Summary
يوصف أداة مفيدة لتحليل آثار المخدرات، وعوامل النمو، و / أو خلايا التلاعب في نموذج حيواني لإصلاح الجرح. وتستخدم هذه التقنية الخصائص من الاسفنج البولي فينيل (PVA) لتقديم المشروبات الكحولية، وتحتوي على علاج المطلوب، وأيضا توفير منبر يمكن استئصاله وتحليلها.
Abstract
التئام الجروح هو معقد، عملية متعددة الخطوات التي تنطوي على العديد من أنواع الخلايا، وعوامل النمو والمركبات 1-3. وبسبب هذا التعقيد، ودراسات التئام الجروح هي الأكثر شمولا عندما نفذت في الجسم الحي. وهناك العديد من النماذج في الجسم الحي المتاحة لدراسة حاد التئام الجروح، بما في ذلك الجراحي، والفضاء، استئصالية الميت، وحروق. نماذج الفضاء القتلى هم الاصطناعي، ويزرع التي يسهل اختراقها والتي تستخدم لدراسة تشكيل الأنسجة وآثار المواد على الجرح. بعض النماذج الفضاء الميت تستخدم عادة تشمل البولي فينيل الكحول (PVA) الإسفنج، واسطوانات شبكة أسلاك الفولاذ، وسعت بولي تترافلوروإيثيلين مادة (ePTFE)، و1،2 Cellstick.
كل نموذج الفضاء الميت والقيود الخاصة بها على أساس تركيب المواد الأولية وغرس الأساليب. وشبكة أسلاك الفولاذ نموذج اسطوانة لديه مرحلة متخلفة من تسلل بعد غرس ويتطلب قدرا طويلة من الزمن قبل تشكيل النسيج الحبيبي begiنانوثانية 1. ويتم تحليل أفضل مراحل لاحقة من التئام الجروح باستخدام نموذج 1،4 ePTFE. وCellstick ليفة السليلوز داخل نموذج أنبوب السيليكون الذي يستخدم عادة لدراسة الجروح جراحة الإنسان وجرح السائل 2. ويقتصر الاسفنجة بولي لدراسات حاد لأنه مع الوقت أن تبدأ في إثارة رد فعل الجسم الغريب الذي يؤدي إلى رد فعل الخلية العملاقة في الحيوان 5. خلافا لغيرها من المواد، والإسفنج PVA سهلة لإدخال وإخراج، مصنوعة من مواد خاملة وغير القابلة للتحلل، وحتى الآن هي لينة بما يكفي لتكون مقطوع للتحليل النسيجي 2،5.
في التئام الجروح الاسفنجة بولي أمر مفيد للغاية لتحليل تحبيب تكوين الأنسجة، وترسب الكولاجين، وجرح تكوين السائل، وآثار المواد على عملية الشفاء 1،2،5. بالإضافة إلى استخدامه في دراسة مجموعة واسعة من سمات من التئام الجروح، كما تم الاسفنجة بولي المستخدمة في العديد من أنواع أخرى من الدراسات. انها ساعةكما استخدمت للتحقيق في الأوعية الدموية السرطانية، تسليم المخدرات وبقاء الخلية الجذعية وengraftment 1،2،6،7. مع تحريف الكبير، الاستخدام المكثف قبل، والنتائج التي يمكن استنساخه، الاسفنجة بولي هو نموذج مثالي ل1،2 العديد من الدراسات.
هنا، فإننا سوف تصف إعداد وغرس واسترجاعها من الأقراص الاسفنجة بولي (الشكل 1) في الفأر نموذج من التئام الجروح.
Protocol
1. الاسفنجة تحضير
- هيدرات الإسفنج خلال إثارة بين عشية وضحاها في 0.9٪ (W / V) مائي محلول كلوريد الصوديوم.
- تطهير اسفنجات المائية عن طريق جهاز الأوتوكليف لهم. لمدة 75 الأوتوكلاف، مل لمدة 25 دقيقة في 121 درجة مئوية.
ملاحظة: الإسفنج تحميل مع العلاج كما هو موضح أدناه هو اختياري.
- في غطاء محرك السيارة العقيمة مع الأدوات المعقمة، واختيار واحدة من الاسفنج الحل باستخدام ملاقط. ضغط الاسفنجة مع ملاقط واستخدام معلومات سرية فراغ لإزالة حل أكبر قدر ممكن من الاسفنجة. وضع انتزعها الاسفنج في نسيج طبق ثقافة، والحرص على ترك مسافة بين الإسفنج. ويمكن استخدام لوحات متعددة جيدا لفصل العلاجات المختلفة.
- ماصة الحل علاج مباشرة على مركز من الإسفنج. اضغط برفق على الإسفنج مع طرف ماصة بعد أن تم وضع حل على الاسفنج، وهذا يساعد على امتصاص الاسفنج الحل. ملاحظة: 6MMقطر بواسطة الإسفنج 2،75 ملم سميكة أن نتبعها هي قادرة على الاستمرار بحد أقصى 25 ميكرولتر.
