Summary
Ein nützliches Werkzeug, um die Wirkungen von Arzneimitteln, Wachstumsfaktoren und / oder manipulierte Zellen in einem Tiermodell der Wundheilung Analyse beschrieben. Diese Technik nutzt die Eigenschaften eines Polyvinylalkohol (PVA) Schwamm zu liefern und beinhalten die gewünschte Behandlung und auch eine Plattform zum ausgeschnitten und analysiert werden.
Abstract
Die Wundheilung ist ein komplexer, mehrstufiger Prozess, an vielen Zelltypen, Wachstumsfaktoren und Verbindungen 1-3. Aufgrund dieser Komplexität sind die Wundheilung umfassendsten Studien bei in vivo durchgeführt. Es gibt viele in-vivo-Modelle zur Verfügung, um akute Wundheilung, einschließlich incisional, excisional, toten Raum zu studieren, und Verbrennungen. Dead Space-Modelle sind künstliche, poröse Implantate, die verwendet werden, um Gewebe-Bildung und die Wirkung von Substanzen auf die Wunde zu untersuchen sind. Einige der häufig verwendeten Totraum Modelle beinhalten Polyvinylalkohol (PVA) Schwämme, Stahldrahtgeflecht Zylinder, expandiertes Polytetrafluorethylen (ePTFE) Material und die Cellstick 1,2.
Jeder Totraum Modell hat seine eigenen Grenzen auf ihre materielle Zusammensetzung und Implantation Methoden. Das Stahldrahtgeflecht Zylinder Modell verfügt über eine Lag-Phase der Infiltration nach der Implantation und erfordert eine lange Zeit, bevor die Bildung von Granulationsgewebe Begins 1. Spätere Stadien der Wundheilung werden am besten analysiert mit Hilfe der ePTFE-Modell 1,4. Das ist ein Cellstick Zelluloseschwamm in einem Silikonschlauch Modell, das in der Regel für das Studium der Humanmedizin verwendet wird, Wunden und Wundflüssigkeit 2. Die PVA-Schwamm wird auf akute Studien begrenzt, weil es mit der Zeit, eine Fremdkörperreaktion, die eine riesige Zelle Reaktion im Tier verursacht 5 provozieren beginnt. Im Gegensatz zu anderen Materialien, sind PVA-Schwämme leicht einzusetzen und zu entfernen, aus inerten und nicht-biologisch abbaubaren Materialien und sind dennoch weich genug, um zu zerschneiden für die histologische Analyse 2,5.
In der Wundheilung der PVA Schwamm ist sehr nützlich für die Analyse die Bildung von Granulationsgewebe, Kollagenablagerung, Wundflüssigkeit Zusammensetzung, und die Wirkungen von Substanzen auf den Heilungsprozess 1,2,5. Zusätzlich zu seiner Verwendung bei der Untersuchung eine Vielzahl von Attributen der Wundheilung hat die PVA-Schwamm auch in vielen anderen Arten von Untersuchungen verwendet werden. Es hverwendet worden, um als Tumor-Angiogenese, Drug-Delivery-und Stammzell-Transplantation das Überleben und 1,2,6,7 zu untersuchen. Mit seinem großen Veränderlichkeit, vor extensivem Gebrauch und reproduzierbare Ergebnisse ist die PVA-Schwamm ein ideales Modell für viele Studien 1,2.
Hier werden wir beschreiben die Herstellung, Implantation und den Abruf von PVA-Schwamm-Festplatten (Abbildung 1) in einem Mausmodell der Wundheilung.
Protocol
1. Sponge Vorbereitung
- Hydrat Schwämmen vom Rühren über Nacht in 0,9% (w / v) wässriger Natriumchlorid-Lösung.
- Sterilisieren durch Autoklavieren hydratisiert Schwämme ihnen. Für 75 ml, Autoklaven für 25 Minuten bei 121 ° C
Hinweis: Lädt Schwämme mit einer Behandlung, wie unten beschrieben ist optional.
- In einer sterilen Werkbank mit sterilen Instrumenten, nehmen Sie ein Schwamm aus der Lösung unter Verwendung einer Pinzette. Drücken Sie den Schwamm mit der Pinzette und mit einem Staubsauger Spitze, so viel wie möglich zu entfernen Lösung aus dem Schwamm. Legen Sie die ausgewrungenen Schwamm in einem Gewebekulturschale, wobei darauf zu Raum zwischen Schwämmen zu verlassen. Multiple-Well-Platten verwendet werden, um verschiedene Behandlungen zu trennen.
