Summary
Et nyttig verktøy for å analysere virkningene av narkotika, vekstfaktorer, og / eller manipulerte celler i en dyremodell av sår reparasjon er beskrevet. Denne teknikken utnytter egenskapene til en polyvinylalkohol (PVA) svamp til å levere og inneholde ønsket behandling og også gi en plattform for å bli fjernet og analyseres.
Abstract
Sårheling er en komplisert, multistep prosess som involverer mange celletyper, vekstfaktorer og forbindelser 1-3. På grunn av denne kompleksiteten, sårheling studier er mest omfattende når utført in vivo. Det er mange in vivo modeller tilgjengelig for å studere akutt sårtilheling, inkludert operasjonssåret, excisional, Dead Space, og brannsår. Dead Space modeller er kunstige, porøse implantater som brukes til å studere vev dannelse og effekter av stoffer på såret. Noen av de mest brukte Dead Space modellene inkluderer Polyvinylalkohol (PVA) svamper, stål netting sylindere, utvidet polytetrafluoretylen (ePTFE) materiale, og Cellstick 1,2.
Hver Dead Space modell har sine egne begrensninger basert på sin materialets sammensetning og implantasjon metoder. Stålet netting sylinder modellen har et etterslep fase av infiltrasjon etter implantering og krever en lang tid før granulasjonsvev dannelse Begins en. Senere stadier av sårtilheling er best analyseres ved hjelp av ePTFE modellen 1,4. Den Cellstick er en svamp inni en silisium tube modell som vanligvis brukes for å studere menneskelige kirurgi sår og såre væske to. Den PVA svamp er begrenset til akutte studier fordi med tid begynner det å provosere en fremmedlegeme reaksjon som fører til en gigantisk celle reaksjon på dyret fem. I motsetning til andre materialer, PVA svamper er enkle å sette inn og fjerne, laget av inert og ikke biologisk nedbrytbart materiale, og ennå er myke nok til å være seksjonert for histologisk analyse 2,5.
I sårtilheling PVA svampen er svært nyttig for å analysere granulasjonsvev formasjon, kollagen deponering, sår væske sammensetning, og effekten av stoffene på den helbredende prosessen 1,2,5. I tillegg til sin bruk i å studere en rekke attributter sårtilheling, har PVA svampen også blitt brukt i mange andre typer studier. Det hsom er benyttet for å undersøke tumor angiogenese, levering av legemidler og stamcelle overlevelse og engraftment 1,2,6,7. Med sin store alterability, før utstrakt bruk, og reproduserbare resultater, er det PVA svampen en ideell modell for mange studier 1,2.
Her vil vi beskrive forberedelsene, implantasjon og gjenfinning av PVA svamp disker (figur 1) i en mus modell av sårtilheling.
Protocol
1. Sponge Forberedelse
- Hydrate svamper ved å røre over natten i 0,9% (w / v) vandig natriumkloridoppløsning.
- Steriliser hydrert svamper ved autoklavering dem. For 75 ml, autoklav i 25 minutter ved 121 ° C.
Merk: Henter svamper med en behandling som beskrevet nedenfor er valgfri.
- I et sterilt hette med sterile instrumenter, plukke opp en svamp fra løsningen ved hjelp av en pinsett. Klem svampen med pinsett og bruke et vakuum tips for å fjerne så mye løsning som mulig fra svampen. Plasser vridd ut svampen i en vevskultur tallerken, er forsiktig med å forlate rommet mellom svamper. Flere vel platene kan brukes til å skille forskjellige behandlinger.
- Pipettering behandlingen løsningen direkte på midten av en svamp. Trykk forsiktig ned svamp med pipettespissen etter at løsningen har blitt plassert på svampen, dette hjelper svampen absorberer løsningen. Merk: 6mmdiameter med 2,75 mm tykke svamper at vi benytter er i stand til å holde maksimalt 25 mL.
- Når alle svamper er lastet, kan platen de er i lagres på is inntil de blir implantert i mus.
2. Kirurgisk prosedyre
- Passende anesthetize dyr og administrere fortrinnsrett smertestillende. Hele prosedyren vil vare ca 20 minutter per dyr. For en 30 g mus 1,5 liter pr minutt av oksygen med 1,5% isofluran brukes til å indusere og opprettholde anestesi. Når dyr er ikke lenger mottakelig for det knipe refleks testen, plass i nesen kjegle i ryggleie. Bruk en barbermaskin å barbere en 1 tommer med 1 i. område på nedre ventral siden under ribbeina. Tørk av klipp håret.
- Steriliser barberte området ved rengjøring med Betadine etterfulgt av 70% alkohol. Gjenta dette Betadine-alkohol rensing tre ganger.
- Mens du holder huden lært, bruke skalpell til å lage en vertikal snitt 1,5-2 ganger diameter av svamper som skal settes inn, være forsiktige for ikke å skjære gjennom kroppens hulrom.
- Bruk en pinsett til å holde kanten av huden og sakte begynne å skille huden fra muskler på begge sider av snittet hjelp Metzembaum saks. Lommen bør gå langs bredden av musen og fra brystkassen til bakbena.
- Bruk en pinsett til å plukke opp den første svamp til å bli plassert i dyret ved å klemme den fra sidene. Overfør svamp til en rett pinsett slik at det blir holdt fra toppen og bunnen.
- Bruk pinsett til å holde kanten av huden og løft den slik at svampen kan settes inn. Sakte inn svamp prøver å unngå å berøre huden eller muskelen under som svamp vil være vanskelig å flytte når den først har berørt vev. Gjenta for alle svamper.