- مرة واحدة يتم تحميل جميع الإسفنج، يمكن تخزين لوحة هم على الجليد في حين أنها تزرع في الماوس.
2. إجراء العمليات الجراحية
- تخدير الحيوان بشكل مناسب وإدارة وقائي مسكن. والإجراء بأكمله تستمر حوالي 20 دقيقة لكل حيوان. للحصول على 30 لترا ز 1،5 الفأر في الدقيقة الواحدة من الأوكسجين مع يستخدم 1.5٪ Isoflurane للحث على المحافظة على والتخدير. عندما الحيوان لم تعد تستجيب لقرصة اختبار رد الفعل، في مكان مخروط الأنف في موقف ضعيف. استخدام ماكينة حلاقة كهربائية لحلاقة (أ) 1 بوصة بواسطة 1 بوصة منطقة في الجانب السفلي بطني أسفل القفص الصدري. مسح نظيفة من قص الشعر.
- تعقيم منطقة حلق عن طريق تنظيف مع betadine تليها الكحول 70٪. كرر هذا التطهير betadine الكحول ثلاث مرات.
- في حين الضغط على الجلد تدريسها، واستخدام مشرط لجعل شق عمودي 1،5-2 مرات دياتدرج متر من الإسفنج، والحذر لئلا يقطع تجويف الجسم.
- استخدام ملاقط لعقد حافة الجلد وتبدأ ببطء فصل الجلد من العضلات على جانبي الفتحة باستخدام مقص Metzembaum. ينبغي للجيب تذهب عبر عرض من الفأرة ومن القفص الصدري لرجليه الخلفيتين.
- استخدام ملاقط لالتقاط الإسفنج الأولى التي يتم وضعها في الحيوانات عن طريق اختلاس من الجانبين. نقل الاسفنجة إلى ملاقط مستقيم بحيث يتم عقد من أعلى وأسفل.
- استخدام ملاقط لعقد حافة الجلد ورفع بحيث يمكن إدراجها الاسفنجة. إدراج ببطء الاسفنجة في محاولة لتجنب ملامسة الجلد أو العضلات وتحت مثل الاسفنجة سيكون من الصعب التحرك بمجرد أن لمست الأنسجة. كرر لجميع الإسفنج.
- بمجرد أن يتم إدخال جميع الإسفنج، ومكان اثنين أو ثلاثة من الغرز لإغلاق الجرح. استخدام زوج من ملاقط لعقد كلا الجانبين من شق معا، والخيط sutu إعادة على حد سواء من خلال طبقات الجلد. تشديد رمي 1 يكفي لإغلاق حواف الجلد. الانتهاء من عقدة مربع مع واحدة من أكثر رمي الاتجاه الآخر، وهذه المرة سحب عقدة ضيق. التعادل ثم اثنين عقدة أكثر مربع لإنهاء خياطة (الشكل 2). وضع الغرز إضافية لإغلاق شق كامل. ويمكن استخدام طرق أخرى تربط الجرح مثل dermabond، مقاطع الجرح، أو المواد الغذائية.
- إزالة الحيوان من نظام التخدير ورصد في الوقت الذي استأنفت وعيه. وينبغي أن تبدأ بسرعة حيوان التجول والعودة إلى ما قبل المرجع التنقل. أؤكد أنها قادرة بما فيه الكفاية للوصول إلى الغذاء والماء. ويمكن وضع بعض المواد الغذائية مبلل في الجزء السفلي من القفص للمساعدة في التعافي. تواصل رصد حيوان يوميا بحثا عن علامات الضيق أو عدم الراحة، والتحقق من موقع شق ل، عدوى التهاب تفزر و،. اتخاذ الإجراءات المناسبة إذا تم العثور على أية مضاعفات على الانتعاش.
3. اختياري حقن
معشوقة = "jove_content"> ملاحظة: مرة واحدة وقد تم زرع الإسفنج إلى الحيوان ويمكن حقنها بمحلول مكون من خلايا، والأدوية، عوامل النمو وما إلى ذلك وهذا ما يسمح لتحليل الآثار المترتبة على مادة المحقونة في أوقات مختلفة لتوفير وإدارة الأنظمة. فإذا ما فعلت الحقن دائما عنصر تحكم استخدامها.
- لحقن الاسفنج مع الحل المنشود، أولا تحديد كمية من المواد الخاضعة للإدارة على الماوس. المادة يجب أن تتركز بحيث حجم حقن أقل من نصف إجمالي حجم الاسفنجة يمكن أن تعقد.
- تحضير حقنة لحقن (بالنسبة للفئران التي نستخدمها إبرة G 28).
- وضع الحيوانات في الحصول على الحقن تحت التخدير.
- ويمكن عند الحيوان لم يعد يستجيب لاختبار قرصة أن تعطى الحقن.
- لإعطاء حقن دفع الإبرة في الجلد 45 درجة زاوية شامل في مركز الاسفنجة. ثم دفع إبرة في الاسفنج لن يؤدي الا في منتصف الطريقمن خلال سمكها. والهدف من ذلك هو حقن في وسط الدقيق الاسفنجة.
