Summary
Qui, descriviamo i protocolli per la raccolta murini macrofagi alveolari, che risiedono le cellule immunitarie innate nei polmoni, e di esaminare la loro attivazione in risposta a co-coltura con nanoparticelle polianidride.
Abstract
Nanoparticelle biodegradabili sono emersi come una piattaforma versatile per la progettazione e realizzazione di nuovi vaccini intranasali contro le malattie infettive respiratorie. In particolare, polianidride nanoparticelle composto di acido alifatico sebacico (SA), il aromatico 1,6-bis (p-carbossifenossi) esano (CPH), o il anfifilo 1,8-bis (p-carbossifenossi) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) visualizzare massa unica e cinetica di erosione superficiale e 1,2 può essere sfruttata per rilasciare lentamente biomolecole funzionali (ad esempio, antigeni proteici, immunoglobuline, ecc) in vivo 3,4,5. Queste nanoparticelle possiedono anche attività adiuvante intrinseca, che li rende una scelta eccellente per una piattaforma di distribuzione vaccino 6,7,8.
Al fine di chiarire i meccanismi che regolano l'attivazione dell'immunità innata a seguito di vaccinazione della mucosa nasale, bisogna valutare le risposte molecolari e cellulari della p antigenecellule risentirsi (APC) responsabili per l'avvio di risposte immunitarie. Le cellule dendritiche sono le principali APC si trovano nella conduzione delle vie aeree, mentre i macrofagi alveolari (AMɸ) predominano nel parenchima polmonare 9,10,11. AMɸ sono altamente efficienti in compensazione nei polmoni di agenti patogeni microbici e detriti cellulari 12,13. Inoltre, questo tipo di cellule gioca un ruolo importante nel trasporto di antigeni microbici ai linfonodi drenanti, che è un primo passo importante nella apertura di una risposta immunitaria adattativa 9. AMɸ esprimono anche livelli elevati di pattern recognition innata e recettori scavenger, secernono mediatori pro-infiammatori, e prime cellule T naive 12,14. Una popolazione relativamente pura di AMɸ (ad esempio, superiore al 80%) può essere facilmente ottenuta mediante lavaggio polmonare per studi in laboratorio. Resident AMɸ raccolte da animali immuni competenti forniscano un fenotipo rappresentante dei macrofagi che encounter la particella vaccino basato in vivo. Qui, descriviamo i protocolli utilizzati per la raccolta e la cultura AMɸ da topi ed esaminare il fenotipo attivazione dei macrofagi in seguito al trattamento con le nanoparticelle polianidride in vitro.
Protocol
1. Raccolta macrofagi alveolari (AMɸ) dal mouse attraverso il lavaggio del polmone
- Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) come un camice da laboratorio, guanti monouso e protezione per gli occhi.
- Preparare completa AMɸ (cAMɸ) mezzo prima dell'inizio della raccolta. Aggiungere 2,5 ml di penicillina / streptomicina (pen / strep) soluzione, 250 pl di β-mercaptoetanolo (2-mercaptoetanolo), e 25 mL di calore inattivato siero fetale bovino (FBS), a 222,25 ml di Dulbelcco Modified Eaglès Medium (DMEM). Filtro-sterilizzare medie cAMɸ utilizzando un 0,2 micron pori del filtro bottiglia formato superiore sotto vuoto.
- Eutanasia un topo sano CO 2 asfissia in una camera euthanization. Sebbene un topo C57BL / 6 (6-8 settimane) è stato utilizzato per gli scopi di questo progetto, questa tecnica lavaggio polmonare possono essere eseguite su qualsiasi ceppo di topo. Utilizzando una bombola di gas compresso, lasciate flusso di gas nella camera per 1 minuto prima immissione del topo nel capambra per assicurare che la camera è completamente carica con CO 2. Posizionare il mouse nella camera per almeno un minuto a eutanasia il mouse. Inoltre, ciascun topo exsanguinate tramite puntura cardiaca come metodo fisico per confermare la morte topo come descritto in 1,4.
