Summary
En musemodel for amyotrofisk lateral sklerose (ALS) undersøges klinisk og adfærdsmæssigt. Som en forudsætning for en ledsagende immunhistologisk analyse udarbejdelsen af rygmarven er afbildet i detaljer.
Abstract
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en fatal neurodegenerativ lidelse resulterer i progressiv degeneration af motoneuroner. Peak debut er omkring 60 år for sporadisk sygdom og omkring 50 år for familiær sygdommen. På grund af sin progressivt forløb, 50% af patienterne dør inden for 30 måneder fra symptomdebut. For at evaluere hidtil ukendte behandlingsmuligheder for denne sygdom, har genetiske musemodeller for ALS er genereret ud fra human familiær mutationer i SOD-genet, såsom SOD1 (G93A) mutation. De fleste vigtige aspekter, der skal evalueres i modellen er samlet overlevelse, kliniske forløb og motorisk funktion. Her vil vi demonstrere den kliniske evaluering, viser ledning af to adfærdsmæssige motoriske tests og give kvantitative pointsystemer for alle parametre. Fordi en dybtgående analyse af ALS musemodel normalt kræver en immunhistokemisk undersøgelse af rygmarven, vi demonstrere sin forberedelse i detaljer anvende gøreRsaI laminektomi metode. Eksempler på histologiske fund er påvist. Den omfattende anvendelse af de afbildede eksamen metoder i undersøgelser af musemodel af ALS vil gøre det muligt for forskeren at pålideligt teste fremtidige terapeutiske muligheder, der kan danne grundlag for senere humane kliniske forsøg.
Protocol
Dyrene blev indkøbt fra Jackson Laboratory (# 002.726) 1. De er klinisk scorede og underkastes en test af motorisk funktion (rotarod test) og muskelstyrke (hængende wire test). Alle disse test og senere aflivningen af dyr med henblik på at forberede rygmarven er blevet udført i meget tæt overensstemmelse med de lokale retningslinjer for korrekt afvikling af dyreforsøg.
1. Klinisk score
Bortset fra vurdering til en kropsvægt på mus undersøges for tegn på motor underskud med følgende 4 point scoring system 2:
4 point: normal (ingen tegn på motorisk dysfunktion)
3 point: bagben rystelser er tydelige, når suspenderet af halen
2 point: gangart abnormaliteter er til stede
1 point: trække mindst en bagbenet
0 point: symmetrisklammelse, manglende evne til at rette sig selv eller tab af 20% af maksimal legemsvægt, i dette tilfælde dyrene umiddelbart aflivet, og forsøget afsluttes
2. Test af motorisk funktion og muskelstyrke
Hængende wire
Denne test anvendes til at vurdere muskelstyrke 3, 4. Alle dyr udføre denne test mindst en eller to dage efter rotarod testen. Hver musen placeres på en specialfremstillet wire låg med intervaller på 0,8 cm og forsigtigt vendt op og ned, 60 cm over en strå omfattet bund. Efter uddannelse til tre gange i træk på mindst 180 s latenstiden falde måles. Hver mus gives op til tre forsøg på at holde på den inverterede låget for et maksimum på 180 s, og den længste periode registreres.
Rotarod Test
3, 4. En god præstation kræver en høj grad af sansemotorisk koordination. Maskinen skal placeres i en rolig og ikke-forstyrrende miljø for at undgå distraherende stimuli for den testede dyr. Det består af en computerstyret motordreven roterende spindel og fem baner til fem mus. Fald af musene detekteres automatisk ved tryk på en plast-plade i bunden. Efter uddannelse til tre gange i træk på mindst 180 s ved en konstant hastighed på 15 rpm den tid, hvor et dyr kan forblive på den roterende stang måles. Hvert dyr gennemgår tre forsøg, og den længste ventetid uden at falde registreres. Tidspunktet for 180 s er valgt som cut-off tid, fordi størstedelen af væsentlige forskelle i motorik er påvist i denne tidsramme.
