Summary
Et nyttigt værktøj til analyse af virkningerne af lægemidler, vækstfaktorer, og / eller manipulerede celler i en dyremodel for sårheling er beskrevet. Denne teknik udnytter egenskaberne af en polyvinylalkohol (PVA) svamp til at levere og indeholde den ønskede behandling og også tilvejebringe en platform, der skal udskæres og analyseres.
Abstract
Sårheling er en kompliceret, flertrins proces, der involverer mange celletyper, vækstfaktorer og forbindelser 1-3. På grund af denne kompleksitet, er sårhelingsmodeller undersøgelser mest omfattende, når den udføres in vivo. Der er mange in vivo modeller til at studere akut sårheling, herunder incisional, excisional, Dead Space, og forbrændinger. Døde rum modeller er kunstige, porøse implantater, der anvendes til at studere vævsdannelse og virkningerne af stoffer på såret. Nogle af de almindeligt anvendte døde rum modeller indbefatter polyvinylalkohol (PVA) svampe staaltraadsnet cylindre, ekspanderet polytetrafluorethylen (ePTFE) materiale, og Cellstick 1,2.
Hver dødrum model har sine egne begrænsninger baseret på dets materialets sammensætning og implantation metoder. Den staaltraadsnet cylinder model har en lag fase af infiltration efter implantation og kræver en lang tid, før dannelsen af granulationsvæv begins 1. Senere stadier af sårheling bedst analyseres ved hjælp af ePTFE model 1,4. Den Cellstick er en cellulosesvamp inde i et silicium rørmodel der typisk anvendes til at studere humane kirurgi sår og sårfluidum 2. PVA'en svamp er begrænset til akutte undersøgelser, fordi med tiden begynder at fremkalde et fremmedlegeme reaktion, der forårsager en kæmpecelle reaktion i dyret 5. I modsætning til andre materialer, er PVA svampe let at indsætte og fjerne, fremstillet af et inert og ikke-bionedbrydelige materialer og alligevel er bløde nok til at være i snit til histologisk analyse 2,5.
I sårheling PVA svamp er meget nyttigt til at analysere dannelsen af granulationsvæv, kollagenaflejring, sårvæske sammensætning, og virkningerne af stofferne på helingsprocessen 1,2,5. Ud over dens anvendelse i studere en bred vifte af egenskaber af sårheling, er PVA svampen også blevet anvendt i mange andre typer undersøgelser. Den hsom er blevet anvendt til at undersøge tumorangiogenese, drug delivery og stamcelle overlevelse og transplantation 1,2,6,7. Med sin store alterability, før omfattende brug, og reproducerbare resultater, er PVA svamp en ideel model for mange studier 1,2.
Her beskriver vi fremstilling, implantation og genfinding af PVA svampe skiver (fig. 1) i en muse-model af sårheling.
Protocol
1. Svampefremstilling
- Hydrat svampe ved omrøring natten over i 0,9% (w / v) vandig natriumchloridopløsning.
- Steriliseres hydratiserede svampe ved autoklavering dem. For 75 ml, autoklaveret i 25 minutter ved 121 ° C.
Bemærk: Loading svampe med en behandling som beskrevet nedenfor er valgfri.
- I en steril hætte med sterile instrumenter, afhente en svamp fra den løsning ved hjælp af en pincet. Klem svampen med pincet og bruge et vakuum tip til at fjerne så meget opløsning som muligt fra svampen. Placer opvredet svamp i en vævskulturskål, være omhyggelig med at efterlade plads mellem svampe. Flere brønde kan anvendes til at separere forskellige behandlinger.
- Pipettere behandlingsopløsningen direkte på midten af en svamp. Tryk forsigtigt ned på svampen med pipettespidsen efter at opløsningen er blevet placeret på svamp, hvilket hjælper svampen absorbere opløsningen. Bemærk: 6mmdiameter 2,75 mm tykke svampe, som vi anvender er i stand til at holde et maksimum på 25 uL.
- Når alle svampe er indlæst, kan pladen de er i lagres på is, indtil de er implanteret i mus.
2. Kirurgisk procedure
- Passende bedøver dyret og administrere forebyggende smertestillende. Hele proceduren vil vare cirka 20 minutter per dyr. Til 30 g mus 1,5 liter per minut oxygen med 1,5% isofloran anvendes til at inducere og opretholde anæstesi. Når dyr er ikke længere reagerer på knivspids refleks testen sted i næse kegle i liggende stilling. Brug en elektrisk barbermaskine til at barbere en 1 in med 1 in område på nederste ventrale side under brystkassen. Tør af cut hår.
- Sterilisere det barberede område ved rensning med betadin efterfulgt af 70% alkohol. Gentag denne betadin-alkohol udrensning tre gange.
- Mens du holder huden lært, skal du bruge skalpel til at foretage en lodret snit 1,5-2 gange diameter af svampe, der skal indsættes, er forsigtig med at skære igennem kropskaviteten.
- Anvende en pincet til at holde kanten af huden og langsomt at separere huden fra musklen på begge sider af snittet under anvendelse Metzembaum saks. Lommen skal gå på tværs af bredden af mus og fra brystkassen til bagbenene.
- Brug en pincet til at afhente den første svamp, der skal placeres i dyret ved at knibe det fra siderne. Overføre svampen til en ligekædet pincet, således at det holdes fra toppen og bunden.
- Anvende en pincet til at holde kanten af huden og løfte det, for at svampen kan indsættes. Langsomt indsætte svampen forsøger at undgå at røre ved huden eller musklen under, da svampen vil være vanskeligt at flytte, når den har rørt væv. Gentag for alle svampe.