- Lay mouse sul retro (lato dorsale), a spruzzo con 70% etanolo, individuare lo sterno e, ad un angolo di 30 gradi con l'addome, inserire un ago di 23 gauge (attaccato ad una siringa da 1 ml) di circa 50 mm nella cavità toracica . Con corretto posizionamento dell'ago, dovrebbe essere possibile raccogliere tra 0,4 e 1 ml di sangue a seconda delle dimensioni del mouse. Esaminare l'animale per la cessazione dei segni vitali.
- Luogo del mouse sul banco di laboratorio in modo che è sdraiato sul suo addome (lato ventrale). Spray del mouse con il 70% di etanolo per sterilizzare l'ambiente di lavoro. Pizzica la pelle circa a metà strada lungo la spina dorsale del mouse. Dissezione con forbici che sono stati sterilizzati con etanolo al 70%, fanno una piccola incisione attraverso la pelle. </ Li>
- Afferra la pelle su entrambi i lati dell'incisione e tirare la pelle in direzioni opposte lungo il cranio-caudale asse del mouse. Se eseguita correttamente, la pelle viene rimosso dalla carcassa sottostante.
- Il collo del mouse dovrebbe ora mostrare i muscoli e le ghiandole esposti. Tagliare con cautela che il tessuto e tirarlo verso la parte anteriore del mouse utilizzando una pinza, esponendo così la laringe, trachea, esofago e del mouse. Evitare di tagliare la vena giugulare o carotide.
- La trachea è ora visibile ed è identificabile come il tessuto con anelli cartilaginei intorno ad esso. Delicatamente tenere la trachea con una pinza e delicatamente sollevare e separare la trachea dall'esofago, che si trova sul lato dorsale.
- Fai una piccola incisione anteriore al punto in cui si sostiene la trachea, ma posteriore alla laringe. L'incisione dovrebbe essere effettuato a circa 45 ° gradi. Inoltre, non completamente transetto della trachea, in quanto ciò gli impedirà di rientro inla cavità del corpo.
- Riempire una siringa da 1 cc munito di un catetere Cat Tom con PBS sterile in preparazione per inserire il catetere nel lume della trachea. Tenere la trachea utilizzando una pinza e con la mano tenere il catetere in prossimità della punta per aumentare il controllo e delicatamente inserirlo nel sito di incisione tracheale. Inserire delicatamente catetere nella trachea circa 20 mm. Afferrare la trachea che è attorno al tubo del catetere, liberando dall'altro.
- Uso di una siringa da 1 ml munito del catetere, delicatamente infondere 0,75 mL di temperatura ambiente, PBS sterile nei polmoni e poi delicatamente aspirare il retro PBS in siringa. Ripetere questa operazione per tre volte mentre esternamente massaggiare il torace. Scollegare la siringa dal catetere ed erogare il liquido di lavaggio in una provetta da centrifuga da 15 mL. Dopo aver riempito la siringa con 0,75 mL di PBS fresco e ricollegando la siringa al catetere, ripetere i punti 1,9 e 1,10 volte per ogni mouse. Il recupero del fluido può essere parziale, ottenendo inferiore VOLume infuso. Se la raccolta di cellule provenienti da più di un mouse, posizionare il tubo di 15 ml con le cellule raccolte sul ghiaccio fino a quando tutti lavaggi polmonari sono stati effettuati.
2. Elaborazione di lavaggio polmonare AMɸ Harvest
- Centrifugare liquido di lavaggio del polmone a 250 x g per 10 min a 4 ° C.
- Usando una tecnica sterile, supernatante decantare in idoneo contenitore per rifiuti all'interno di un armadio biosicurezza. Risospendere il pellet di cellule delicatamente rastrellando il tubo da centrifuga attraverso la parte superiore di un rack provetta. Aggiungere 1 mL di terreno cAMɸ per risospendere le cellule.