3. Spinal Cord Forberedelse
- Dyrene aflives ved CO 2 insufflation i overensstemmelse med de lokale retningslinjer og umiddelbart perfunderes transcardialt med PBS-opløsning efterfulgt af en 4% paraformaldehydopløsning.
- For at forberede rygmarven af aflivet mus dyret anbringes en operation tabel og de fire lemmer er fastgjort på den side for at blotlægge bagsiden af musen.
- En kort vask med en 70% ethanolopløsning renser stedet for dissektion og flader pelsen.
- Så huden er indridset med en skarp skalpel i det midterste linje. For at lette skæring af huden er strakt til begge sider. Hvis benmuskler skal udarbejdes, har deres hud skal også indsnit.
- Efter incision i huden er afsluttet, trækkes til side med en pincet til at afsløre den underliggende overfladiske fascia af kroppen.
- Muskulaturen af halsen og nakke ligament skal fjernes, og er carefully fremstillet. Vær omhyggelig med ikke at incise at dybt og læsion af rygmarven. De skuldermuskler kan også fjernes for bedre at udsætte rygsøjlen.
- Derefter det paravertebrale musklerne fjernet fra hele rygsøjlen.
- For at åbne rygradsdelene flere laminectomies skal udføres. Man bør starte fra den øvre kraniale del på stedet for den atlanto-occipital samling.
- Det er nemmest at fjerne fiksering af de to øverste lemmer og overstrække nakken for at være bedre i stand til at udføre laminektomien af den første ryghvirvler. Disse trækkes væk uden at røre den blotlagte cervikale rygmarv.
- Mere ryghvirvler fjernes ved først transecting de vertebrale buerne på begge sider med vinklede en saks og derefter trække på ryg processer. Resterende laterale dele af hvirvlerne skal fjernes for at lette senere fuldstændig fjernelse af rygmarven.
- En anatomisk vartegn for lænde-spinal er ledningen, der kvældning, der også er til stede i den cervikale rygmarv.
- Efter at have afsluttet laminektomien af hele rygmarven, så sørg for at du også transekt alle ventrale rødder og slip rygmarven fra dura mater af meninges.
- Så cervikal rygmarven skæres kranielt og du begynder at fjerne rygmarven.
- Endelig rygmarven skæres også ved den distale cauda-equina at være helt frigivet.
- Sidste ende er rygmarven er placeret i en postfixating opløsning (f.eks 4% paraformaldehyd) natten over og kan bearbejdes yderligere. Vi plejer at kryosektionen rygmarven at forberede det til immunhistologisk analyse.
4. Repræsentative resultater
Teknikken med rygmarven forberedelse repræsenterer fokus i denne video artiklen. Det er en væsentlig forudsætning for senere væv sektionering og i sidste ende immunhistologisk analyse af spinal ledning sektioner. Som et eksempel på et endeligt resultat mus en immunhistokemisk oparbejdning af den forreste horn region af muse lumbale rygmarv en vildtype (wt) og en SOD G93A transgen (Tg) er vist. Motor neuroner kan identificeres med et primært anti-ChAT antistof og efterfølgende fluorescerende mærkning med et sekundært Cy3 antistof. Desuden har en nuklear modsat farvning med DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol) blevet udført (fig. 1).
Figur 1. Fluorescerende mikrofotografier visualisering immunpåvisningen af motoneuroner med anti-ChAT-antistof (rød) og cellulære kerner mod pletter af DAPI (blå) i mus lumbale rygmarv forreste horn af vildtype (wt) (til venstre) og en SOD G93A transgene (TG) (til højre) musen i en alder af 130 dage. Målestok: 40 um.
