الجليد حتى يتم تنفيذ كافة lavages الرئة.
2. تجهيز حصاد الرئة AMɸ غسيل
- منبذة سائل غسيل في الرئة ز × 250 لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- باستخدام تقنية معقمة، طاف صب في حاوية النفايات المناسبة داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. Resuspend وبيليه الخلية التي يخدش بلطف أنبوب الطرد المركزي في أعلى رف أنبوب اختبار. إضافة 1 مل من المتوسط cAMɸ إلى resuspend الخلايا.
- تعداد الخلايا باستخدام Z1 كولتر مكافحة الجسيمات التي pipetting 20 ميكروليتر من الخلايا في 10 مل من Isoton الثاني مخفف في قارورة كولتر مضادة. أضف 3-4 قطرات من كاشف الثاني انطلق-oglobin التحللي في قارورة، وأحيانا عكس بلطف 3-4 ثم تحميل قارورة عينة على وصفة طبية للحصول على تركيز خلية. تأكد من برمجة العداد مع عامل التخفيف من 2 × 10 4 لعرضتركيز خلية وعدد الخلايا لكل مليلتر.
- تمييع الخلايا إلى 2.5 5 10 س في مل باستخدام cAMɸ المتوسط.
- الاستغناء 2 مل من 2،5 الخلايا × 5/10 ملم في كل بئر من صحن زراعة الأنسجة 6-جيدا.
- لإثراء ل، أطباق AMɸ ثقافة احتضان داخل الحاضنة 37 درجة مئوية مع ترطيب جو 5٪ CO 2 لمدة 6 ساعات للسماح للخلايا على الانضمام إلى قاع البئر. نضح بلطف وطاف حتى لا تعطل الخلايا الملتصقة.
- شطف الآبار باستخدام معقم PBS (الكالسيوم والمغنيسيوم الحرة) لإزالة الخلايا غير ملتصقة والحطام. إضافة 2 مل من المتوسط cAMɸ إلى كل بئر.
- احتضان خلايا بين عشية وضحاها داخل الحاضنة 37 درجة مئوية مع ترطيب جو 5٪ CO 2 قبل إضافة المنشطات. بعد هذه الخطوة تخصيب اليورانيوم، ما يقرب من 87٪ من الخلايا هي ايجابية للبلعم علامات CD11b وF4/80 (الشكل 2C).
3. بالإضافة إلى ذلك من Polyanhydridالنانوية ه والعلاجات التحكم
- افتعال النانوية عبر nanoencapsulation المضادة للمذيب polyanhydride 15. في هذه العملية، تم حل البوليمر في كلوريد الميثيلين (4 درجات مئوية عند تركيز 25 ملغ / مل)، وعجلت في البنتان (-20 درجة مئوية في الميثيلين كلوريد نسبة 1:200: البنتان).
- تزن خارج النانوية polyanhydride باستخدام معقم وزن الورق على التوازن الذي يمكن أن تقيس بدقة كميات ميكروجرام. إضافة إلى الجسيمات أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- Resuspend النانوية في البرد الجليدي cAMɸ. يتم إجراء مثل هذه الحسابات التي يتم إضافتها لا يزيد عن 0.3 مل من المتوسط إلى كل بئر للحصول على تركيز المطلوب من النانوية. الحفاظ على جزيئات معلق على الجليد حتى تتم إضافة النانوية للثقافة أيضا.