- Enumerare le cellule utilizzando un contatore di particelle Coulter Z1 pipettando 20 microlitri di cellule in 10 ml di diluente ISOTON II in flaconcino contatore Coulter. Aggiungere 3 o 4 gocce di Zap-oglobin reagente litico II nel flaconcino, capovolgere delicatamente da 3 a 4 volte e poi caricare il flacone di campione sul bancone per ottenere una concentrazione cellulare. Assicurarsi di programmare il contatore con un fattore di diluizione di 2 x 10 4 per visualizzare ilconcentrazione cellulare come il numero di cellule per ml.
- Diluire le cellule a 2,5 x 10 5 per mL utilizzando mezzo cAMɸ.
- Distribuire 2 mL di 2,5 x 10 5 cellule / ml in ciascun pozzetto di una 6-ben piatto di coltura di tessuti.
- Per arricchire per AMɸ, le piastre di coltura all'interno di incubare a 37 ° C incubatore umidificato con un 5% di CO 2 ambiente per 6 h per permettere alle cellule di aderire al fondo del pozzo. Aspirare delicatamente il supernatante di non perturbare cellule aderenti.
- Risciacquare le pozzetti usando PBS sterile (calcio e magnesio libero) per rimuovere le cellule non aderenti e detriti. Aggiungere 2 mL di terreno cAMɸ a ciascun pozzetto.
- Incubare le cellule all'interno notte a 37 ° C incubatore umidificato con un 5% di CO 2 ambiente prima dell'aggiunta di stimolanti. Dopo questa fase di arricchimento, circa il 87% delle cellule sono positive per il macrofago CD11b marcatori e F4/80 (figura 2c).
3. Aggiunta di PolyanhydridNanoparticelle e trattamenti elettronici di controllo
- Fabbricare nanoparticelle tramite polianidride anti-solvente nanoencapsulation 15. In questo processo, il polimero viene sciolto in cloruro di metilene (4 ° C ad una concentrazione di 25 mg / mL) e si precipita in pentano (-20 ° C ad un rapporto 1:200 cloruro di metilene: pentano).
- Pesare con nanoparticelle polianidride sterilizzato pesano carta su un saldo che può misurare con precisione gli importi microgrammi. Aggiungere particelle in una provetta da 1,5 ml.
- Risospendere le nanoparticelle in ghiacciata cAMɸ. I calcoli sono fatti in modo tale che non più di 0,3 mL di mezzo viene aggiunto a ciascun pozzetto per ottenere la concentrazione desiderata di nanoparticelle. Conservare le particelle risospeso in ghiaccio fino a quando le nanoparticelle sono aggiunti alla coltura bene.
- Prima di aggiungere le nanoparticelle alle culture AMɸ, sonicare particelle utilizzando un sonicatore banco con una micropunta. Sterilizzare microtip a spruzzo con il 70% di etanolo e wiping con un Kimwipe sterile prima della sonicazione. Sottoporre ad ultrasuoni a 10-20 joule per 30 a 45 s mantenendo la provetta in ghiaccio. Osservare macroscopicamente la sospensione di nanoparticelle. Se le particelle non sono sufficientemente disperse, consentono di impostare la sospensione su ghiaccio per 1 a 2 min per garantire che le nanoparticelle sono sotto della temperatura di transizione vetrosa del polimero prima sonicazione nuovamente per 30 a 45 secondi. Lo scopo di questo passo è sonicazione per disperdere adeguatamente le nanoparticelle, come CPTEG 50:50: nanoparticelle CPH tendono ad aggregarsi quando esposto ad un ambiente acquoso. Tuttavia, alcuni piccoli aggregati di nanoparticelle possono rimangono in sospensione.
- Sospensione di nanoparticelle (adeguatamente dispersa) dovrebbero essere tenuti in ghiaccio e possono essere usate immediatamente per prevenire prematura erosione superficiale o di aggregazione.
- Rimuovere le capsule di Petri contenenti il AMɸ da incubatore e il luogo nel quadro di biosicurezza. Piastra Tilt a circa un angolo di 45 gradi e fuori pipetta la quantità di medium che verrà aggiunto alla sospensione nanoparticelle (non dovrebbe superare 0,3 mL). Non disturbare le cellule aderenti durante la rimozione del mezzo.