Som immunohistokemisk analyse afde SOD G93A mus er ikke det primære anvendelsesområde for denne artikel, skal du kontakte den oprindelige udgivelse, hvor disse transgene mus er blevet karakteriseret og nyere dem, der studerer behandlingsformer for yderligere reference 1, 5, 6. Hvis terapeutiske virkninger skal differentieres på immunhistologisk niveau klart definerede kvantitative evaluering algoritmer bør anvendes understøttes af en stereologiske software (se for eksempel 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den SOD1 (G93A) genetisk musemodellen er et værdifuldt dyremodel til undersøgelse af sygdommens forløb fremadskridende motoneuron tab sammenlignes med human amyotrofisk lateral sklerose 8. En række forskellige behandlingsgrupper paradigmer er blevet evalueret i denne model og udgør grundlaget for senere teste i humane kliniske undersøgelser 8-10. For at være i stand til at detektere signifikante forskelle i en eksperimentel behandling undersøgelse i disse mus, er det yderst vigtigt at indbefatte mindst 24 kuld-matchede kønsafbalanceret mus af den samme genetiske baggrund og følge en dobbelt-blindet design 8. Sammenlignes med humane kliniske undersøgelser, bør en ensartet endepunkt kriterium vælges. Her er den mest almindeligt anvendte man den manglende evne hos dyret til højre sig i 30 sekunder efter at være anbragt på siden. Hvis dette kriterium er nået dyret bliver ofret, og dens levetid er registreret som tiden for at overleve.
Treatment undersøgelser kan startes med en præsymptomatiske klinisk tilstand (f.eks i dag i livet (DOL) 50 eller endda på DOL 30), når dyrene endnu ikke udviser nogen tegn på motorisk dysfunktion og ville blive scoret med 4 point i vores kliniske pointsystem . En anden mulighed består i en symptomatisk behandling tilgang, der skal starte, når den første kliniske symptom vises og bagben rystelser er tydelige, når dyret er ophængt i halen. Dette er defineret som sygdomsdebut, og denne første sygdomsstadie er kåret med den kliniske vurdering 3. Betydelige nedskrivninger i test af motorisk funktion og muskelstyrke det meste optræder kun mere end 2-4 uger senere. Som gennemsnit dyrene nå den første kliniske sygdom fase omkring DOL 80, nogle forskere starte symptomatisk behandling for alle dyr på dette tidspunkt i en forenklet fremgangsmåde. I begge indstillinger er det obligatorisk at overvåge sygdomsprogression. Dette bør påbegyndes samtidig med behandlingsstart for presympmatisk behandlede dyr DOL 50 eller DOL 30, henholdsvis) eller ved DOL 70 til symptomatisk behandlede dyr. Overvågning af sygdomsprogression omfatter en to gange om ugen bestemmelse af kropsvægt, klinisk neurologisk scoring og test af motorisk funktion og muskelstyrke. Hvis dyrene når klinisk score 1 (at trække i mindst et bagben), anbefaler vi at udføre daglige bestemmelse af kropsvægt og klinisk monitorering for ikke at gå glip af den kliniske score 0 point (symmetrisk lammelse, manglende evne til at rette sig selv eller tab af 20 % af maksimal legemsvægt), når dyrene skal straks aflivet, og forsøget afsluttes. Det anbefales, at første gang køreprøvesagkyndig, der er styret af en erfaren dyr forsker, der hjælper med at opdage også subtile kliniske tegn på progression. Den kliniske 4 point-pointsystem efter Weydt et al 2 er veletableret inden for området og er et pålideligt system ved hjælp af kriterier, der klart kan skelnes. Enmere subtil differentiering af kliniske symptomer kan være mindre klar og yderst eksaminator afhængige.
For at detektere adfærdsmæssige mangler en række test paradigmer er tilgængelig. De fleste forfattere fremme rotarod testen, der vurderer evnen hos dyret til at køre på en roterende cylinder 4, 11. I en undersøgelse at vurdere betydningen af adfærdsmæssige test i SOD1 G93A musemodel rotarod testen viste sig at være meget følsom i detektere væsentlige forskelle mellem vildtype og transgene mus så tidligt som fra uge 16 af alder på 11. Mulige modifikationer omfatter kører ved en konstant hastighed eller en accelereret hastighed løb. Under alle omstændigheder har de dyr, der skal uddannes, før den første gyldige test, fordi nogle måske brug for mere træning end andre for at opnå et grundlæggende niveau af motorisk koordination. En begrænsning er repræsenteret ved forskelligt motiverede dyr til at udføre denne opgave. Dette kan imidlertid kompenseres ved gentagne forsøg på mindst three gange undersøgelse dag. En anden motor adfærdsmæssige test, som er meget følsomt i opdage tidlige motoriske underskud er footprint-analyse 11. Men det er ganske besværligt, fordi dyrene er nødt til at være motiveret til at køre over en gangbro efter at have fødderne dyppet i et reservoir af maling. Kvaliteten af fodsporet kan variere i vid udstrækning og en software-støttede analyse er vanskelig. Derfor foretrækker vi rotarod testen til vurdering af motorisk koordination.