- قبل إضافة النانوية على ثقافات AMɸ، يصوتن الجزيئات باستخدام sonicator أعلى مقاعد البدلاء مع microtip. تعقيم microtip عن طريق الرش مع الايثانول 70٪ وwipinز مع Kimwipe معقم قبل صوتنة. يصوتن في 10-20 جول لمدة 30 إلى 45 قاف مع الحفاظ على أنبوب على الجليد. مراقبة تعليق جسيمات متناهية الصغر ظاهريا. إذا لم يتم جسيمات فرقت بما فيه الكفاية، والسماح للتعليق على تعيين على الجليد لمدة 1 2 دقيقة للتأكد من أن جزيئات يقعون تحت درجة حرارة التحول الزجاجي من البوليمر قبل sonicating مرة أخرى لمدة 30 إلى 45 ثانية. القصد من هذه الخطوة هو صوتنة لتفريق نحو كاف النانوية، كما CPTEG 50:50: النانوية CPH تميل إلى تجميع عند تعرضها للبيئة المائية. ومع ذلك، قد يكون بعض المجاميع الصغيرة من الجسيمات النانوية لا تزال في التعليق.
- يجب أن تبقى تعليق جسيمات متناهية الصغر (مشتتة على نحو كاف) على الجليد ويمكن استخدامها على الفور لمنع سابق لأوانه تآكل سطح أو تجميع.
- إزالة الأطباق التي تحتوي على ثقافة AMɸ من الحاضنة ومكان في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. إمالة لوحة في زاوية ما يقرب من 45 درجة وماصة قبالة كمية من ميديأم سوف يضاف هذا الى تعليق جسيمات متناهية الصغر (يجب أن لا تتجاوز 0.3 مل). لا تخل هذه الخلايا الملتصقة عند إزالة المتوسط.
- دوامة تعليق جسيمات متناهية الصغر polyanhydride لفترة وجيزة قبل إضافته إلى الآبار المناسبة. ماصة كمية تعليق جسيمات متناهية الصغر (أي أكثر من 0.3 مل) في البئر معينة (ق)، ومع ذلك، لا ماصة صعودا وهبوطا إلى خلط. ويمكن هذا الإجراء فصل تمسكا AMɸ من البئر. والجزيئات تستقر في قاع البئر والاتصال الخلايا. للدراسات الواردة في هذا التقرير، وكان تركيز النهائي من النانوية شارك في تربيتها مع AMɸ 125 ميكروغرام / مل. المضي قدما في الآبار لاحق ومجموعات العلاج المطلوب. وتشمل مجموعات المراقبة الإيجابية والسلبية، مثل المتوسطة فقط، و 200 نانوغرام / مل lipopolysaccharide (بي إس) إلى الآبار المعينة.
- عودة الأطباق ثقافة إلى 37 درجة مئوية حاضنة مرطب مع جو 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة. دراسات الحركية في المختبر لديناوقد أثبتت ص 48 ساعة لتكون فترة ثقافة الأمثل لتقييم كل من التعبير علامة على سطح الخلية وإفراز خلوى إذ أنه يسمح الوقت الكافي للنسخ وتخليق البروتين تحدث. على الرغم من أن مستويات أعلى من السيتوكينات تتراكم خلال فترة طويلة ثقافة (أي 72 ساعة)، يمكن تقييم التعبير مرتبك الخلية علامة السطح في هذا الوقت عن طريق نقطة مساهمة مستويات مرتفعة من السيتوكينات. لاحظ التغيرات في التعبير علامة السطح قد لا تكون منسوبة مباشرة إلى التحفيز مع النانوية أنفسهم.
4. تقييم AMɸ التنشيط باستخدام التدفق الخلوي
- إعداد مضان تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) العازلة (0.1٪، وأزيد الصوديوم 0.1٪ مصل البقر (BSA)) في 0.1 م الفوسفات مخزنة المالحة (الرقم الهيدروجيني 7.4) قبل حصاد الضامة مطلي التي شاركت في تربيتها مع س النانويةالمنشطات ص.