- Vortex la sospensione di nanoparticelle polianidride brevemente prima di aggiungerlo nei pozzetti appropriati. Pipettare la quantità di sospensione nanoparticelle (non più di 0,3 mL) nel bene specifico (s), tuttavia, non pipettare su e giù per miscelare. Questa azione potrebbe staccare l'aderente AMɸ dal pozzo. Le particelle si depositano sul fondo del pozzo e contattare le cellule. Per gli studi indicati in questo rapporto, la concentrazione finale di nanoparticelle di co-coltura con l'AMɸ era di 125 mg / mL. Procedere con pozzetti successivi e gruppi di trattamento desiderato. Include gruppi di controllo positivi e negativi, come unico mezzo e 200 ng / mL lipopolisaccaride (LPS) per pozzetti.
- Riportare le piastre di coltura ai 37 ° C incubatore umidificato con un 5% di CO 2 nell'atmosfera per 48 ore. Studi cinetici nel nostro laboratory hanno dimostrato 48 ore per essere il periodo di coltura ottimale per valutare sia espressione sulla superficie cellulare marcatore e secrezione di citochine in quanto permette di tempo adeguato per la trascrizione e la sintesi proteica a verificarsi. Sebbene maggiori livelli di citochine accumulano durante un prolungato periodo di coltura (cioè, 72 ore), valutando l'espressione sulla superficie cellulare marcatore a questo punto nel tempo può essere confuso con il contributo degli elevati livelli di citochine. Le variazioni di espressione di superficie marcatore osservato non può essere direttamente attribuibile alla stimolazione con le stesse nanoparticelle.
4. La valutazione di attivazione AMɸ in citometria a flusso
- Preparare fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) tampone (0,1% di sodio azide e 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA)) in 0,1 M di fosfato di soluzione salina tamponata (pH 7,4) prima di raccogliere i macrofagi placcati che sono state co-coltivate con nanoparticelle or stimolanti.
- Preparare soluzioni di lavoro del tampone di bloccaggio e gli anticorpi monoclonali. Per preparare il buffer blocco, diluire IgG di ratto (Sigma) e anti-CD16/32 (eBioscience) a 1 mg / ml e 10 ug / ml, rispettivamente, in tampone FACS. Diluire marcatore di superficie del pannello di anticorpi in un tampone FACS sia alla concentrazione consigliati dal produttore o la concentrazione utente ottimizzata. Per i risultati presentati in questo lavoro, il pannello marcatore di superficie è costituito da anticorpi contro MHC II, CD86, CD40 e il CIRE (CD209). Anti-topo anticorpi contro i marcatori macrofagi F4/80 e CD11b sono anche inclusi nel pannello di identificare il fenotipo macrofago durante l'analisi dei dati. Si deve prestare attenzione nella scelta di anticorpi contro molecole MHC II, come ceppi di topi inbred spesso differiscono nelle loro aplotipi MHC II. Gli anticorpi selezionati dovranno reagire con le alloantigeni specifici MHC espresse dal ceppo di topi di interesse.
- Dopo 48 h di incubazione con nanoparticelle e / ostimolanti, luogo di coltura di cellule piatti sul ghiaccio per 20 min. Per rimuovere i macrofagi aderenti dalle piastre, raschiare delicatamente pozzetti con un raschietto cella di 24 cm.
- Usando una pipetta da 5 mL sierologica, aspirare delicatamente le cellule ed il mezzo su e giù cinque volte per generare una sospensione di cellule singole. Pipettare i contenuti dei singoli pozzetti in provette di polistirene 5 mL separati in modo da non mescolare le cellule provenienti da diversi trattamenti sperimentali.
- Aggiungere 2 mL di tampone FACS a ciascuna provetta.
- Provette da centrifuga di cellule a 250 x ga 4 ° C per 10 min.
- Decantare il surnatante e Risospendere delicatamente pellet di cellule in liquido residuo da rastrellare i tubi nella parte superiore di un rack provetta.
- Al fine di prevenire il legame non specifico degli anticorpi monoclonali, aggiungere 10 ul di tampone di bloccaggio (preparato in 4,2) a ciascun tubo di cellule. Tubi vortex e incubare in ghiaccio per 30 min.