Den hængende wire test evalueret muskelstyrke i benene. Det er en temmelig rå test, der bedst registrerer tidligt muskuløse underskud et par uger efter initiering af sygdom 4. Det er imidlertid meget let at udføre og hele testapparatet kan let konstrueres. En mere omfattende test for muskelstyrke er anvendelsen af en krafttransducer 12. Her, musen bedt om at gribe en stang er forbundet til en krafttransducer med enten dets bageste eller derforpoter. Andre funktionelle tests, der skal overvejes indbefatter måling af løbehjul afstanden eller endog evaluering af friland aktivitet 3, 13. Men i vores erfaring kombinationen af rotarod og hængende Glødetrådstest vist sig at være mest følsomme, let praktisk og tidsbesparende for vurderingen af de SOD1 G93A mus. Samlet set bør en præklinisk undersøgelse i dyr udformes meget omhyggeligt og bør følge grundlæggende principper for en humane kliniske undersøgelser som beskrevet i Consort retningslinjer ( www.consort-statement.org ) 14. Først derefter, kan brugen af dyr til præklinisk forskning være berettiget, og resultaterne kan i sidste ende føre til en vellykket oversættelse til et menneske klinisk anvendelse.
Disse kliniske og adfærdsmæssige fund bør altid korreleret til en analyse af patologi af den neuromuskulære enhed, herunder rygmarven motoneuron, axon-og neuromuskulære junction 14. Her, en høj kvalitet analyse af CNS rygmarv patologi er en forudsætning for fortolkningen af virkninger på overlevelse eller sygdomsprogression. Fordi grundig vævsfiksering er kritisk, bør perfusion af dyrene med en 4% paraformaldehyd indeholdende PBS-opløsning standardiseres godt. For at være i stand til forsigtigt at fjerne rygmarven en dissektion tabel skal installeres sammen med en fast drift mikroskop og fine kirurgiske instrumenter skal være til rådighed (se listen af kirurgiske instrumenter nedenfor). Efter at hele rygmarven er blevet fjernet, kan det bearbejdes til den passende sektionering teknikken (f.eks vibratome eller cryotome) og endelig kan underkastes immunhistologisk analyse. Her grundlæggende evaluering parametre er antallet af rygmarv motorneuroner og aktiverede eller infiltrere gliaceller 10, 15. Afhængig af den oprindelige problemstilling, yderligere immunhistokemisk markers såsom SOD aggregater eller CNS endotel integritet kan evalueres. Desuden kan perifere nervesystem patologi vurderes ved undersøgelse af perifere nerveaxoner og neuromuskulære junctions. Kun kombinationen af både kliniske og immunhistokemisk analyse af CNS-og PNS tilvejebringe en grundig afbildning af den samlede ALS patologi, der skal korreleres med de kliniske resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
LT har modtaget tilskud fra den Forschungsförderungsprogramm af universitetet Medicine Göttingen. PL og MB blev støttet af DFG Research Center for Molekylær Fysiologi af hjernen (CMPB), Göttingen. Forfatterne takker Dr. Lars Tatenhorst for hjælp med videography og Birgit Liebau om hjælp med lyd og video redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
- Gurney, M. E. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Weydt, P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Miana-Mena, F. J. Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS. Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).
- Zhong, Z. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).
- Pitzer, C. Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).
- Gowing, G. Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase. J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).
- Scott, S. interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
- Corse, A. M. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).
- Knippenberg, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).
- Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Neuromuscular disease models and analysis. Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).
- Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model. Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).
- Ludolph, A. C. Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting. Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).
- Boillee, S. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).