- تعد تعمل حلول لمنع العازلة والاجسام المضادة. لإعداد كتلة عازلة، تمييع مفتش الفئران (سيغما) وanti-CD16/32 (eBioscience) إلى 1 ملغ / مل و 10 ميكروغرام / مل، على التوالي، في المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية. تمييع لوحة سطح الجسم المضاد علامة في عازلة FACS إما إلى تركيز الشركة المصنعة أو أوصى تركيز المستخدم الأمثل. للنتائج التي قدمت في هذا العمل، لوحة علامة سطح يتكون من أجسام مضادة ضد الثاني MHC، CD86، CD40، وسيري (CD209). كما تشمل مكافحة فأر أجسام مضادة ضد علامات بلعم F4/80 وCD11b في لوحة لتحديد ايجابا على النمط الظاهري بلعم خلال تحليل البيانات. يجب توخي الحذر عند اختيار أجسام مضادة ضد جزيئات MHC الثاني، كما سلالات الفئران الفطرية غالبا ما تختلف في النسخ المتنوعة التي الثاني MHC. يجب على أجسام مضادة تتفاعل مع تحديد alloantigens في MHC المحددة التي أعربت عنها سلالة الفأرة من الفائدة.
- بعد 48 ساعة من الحضانة مع النانوية و / أوالمنشطات، وأطباق مكان زراعة الخلايا على الثلج لمدة 20 دقيقة. لإزالة الضامة ملتصق من لوحات، وتتخلص من الآبار بلطف مع مكشطة الخلية 24 سم.
- باستخدام ماصة 5 مل المصلية، نضح بلطف الخلايا والمتوسطة صعودا وهبوطا خمس مرات لتوليد تعليق خلية واحدة. ماصة محتويات الآبار الفردية في فصل 5 أنابيب البولي ستايرين مل حتى لا تختلط معا الخلايا من علاجات تجريبية مختلفة.
- إضافة 2 مل من عازلة نظام مراقبة الأصول الميدانية إلى كل أنبوب.
- منبذة أنابيب من الخلايا في ز × 250 في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- صب طاف وبلطف resuspend بيليه الخلية في السوائل المتبقية عن طريق نبش أنابيب عبر الجزء العلوي من أنبوب اختبار رف.
- من أجل منع غير محددة وملزمة من الاجسام المضادة، إضافة 10 ميكرولتر من العازلة حظر (أعد 4.2) إلى كل أنبوب من الخلايا. أنابيب دوامة واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- إضافة حجم مناسب من الاجسام المضادة المخفف إلى كل أنبوب وincubأكلت في الظلام على الجليد لمدة 15 دقيقة. وينبغي أن الأنابيب التي تحتوي على عينات لتحليلها تظهر مجموعة من الأجسام المضادة لوحة polycromatic (التحسين السابقة من الجمع بين الأضداد ينبغي أن يقوم بها مختبرات الفردية). وينبغي أن تدرج جماعات مراقبة إضافية لتعيين بشكل صحيح المعلمات الاستحواذ على تدفق عداد الكريات، بما في ذلك أنبوب من الخلايا التي لم توسم، وأنابيب التعويضات التي تتوافق مع الخلايا المسماة باستخدام كل لون واحد على حدة. لتعيين بشكل صحيح البوابات لتحليل تدفق cytometric، والإسفار ناقص واحد وينبغي أن (FMO) تدرج الضوابط خلال اكتساب. ضوابط FMO هي خلايا المسمى مع جميع الأجسام المضادة ملون تألقي مترافق والتي يتم استخدامها على لوحة ما عدا واحد هو أن يحل محله سيطرتها isotype منها. وينبغي أيضا السكان الإيجابية والسلبية (أي aliquots منفصل من الخلايا تعامل مع منبه مراقبة إيجابية والمتوسطة وحدها) أن تدرج في FMO وأنابيب التحكم التعويض.
- صب طاف وresuspend بيليه الخلية في السوائل المتبقية عن طريق نبش أنابيب عبر الجزء العلوي من أنبوب اختبار رف.