- Aggiungere il volume appropriato di anticorpi monoclonali diluiti in ogni provetta e incubmangiato al buio in ghiaccio per 15 min. Tubi che contengono i campioni da analizzare deve ricevere la combinazione di anticorpi del pannello policromo (ottimizzazione precedente di combinazione di anticorpi deve essere eseguita da laboratori individuali). Altri gruppi di controllo dovrebbero essere inclusi per impostare correttamente i parametri di acquisizione sul citometro a flusso, compreso un tubo di cellule che non sono stati etichettati, e tubi di compensazione che corrispondono alle cellule marcate usando ogni singolo colore separatamente. Per impostare correttamente le porte per l'analisi di citometria di flusso, la fluorescenza Minus One (FMO) controlli dovrebbero essere inclusi durante l'acquisizione. Controlli FMO sono cellule marcate con tutti gli anticorpi fluorocromo-coniugati che vengono utilizzati sul pannello tranne uno che viene sostituito dal suo rispettivo controllo isotipico. Popolazioni positivi e negativi (ossia, separare le aliquote di cellule trattate con uno stimolante controllo positivo e medium da solo) dovrebbero essere inclusi in FMO provette di controllo e di compensazione.
- Decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in liquido residuo da rastrellare i tubi nella parte superiore di un rack provetta.
- Se il pannello anticorpo è costituito da un anticorpo non coniugato direttamente ad un fluorocromo, ma è invece coniugato a biotina, un fluorocromo streptavidina coniugata è necessario per visualizzare il marcatore di superficie. In questa fase, aggiungere un volume appropriato di diluita fluorocromo streptavidina coniugata e incubare al buio per 15 min in ghiaccio. Come in 4,2, la streptavidina viene diluito ad una concentrazione raccomandata dal produttore o di una ottimizzata da parte dell'utente. Questo passo è necessario solo per pannelli contenenti biotinilati anticorpi primari.
- Eseguire una fase di lavaggio, come descritto in 4.10.
- Diluire un volume adeguato di fissativo 01:03 BD stabilizzare in acqua deionizzata. Aggiungere 100 ml di fissativo diluito in ogni provetta mentre delicatamente vortexing per evitare grumi di cellule. Cellule marcate e può essere stabilmente fissato conservata al buio a 4 ° C per circa una settimana prima di acquisizione su un citometro a flusso.
5. Dati rappresentativi
Nanoparticelle fabbricati in fase 3,1 avevano un diametro medio di 163 ± 24 nm e una morfologia coerente con quello ottenuto in studi precedenti 5,16. Nanoparticelle in soluzione prima e dopo sonicazione sono mostrati in Figura 1 per dimostrare la necessità di sonicazione per garantire un'adeguata dispersione delle particelle. L'analisi citofluorimetrica delle AMɸs raccolte ottenuta tramite lavaggio polmonare è mostrato in Figura 2. Etichettare cellule con una combinazione di anti-topo CD11b e anti-topo F4/80 anticorpi così come i controlli corrispondenti FMO permette di stabilire l'etichettatura sfondo, identificando AMɸs e gating per ulteriori analisi. Trattamento dei macrofagi alveolari con polianidridenanoparticelle migliora attivazione come mostrato dalla maggiore intensità di fluorescenza media di MHC II, CD40, CD86, e CIRE (Figura 3).
. Figura 1 50:50 CPTEG: CPH nanoparticelle prima (A) e dopo (B) 30 s di sonicazione.
Figura 2. Analisi citofluorimetrica delle raccolte macrofagi alveolari contrassegnati con (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b e il PE-Cy7 FMO Control, (B) Alexa Fluor 700 FMO controllo e la PE-Cy7 anti-F4/80 e (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b e PE-Cy7 anti-F4/80. Il numero nell'angolo in alto a destra rappresenta la percentuale di cellule positive doppio.