- لفحص للتأكد من أن الإبرة في الاسفنج، ورفع ببطء الإبرة عموديا. إذا كانت الإبرة في الاسفنجة، الاسفنجة يجب نقل ما يصل مع الإبرة.
- حقن ببطء في الاسفنج وإزالة إبرة. إذا كان هناك الإسفنج متعددة تتطلب الحقن فمن الممكن أن يتم دفع بعض من السائل تحقن من المواقع السابقة للحقن.
4. إزالة الاسفنجة
ملاحظة: أثناء إزالة الاسفنجة، والتعامل مع الاسفنجة بمزيد من الحذر. تجنب اختراق الاسفنج مع الأدوات الجراحية ومنع النزيف في الاسفنج عن طريق تجنب الشرايين الرئيسية في جميع أنحاء الأنسجة المحيطة بها.
- بعد هذا الحيوان هو الموت الرحيم، وإزالة الاسفنجة من خلال عقد الجلد باستخدام الملقط، وجعل شق إغلاق الاسفنج.
- بعناية فصل الإسفنج من الكبسولة المحيطة الثانية وتجنب حصاد الأنسجة المحيطة اضافية الاسفنجة. لفحوصات مثل تسليم المخدرات أو قياس الأشكال، المطلوب أقل دقة عن الختان.
5. ممثل النتائج
ويمكن تخزين الإسفنج إزالة تحت ظروف مختلفة تبعا لنوع من التحليل الذي سيتم تنفيذه. لباجتزاء، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من الإسفنج في استرجاع وسيلة لتجميد مثل درجة الحرارة المثلى للقطع (أكتوبر) مركب أو وضعها في 10٪ من الفورمالين لتضمين وباجتزاء في كتل البارافين (الشكل 3A وباء). ويتم الحصول على أفضل النتائج لباجتزاء عندما يتم قطع الاسفنج في نصف عبر القطر، وجزءا لا يتجزأ من قطع السطح إلى الأسفل (الشكل رقم 4A وباء). وكان ينبغي أن تؤخذ أجزاء من الاسفنج بحيث كامل عرض الاسفنجة موجودا. 3A ويبين الشكل 2 الإسفنج، وجزءا لا يتجزأ من الاسفنجة اليسار / مقطوع بشكل غير صحيح، وتمت معالجة الاسفنجة اليمين بشكل صحيح.
والأنف والحنجرة "> للتحليل، ويمكن وضع اسفنج في أنبوب إيبندورف وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى على استعداد لتجهيز يجب وضع الحمض النووي الريبي والكمية الحقيقية الإسفنج تحليل PCR مرة في أنبوب إيبندورف، فلاش المجمدة، وتخزينها في. - 80 درجة مئوية وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام المواد الحافظة 1 الحمض النووي الريبي، مثل RNAlater من QIAGEN، لتحقيق الاستقرار في الحمض النووي الريبي لتخزين آمن عند ارتفاع درجات الحرارة. السائل بالجروح التي يمكن جمعها عن طريق الضغط على الإسفنج عبر أنبوب، وتجميع معا من السائل ويمكن أيضا أن الإسفنج متعددة للحصول على عينة تمثيلية. الخلايا الحية، مثل الضامة، الخلايا الليفية والخلايا اللمفية، يمكن استخراجها من الإسفنج. بعد إزالة من الحيوان، والإسفنج يمكن أن يكون في مكان وسائل الإعلام المناسبة لنوع المطلوب من الخلايا، ويمكن قطع إسفنج تتم معالجتها للافراج عن الخلايا الجسدية من قبل وسائل (أي كولاجيناز) (أي تنميق) أو الأنزيمية.
الشكل 1. Dehydraتيد PVA الأقراص الاسفنج في ثلاثة أحجام مختلفة.
الشكل 2. صورة من نموذج التئام الجروح الماوس يظهر موقف من الجرح الجانبية وأربعة الإسفنج بولي.
الشكل 3. (أ) H & E تلطيخ في 4x و(B) تلوين ثلاثي الألوان في 10X من الإسفنج البارافين مقطوع المضمنة.
الشكل 4. (أ) صورة من قطع الاسفنج في نصف طول القطر. (B) PVA الاسفنج نصف العام، جزءا لا يتجزأ من خفض الجانب السلبي في أكتوبر
Discussion
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
التمويل المقدم من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة R01-HL088424؛ المحاربين القدامى جائزة الجدارة لشؤون PPY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
- Efron, D. T., Barbul, A.
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair. 8, 83-96 (2000).
- Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers. Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).
- Alaish, S. M. Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings. Wound Repair. 3, 292-298 (1995).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 290, 1-11 (1998).
- Alfaro, M. P. sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair. J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).
- Andrade, S. P., Ferreira, M. A. The sponge implant model of angiogenesis. Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).
- Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. A subcutaneous implant for wound healing studies in humans. J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).
- Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. A novel method of studying wound healing. J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