- إذا كانت لوحة الجسم المضاد يتكون من الأجسام المضادة لا مترافق مباشرة إلى ملون تألقي لكن بدلا من ذلك مترافق البيوتين، وهناك حاجة إلى streptavidin ملون تألقي مترافق لتصور علامة السطح. في هذه الخطوة، إضافة حجم مناسب من streptavidin ملون تألقي مترافق المخفف واحتضان في الظلام لمدة 15 دقيقة على الجليد. كما هو الحال في 4،2، سوف تضعف streptavidin إلى تركيز موصى بها من قبل الشركة المصنعة أو إلى أحد الأمثل من قبل المستخدم. وهناك حاجة فقط هذه الخطوة من أجل الألواح التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية المعقدة البيروكسيديز.
- نفذ خطوة الغسيل كما هو موضح في 4.10.
- تخفيف حدة تخزين مناسبة دينار بحريني استقرار 01:03 مثبت في الماء منزوع الأيونات. أضف 100 ميكروليتر من مثبت المخفف إلى كل أنبوب بينما VO بلطفrtexing لمنع تكتل من الخلايا. ويمكن تسمية الخلايا وثابتة تخزين ثابت في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد تقريبا قبل حيازتها على تدفق عداد الكريات.
5. ممثل بيانات
وكان النانوية ملفقة في الخطوة 3.1 متوسط يبلغ قطرها من 163 ± 24 نانومتر والتشكل بما يتفق مع تلك التي تم الحصول عليها في دراسات سابقة 5،16. وترد النانوية في حل قبل وبعد صوتنة في الشكل رقم 1 للتدليل على ضرورة صوتنة لضمان الانتشار الكافي للجسيمات. ويظهر تحليل تدفق cytometric من AMɸs تحصد التي تم الحصول عليها عن طريق غسيل الرئة في الشكل 2. وصفها الخلايا مع مزيج من مكافحة فأر CD11b ومكافحة الفأر F4/80 الأجسام المضادة، فضلا عن الضوابط المقابلة FMO يسمح لإنشاء خلفية وضع العلامات، وتحديد AMɸs والمعزولة لمزيد من التحليل. العلاج من الضامة السنخية مع polyanhydrideالنانوية يعزز التنشيط كما يتضح من زيادة كثافة مضان متوسط الثاني MHC، CD40، CD86، وسيري (الشكل 3).
. الشكل 1 50:50 CPTEG: CPH النانوية قبل (A) وبعد ق 30 (ب) من صوتنة.
الشكل 2. تحليل تدفق cytometric الضامة السنخية المقطوع المسمى مع فلور اليكسا (A) 700 المضادة للCD11b وPE-Cy7 تحكم FMO، (B) اليكسا فلور 700 تحكم FMO وanti-F4/80 PE-Cy7 و (C ) اليكسا فلور 700 المضادة للCD11b وanti-F4/80 PE-Cy7. الرقم في أعلى الزاوية اليمنى يمثل النسبة المئوية للالمزدوج إيجابية الخلايا.
الشكل 3. المدرج الإحصائي مما يدل على زيادة في inten مضانsity للتعبير عن سطح الثاني MHC (A)، CD40 (B)، CD86 (C) وسيري (D) بعد ثقافة مشتركة من البلاعم السنخية مع CPTEG 50:50: polyanhydride CPH النانوية لمدة 48 ساعة. رسوم بيانية تصور نتائج AMɸ وصفها بأنها تحكم FMO ( 
)، غير المعالجة AMɸ المسمى مع الأجسام المضادة ضد كل علامات سطح الخلية ( 
) وAMɸ ثقافي والنانوية وصفت مع الأجسام المضادة ضد كل علامات سطح الخلية ( 
).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أظهرت منصات Polyanhydride جسيمات متناهية الصغر لقاح فعالية عندما تدار الأنف في نظم جرعة واحدة 5. قياس تفعيل السكان الخلية البلعمية المقيمين في الرئتين الناجمة عن هذا اللقاح منصة تسليم تصاريح تقييم قدرتها المحتملة في نهاية المطاف إلى تعزيز الاستجابات المناعية التكيفية.