Figura 3. Istogrammi dimostrando un aumento della fluorescenza intensitàsità per l'espressione superficie di MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) e CIRE (D) dopo co-coltura di macrofagi alveolari con 50:50 CPTEG: polianidride CPH nanoparticelle per 48 ore. Gli istogrammi rappresentano risultati per AMɸ etichettati come controlli (FMO 
), Non trattata AMɸ marcato con anticorpi contro marcatori di superficie tutti i cellulari ( 
) E AMɸ coltivate con nanoparticelle ed etichettati con anticorpi contro marcatori di superficie tutti i cellulari ( 
).
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Discussion
Polianidride piattaforme vaccino nanoparticelle hanno dimostrato l'efficacia se somministrato per via intranasale in regimi monodose 5. Misurazione l'attivazione delle cellule fagocitiche popolazioni residenti nei polmoni indotti dalla piattaforma di mandata vaccino consente di valutare la potenziale capacità di promuovere in definitiva risposte immunitarie adattative.
In particolare, la raccolta macrofagi alveolari del polmone dal liquido di lavaggio e trattarli con diverse formulazioni delle nanoparticelle fornisce intuizioni le capacità di particelle chimiche diverse per attivare i macrofagi, che porta alla presentazione dell'antigene 6,8. Inoltre, questi studi in vitro sono utili per valutare la capacità di queste formulazioni adiuvanti particolato per attivare i macrofagi alveolari prima di intraprendere più grandi e complessi studi in vivo. Esperimenti deve sempre contenere un trattamento di controllo positivo per tensioattivomarcatore e up-regulation, come LPS, un agonista del recettore Toll-like 4. Si deve prestare attenzione nel progettare gli esperimenti precedenti il raccolto dei macrofagi alveolari in quanto tale protocollo non può produrre un numero sufficiente di cellule necessarie per i trattamenti multipli in un esperimento. Lavaggi polmonari può quindi bisogno di essere eseguito sui topi più a garantire un numero adeguato di cellule (~ 5,0 x 10 5 cellule per mouse) per i più grandi esperimenti con i gruppi di trattamento. Tecniche di lavaggio polmonari sono stati riportati anche per altre specie, e la quantità di liquido utilizzata è proporzionale alla specie oggetto di studio (cioè, la capacità polmonare topo è 1 mL, capacità polmonare ratto è 10 mL e capacità polmonare umano è 6 L 17.
Nanoparticelle polianidride sono formulati e memorizzati in forma di polvere secca per prevenire prematura erosione superficiale. A causa di interazioni elettrostatiche che provocano aggregazione delle particelle, sonicazione è necessario prima dell'aggiunta di colture cellulari. Questo sconsente tep per la distribuzione uniforme e porta a risultati più riproducibili. La quantificazione di marcatori cellulari di superficie sui macrofagi alveolari in citometria a flusso è complicata da forti segnali di autofluorescenza. Questo ostacolo può essere superato attraverso l'ottimizzazione concentrazioni anticorpali FACS, policromatici combinazioni fluorocromo, e il flusso di parametri di acquisizione di citometria (cioè, l'uso di controlli di compensazione). Controlli FMO consentire la modifica di un parametro fluorescente alla volta, sono utili per impostare cancelli per ciascun anticorpo e consentire corretta quantificazione di espressione marcatore di superficie cellulare. Le differenze nei ceppi di topi dovrebbe essere considerata anche la selezione di anticorpi, in particolare specificità aplotipo di MHC II.
E 'importante disporre di metodi standardizzati per determinare l'attivazione delle cellule presentanti l'antigene del polmone, in quanto ciò faciliterà notevolmente il confronto di biomateriali innovativi tra i diversi laboratori e istituzioni. Genche hanno collaborato popolazioni consistenti di macrofagi alveolari, attraverso i metodi qui presentati, offrono le condizioni ottimali per ottenere dati utili riguardanti diverse formulazioni di nanoparticelle e il loro potenziale immunitario migliorando.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare l'US Army Medical Research e Materiel Command (numeri di sovvenzione W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) per il sostegno finanziario e il dottor Shawn Rigby dal Fondo Iowa State Citometria a flusso per l'Università la sua assistenza tecnica di esperti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
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