- Når alle svampe er blevet indsat, to eller tre suturer sted for at lukke snittet. Brug en pincet til at holde begge sider af incisionen sammen og tråder Sutu'enigen gennem begge lag af huden. Spænd første kast lige nok til at lukke huden kanterne. Afslut knude med en mere kast fra den anden retning, denne gang trække knuden stramt. Derefter binder to mere firkantede knob at afslutte suturen (figur 2). Placere yderligere suturer for at lukke hele snittet. Andre sår bindingsmetoder kan anvendes, såsom dermabond, sårklemmer eller hæfteklammer.
- Fjern dyr fra anæstesi-system og overvåge, mens bevidsthed genoptages. Animal bør hurtigt begynde ambulating og vende tilbage til før-op mobilitet. Sikre, at de er i stand til i tilstrækkelig grad nå foder og vand. Nogle fugtet mad kan placeres i bunden af buret for at hjælpe med genopretning. Fortsætte med at overvåge dyret dagligt for tegn på lidelse eller ubehag, og se incisionssted for infektion, inflammation og aabning. Træffe passende foranstaltninger, hvis nogen komplikationer til genopretning findes.
3. Valgfri Injection
- At injicere svamp med en ønsket opløsning, først bestemme mængden af stoffet til at administrere til musen. Stoffet skal koncentreres, således at injektionsvolumen er mindre end halvdelen af den samlede mængde svampen kan indeholde.
- Forbered en sprøjte til injektion (for mus bruger vi en 28 G kanyle).
- Placere dyret modtage injektioner under anæstesi.
- Når dyret ikke længere reagerer på klemme testen injektionen gives.
- Indsprøjter skubbe nålen i en 45 ° vinkel grundig huden på midten af svampen. Tryk derefter nålen ind i svampen vil kun halvvejsgennem dets tykkelse. Målet er at tilføre den nøjagtige centrum af svampen.
- For at kontrollere for at sikre, at nålen er i svampen, langsomt løfte nålen lodret. Hvis nålen i svampen, bør svampen bevæge sig med nålen.
- Injicer langsomt ind i svampen og fjern nålen. Hvis der er flere svampe kræver injektioner er det muligt, at nogle af indsprøjtet fluid, vil blive skubbet ud af de foregående injektionsstederne.
4. Svamp Fjernelse
Bemærk: Under svampen fjernet, svampen håndtere med ekstra forsigtighed. Undgå trænge svampen med de kirurgiske instrumenter og forhindre overdreven blødning ind i svampen ved at undgå de store arterier omkring det omgivende væv.
- Efter at dyret er aflivet, fjernes svampen ved at holde huden ved hjælp af en pincet, og et snit lukke svampen.
- Omhyggeligt adskille svampe fra den omgivende kapsel nd undgå høst ekstra væv, der omgiver svampen. For analyser, såsom drug delivery eller morfometri, er mindre nøjagtighed, der kræves til udskæring.
5. Repræsentative resultater
Fjernet svampe kan opbevares under forskellige betingelser afhængigt af den type analyse, som vil blive udført. For sektionering, kan de hentede svampe blive integreret i et medium for nedfrysning som Optimal Cutting Temperatur (OLT) forbindelse eller placeret i 10% formalin for indlejring og sektionering i paraffinblokke (figur 3A og B). Bedste resultater for skæring opnås, når svampen halveres over diameteren og indlejret snitfladen ned (fig. 4A og B). Dele af svampen skal tages, så at hele bredden af svampen er til stede. Figur 3A viser to svampe blev den venstre svampen indlejrede / snit forkert og højre svampen blev behandlet korrekt.
ent "> Til analyse kan svampe anbringes i et Eppendorf-rør og opbevaret ved -20 ° C indtil den er klar til behandling, RNA og kvantitative real time PCR-analyse svampe skal anbringes i et Eppendorf-rør, lynfrosset og opbevaret ved. - 80 ° C. Desuden kan en RNA-konserveringsmiddel, såsom RNAlater fra QIAGEN, anvendes til at stabilisere RNA til sikker opbevaring ved højere temperaturer. sårfluidum kan opsamles ved at klemme svampe over et rør, og samling sammen væske fra flere svampe at opnå en repræsentativ prøve. levende celler, såsom fibroblaster, makrofager og lymfocytter, kan også ekstraheres fra svampe. Efter fjernelse fra dyret, kan svampe være plads i et passende medium til den ønskede type af celler. svampe kan behandles for at frigive cellerne ved fysiske (dvs. hakning) eller enzymatisk (dvs. collagenase) metoder.
Figur 1. Dehydrated PVA svamp diske i tre forskellige størrelser.
Figur 2. Billede af muse sårheling model, der viser placeringen af lateral såret og fire PVA svampe.
Figur 3. (A) H & E-farvning ved 4x og (B) Trichrome-farvning ved 10x for tværsnit paraffinindlejrede svampe.
Figur 4. (A) Billede af svamp skåret i halve langs diameter. (B) PVA svamp halv, indlejret skåret nedad i oktober
Discussion
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Finansiering fra National Institutes of Health (NIH) tilskud R01-HL088424, Veterans Affairs Merit Award i PpY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
- Efron, D. T., Barbul, A.
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair. 8, 83-96 (2000).
- Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers. Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).
- Alaish, S. M. Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings. Wound Repair. 3, 292-298 (1995).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 290, 1-11 (1998).
- Alfaro, M. P. sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair. J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).
- Andrade, S. P., Ferreira, M. A. The sponge implant model of angiogenesis. Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).
- Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. A subcutaneous implant for wound healing studies in humans. J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).
- Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. A novel method of studying wound healing. J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