على وجه التحديد، حصاد الضامة السنخية من السوائل غسيل الرئة ومعاملتهم مع تركيبات مختلفة من الجسيمات النانوية يقدم لمحات من قدرات كيمياء الجسيمات مختلفة لتفعيل الضامة، مما أدى إلى تقديم المستضد 6،8. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الدراسات في المختبر هي مفيدة لتقييم قدرة هذه المستحضرات مساعد الجسيمات لتنشيط البلاعم السنخية قبل الشروع في أكبر وأكثر تعقيدا في الدراسات المجراة. وينبغي أن تحتوي على التجارب دائما معاملة إيجابية للسيطرة السطحيةه علامة حتى التنظيم، مثل LPS، ناهض من تول مثل مستقبلات 4. ينبغي توخي الحذر في التخطيط للتجارب قبل حصاد الضامة السنخية مثل هذا البروتوكول قد لا ينتج عدد كاف من الخلايا اللازمة للمعالجات متعددة في تجربة واحدة. قد lavages الرئة ولذلك هناك حاجة إلى أن يقوم على الفئران متعددة لضمان أعداد كافية الخلية (~ 5.0 × 10 5 خلايا لكل الماوس) للحصول على أكبر التجارب مع مجموعات أكثر علاج. تقنيات غسل الرئة كما تم الإبلاغ عن الأنواع الأخرى، وكمية السوائل المستخدمة يتناسب مع الأنواع التي تجري دراستها (أي الماوس قدرة الرئة هو 1 مل، الفئران قدرة الرئة هو 10 مل والقدرات البشرية الرئة هو 6 L 17.
تصاغ النانوية Polyanhydride وتخزينها في شكل مسحوق جاف لمنع سابق لأوانه تآكل السطح. بسبب التفاعلات التي تؤدي إلى ثابت التثاقل من الجسيمات، صوتنة ضروري قبل بالإضافة إلى مزارع الخلايا. هذه الصورةTEP يسمح لتوزيع الزي الرسمي، ويؤدي إلى نتائج أكثر قابلية للتكرار. معقد القياس الكمي للعلامات على سطح الخلية الضامة السنخية باستخدام التدفق الخلوي بواسطة إشارات قوية تألق ذاتي. ويمكن التغلب على هذه العقبة عن طريق تحسين تركيز الضد نظام مراقبة الأصول الميدانية، وتوليفات ملون تألقي متعدد الألوان، والمعلمات تدفق القبض على الخلوي (أي استخدام ضوابط التعويض). ضوابط FMO تسمح للتغيير معلمة واحدة فلوري في وقت واحد، هي مفيدة لوضع بوابات لكل الأضداد وتمكين الكمي الصحيح من سطح الخلية التعبير علامة. وينبغي أيضا اختلافات في سلالات من الفئران يعتبر في اختيار من الأجسام المضادة، ولا سيما خصوصية النمط الفرداني الثاني MHC.
من المهم أن يكون أساليب موحدة لتحديد تنشيط الخلايا مستضد تقديم في الرئة، وهذا سيسهل كثيرا من المقارنات بين المختبرات الحيوية رواية والمؤسسات المختلفة. الجنرالبتوليد السكان ثابت من البلاعم السنخية من خلال الأساليب المقدمة هنا، وتوفير الظروف المثلى للحصول على البيانات المفيدة عن تركيبات مختلفة من الجسيمات النانوية وإمكاناتها وتعزيز المناعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر للبحوث الطبية للقوات المسلحة الامريكية والعتاد القيادة (أرقام المنح W81XWH-09-1-0386 وW81XWH-10-1 0806-) للحصول على الدعم المالي والدكتور شون ريجبي من مرفق جامعة ولاية ايوا التدفق الخلوي لل له المساعدة من الخبراء التقنيين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B.
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R.
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