- Når alle svamper har blitt satt inn, to eller tre sting sted å lukke såret. Bruk en pinsett til å holde begge sider av snittet sammen og træ suture gjennom begge lag av huden. Stram den første kast akkurat nok til å lukke huden kantene. Fullfør plassen knuten med en mer kast fra den andre retningen, denne gangen drar knuten stramt. Så knytte to mer kvadrat knop å fullføre sutur (figur 2). Plasser flere sting for å lukke hele snittet. Andre sår bonding metoder kan brukes som dermabond, sår klipp, eller stifter.
- Fjern dyr fra anestesi system og overvåke mens bevissthet er gjenopptatt. Animal bør raskt begynne ambulerer og gå tilbake til pre-op mobilitet. Forsikre at de er i stand til å tilstrekkelig nå mat og vann. Noen fuktet mat kan plasseres i bunnen av buret for å bistå i utvinningen. Fortsett å overvåke dyr daglig for tegn på stress eller ubehag, og sjekk snittet nettstedet for infeksjon, betennelse, og Spaltedannelse. Iverksette nødvendige tiltak dersom noen komplikasjoner til utvinning er funnet.
3. Valgfritt Injection
- Å injisere svampen med en ønsket løsning, først bestemme mengden av stoffet for å administrere til musen. Stoffet må være konsentrert slik at injeksjonsvolum er mindre enn halvparten av den totale volumet svampen kan holde.
- Forbered en sprøyte for injeksjon (for mus vi bruker en 28 G nål).
- Plasser dyret å motta injeksjoner under narkose.
- Når dyret ikke lenger reagerer på knipe testen injeksjonen kan gis.
- For å gi injeksjonen skyve nålen i en 45 graders vinkel grundig huden på midten av svamp. Deretter skyver nålen inn i svampen bare kommer halvveisgjennom tykkelsen. Målet er å injisere i nøyaktig midten av svamp.
- For å kontrollere at nålen er i svampen langsomt løfte nålen vertikalt. Hvis nålen er i svampen, bør svamp flytte opp med nålen.
- Sakte injisere i svampen og fjerne nålen. Hvis det er flere svamper som krever injeksjoner det er mulig at noen av den injiserte væske vil bli skjøvet ut av de tidligere stedene i injeksjon.
4. Sponge fjerning
Merk: Under svamp fjerning, håndtere svamp med ekstra forsiktighet. Unngå å trenge inn i svampen med kirurgiske instrumenter og forhindre overdreven blødning inn i svampen ved å unngå de store arteriene rundt omkringliggende vev.
- Etter at dyret avlives, fjerne svampen ved å holde huden ved hjelp av en pinsett og lage et snitt lukke svamp.
- Nøye skille svampene fra den omliggende kapselen en nd unngå høsting ekstra vevet rundt svampen. For analyser som stoffet levering eller morfometri, er mindre nøyaktighet kreves for excision.
5. Representative Resultater
Fjernet svamper kan lagres under forskjellige vilkår avhengig av type analyser som skal utføres. For seksjonering, kan de hentede svampene være forankret i et medium for frysing som Optimal Cutting Temperatur (OCT) compound eller plassert i 10% formalin for innebygging og seksjonering i parafin blokker (figur 3A og B). Beste resultater for seksjonering oppnås når svampen er halvert over diameter og innebygde snittflaten ned (Figur 4A og B). Deler av svampen bør tas slik at hele bredden av svampen er til stede. Figur 3A viser to svamper, ble den venstre svamp innebygde / seksjoneres feil og retten svampen ble behandlet riktig.
ent "> For analyse, kan svampene legges i en Eppendorf rør og lagres ved -20 ° C til den er klar for prosessering for RNA og kvantitative Real Time PCR-analyse svamper bør plasseres i en Eppendorf rør, blits frossen, og lagret på. - 80 ° C. I tillegg kan en RNA konserveringsmiddel, slik som RNAlater fra Qiagen, brukes til å stabilisere RNA for sikker lagring ved høyere temperaturer. Wound væske kan hentes ved å klemme svampene over et rør, og pooling sammen væske fra flere svamper på å få et representativt utvalg. levende celler, for eksempel fibroblast, makrofager og lymfocytter, kan også være hentet fra svampene. Etter fjerning av dyret, kan svamper være plasser i en hensiktsmessig media for ønsket type celler. Svamper kan bearbeides for å frigjøre cellene ved fysisk (dvs. hakking) eller enzymatisk (dvs. collagenase) metoder.
Figur 1. Dehydraterte PVA svamp disker i tre ulike størrelser.
Figur 2. Bilde av mus sårhelende modell som viser plasseringen av lateral såret og fire PVA svamper.
Figur 3. (A) H & E flekker på 4x og (B) Trichrome farging på 10x av seksjonert parafin innebygde svamper.
Figur 4. (A) Bilde av svamp halvert langs diameter. (B) PVA svamp halvparten, innebygd kuttet ned i oktober
Discussion
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Finansiering levert av National Institutes of Health (NIH) tilskudd R01-HL088424; Veterans Affairs Merit Award i PpY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
- Efron, D. T., Barbul, A.
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair. 8, 83-96 (2000).
- Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers. Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).
- Alaish, S. M. Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings. Wound Repair. 3, 292-298 (1995).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 290, 1-11 (1998).
- Alfaro, M. P. sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair. J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).
- Andrade, S. P., Ferreira, M. A. The sponge implant model of angiogenesis. Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).
- Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. A subcutaneous implant for wound healing studies in humans. J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).
- Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. A novel method of studying wound healing. J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