- Pipettieren der Behandlungslösung direkt auf die Mitte eines Schwamms. Drücken Sie sanft auf den Schwamm mit der Pipettenspitze, nachdem die Lösung auf den Schwamm wurde angeordnet, dadurch wird der Schwamm absorbieren die Lösung. Hinweis: Die 6mmDurchmesser von 2,75 mm dicke Schwämme, die wir einsetzen können, um ein Maximum von 25 ul zu halten.
- Sobald alle Schwämme geladen werden, kann die Platte aber in auf Eis gelagert werden, bis sie in der Maus implantiert werden.
2. Chirurgisches Vorgehen
- Passenderweise Tier zu betäuben und zu verwalten Präventivschlag Analgetikum. Die gesamte Prozedur dauert etwa 20 Minuten pro Tier. Für eine Maus mit 30 g 1,5 Liter pro Minute von Sauerstoff mit 1,5% Isofluran wird zur Einleitung und Aufrechterhaltung einer Narkose. Beim Tier ist nicht mehr in Reaktion auf die Prise Reflex-Test, in Nasenkonus in Rückenlage. Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer rasieren, um einen 1 Zoll x 1 Zoll Bereich an der unteren Bauchseite unterhalb des Brustkorbs. Wischen Sie von geschnittenen Haaren.
- Sterilisieren Sie den rasierten Bereich durch eine Reinigung mit Betadin um 70% Alkohol. Wiederholen Sie diesen Betadin-Alkohol-Reinigung dreimal.
- Halten Sie die Haut gelehrt, verwenden Sie das Skalpell an einen vertikalen Schnitt von 1,5 bis 2-fache der diaMeter der Schwämme zu eingefügt werden, vorsichtig zu sein, um nicht durch die Körperhöhle zu schneiden.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Kante der Haut halten und langsam beginnen, trennt die Haut vor dem Muskel auf beiden Seiten des Schnittes mit Metzembaum Schere. Die Tasche sollte über die Breite der Maus und aus dem Brustkorb auf den Hinterbeinen zu gehen.
- Verwenden Sie eine Pinzette zu holen den ersten Schwamm, um im Tier durch Kneifen es von den Seiten platziert werden. Übertragen Sie den Schwamm zu einer geraden Pinzette, so dass es von oben und unten gehalten wird.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Kante der Haut an und heben Sie so, dass der Schwamm eingefügt werden können. Langsam fügen Sie den Schwamm versuche zu vermeiden, das Berühren der Haut oder unter den Muskel wie der Schwamm wird schwierig sein, sich zu bewegen, sobald es Gewebe berührt hat. Wiederholen Sie für alle Schwämme.
- Sobald alle Schwämme wurden eingefügt, zwei oder drei Fäden Ort, um den Schnitt zu schließen. Verwenden Sie eine Pinzette, um beide Seiten des Einschnitts zusammenzuhalten und fädeln die Sutuerneut durch beide Schichten der Haut. Ziehen Sie den ersten Wurf gerade genug, um die Haut Kanten schließen. Beenden Sie die quadratischen Knoten mit einem weiteren aus der anderen Richtung, diesmal zog den Knoten fest zu werfen. Dann binden zwei weitere quadratische Knoten, um die Naht (Abbildung 2) zu beenden. Setzen Sie zusätzliche Nähte, um die gesamte Einschnitt zu schließen. Andere Wunde Klebeverfahren kann wie DERMABOND-, Wund-Clips oder Klammern verwendet werden.
- Entfernen Tier aus der Narkose-System und zu überwachen, während das Bewusstsein wieder aufgenommen wird. Tiere sollten schnell beginnen ambulating und zum präoperativen Mobilität. Versichern, dass sie in der Lage, ausreichend Nahrung und Wasser zu erreichen sind. Befeuchtetes Lebensmittel in die Boden des Käfigs in Genesung zu unterstützen abgegeben werden. Weiter zum Tier täglich überwachen für Anzeichen von Leiden oder Beschwerden, und überprüfen Sie die Inzisionsstelle für eine Infektion, Entzündung und Dehiszenz. Geeignete Maßnahmen ergreifen, wenn keine Komplikationen auf Erholung zu finden sind.
3. Optional Injection
- Um den Schwamm mit einer gewünschten Lösung zu injizieren, zunächst die Menge der Substanz auf die Maus zu verabreichen. Die Substanz muss konzentriert, so dass die Einspritzmenge weniger als die Hälfte des Gesamtvolumens der Schwamm aufnehmen kann ist.
- Bereiten Sie eine Spritze für die Injektion (für Mäuse verwenden wir eine Nadel 28 G).
- Platzieren Sie das Tier, um die Injektionen unter Narkose erhalten.
- Wenn das Tier reagiert nicht mehr auf der Pinch-Test kann die Injektion gegeben werden.
- Um die Injektion geben, drücken Sie die Nadel in einem 45 ° Winkel gründlich die Haut in der Mitte des Schwammes. Dann drücken Sie die Nadel in den Schwamm nur gehen auf halbem Wegdurch seine Dicke. Das Ziel ist, in die exakte Mitte des Schwammes zu injizieren.
- Um zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Nadel in den Schwamm, langsam heben Sie die Nadel vertikal. Wenn die Nadel in den Schwamm, sollte der Schwamm nach oben mit der Nadel.
- Langsam in den Schwamm spritzen und entfernen Sie die Nadel. Wenn es mehrere Schwämme erfordern Injektionen sind, ist es möglich, dass einige der injizierten Flüssigkeit aus wird aus den bisherigen Injektionsstellen geschoben werden.
4. Sponge Removal
Hinweis: Während der Schwamm entfernt, behandeln Sie den Schwamm mit besonderer Vorsicht. Vermeiden Durchdringen der Schwamm mit den chirurgischen Instrumenten und einen übermäßigen Blutungen in den Schwamm durch die Vermeidung der großen Arterien um das umgebende Gewebe.
- Nachdem das Tier eingeschläfert ist, entfernen Sie den Schwamm, indem Sie die Haut mit einer Pinzette und einen Einschnitt schließen Sie den Schwamm.
- Trennen Sie vorsichtig die Schwämme aus dem umgebenden Kapsel ein ND vermeiden Ernte zusätzliche Gewebe um den Schwamm. Für Assays wie Drug-Delivery-oder Morphometrie, ist weniger die Genauigkeit für die Exzision erforderlich.
5. Repräsentative Ergebnisse
Entfernte Schwämme können unter verschiedenen Bedingungen in Abhängigkeit von der Art der Untersuchung, die durchgeführt werden gespeichert. Zum Schneiden können die abgerufenen Schwämme in einem Medium zum Einfrieren wie Optimal Cutting Temperature (OCT)-Verbindung eingebettet werden, oder in 10% Formalin für Einbetten und Schneiden in Paraffin-Blöcke (Abbildung 3A und B). Die besten Ergebnisse für das Schneiden werden erzielt, wenn der Schwamm in der Hälfte über den Durchmesser geschnitten und eingebettet Schnittfläche nach unten (Abb. 4A und B). Abschnitte des Schwamms ergriffen werden sollten, so dass gesamte Breite des Schwammes vorliegt. 3A zeigt zwei Schwämme, wurde die linke Schwamm eingebetteten / geschnittene falsch und die rechte Schwamm wurde korrekt verarbeitet.
ENT "> Für die Analyse, Schwämme können in ein Eppendorf-Röhrchen platziert werden und bei -20 ° C bis zur Verarbeitung bereit für RNA und quantitative Echtzeit-PCR-Analyse Schwämme in ein Eppendorf-Röhrchen, schockgefroren gelegt werden sollte und gespeichert. - 80 ° C. Darüber hinaus kann eine RNA Konservierungsmittel, wie RNAlater von QIAGEN, verwendet, um die RNA für eine sichere Lagerung bei höheren Temperaturen zu stabilisieren. Wundflüssigkeit kann durch Drücken der Schwämme über einem Gefäß gesammelt werden, und Bündelung des Fluids aus mehrere Schwämme, um eine repräsentative Probe zu erhalten. Live-Zellen, wie Fibroblasten, Makrophagen und Lymphozyten, können auch aus den Schwämmen gewonnen werden. Nach der Entnahme aus dem Tier, Schwämme können vorhanden sein, in einem geeigneten Medium für die gewünschte Art der Zellen. Schwämme können verarbeitet, um die Zellen durch physikalische (dh Hacken) oder enzymatische (dh Collagenase) Verfahren freizusetzen.
Abbildung 1. DehydraTed PVA-Schwamm-Festplatten in drei verschiedenen Größen.
Abbildung 2. Das Bild der Maus Wundheilung Modell zeigt Lage der seitlichen Wunde und vier PVA Schwämme.
Abbildung 3. (A) H & E Färbung mit 4x und (B) Trichromfärbung bei 10x geschnitten von in Paraffin eingebetteten Schwämme.
Abbildung 4. (A) Bild von Schwamm halbieren entlang des Durchmessers. (B) PVA Schwamm Hälfte, eingebettet Schnittfläche nach unten in Oktober
Discussion
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Bereitgestellten Finanzmittel von den National Institutes of Health (NIH) Zuschuss R01-HL088424; Veterans Affairs Merit Award zu PPY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
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