Summary
Un modelo de ratón para la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es un examen clínico y de comportamiento. Como un requisito previo para un análisis inmunohistoquímico acompaña la preparación de la médula espinal se representa en detalle.
Abstract
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es un trastorno neurodegenerativo fatal que resulta en la degeneración progresiva de neuronas motoras. Pico de aparición es de alrededor de 60 años de la enfermedad esporádica y alrededor de 50 años para la enfermedad familiar. Debido a su curso progresivo, el 50% de los pacientes mueren dentro de los 30 meses del inicio de los síntomas. Con el fin de evaluar nuevas opciones de tratamiento para esta enfermedad, los modelos genéticos de ratón de la ALS se han generado sobre la base de las mutaciones humanas familiares en el gen SOD, tales como la SOD1 (G93A) mutación. Aspectos más importantes que tienen que ser evaluadas en el modelo son la supervivencia global, la evolución clínica y la función motora. En este caso, se demuestra la evaluación clínica, muestran la realización de dos pruebas de motor de comportamiento y proporcionar sistemas cuantitativos de calificación para todos los parámetros. Debido a un análisis en profundidad del modelo de ratón de ALS por lo general requiere un examen inmunohistoquímico de la médula espinal, que demuestran su preparación en detalle la aplicación de la vermétodo de laminectomía rsal. Los ejemplos de los hallazgos histológicos se ha demostrado. La aplicación completa de los métodos de examen que aparecen en los estudios sobre el modelo de ratón de la ELA permitirá a los investigadores para probar de forma fiable las futuras opciones terapéuticas que pueden servir de base para los ensayos clínicos más humanos.
Protocol
Los animales fueron adquiridos de Jackson Laboratory (# 002726) 1. Se anotó clínicamente y se sometió a una prueba de función motora (rotarod prueba) y de la fuerza muscular (colgando prueba de hilo). Todas estas pruebas y el asesinato posterior de los animales a fin de preparar la médula espinal se han realizado de acuerdo muy cerca de las directrices locales para la correcta realización de los experimentos con animales.
1. Puntuación clínica
Aparte de la evaluación para los ratones de peso corporal se examinan en busca de signos de déficit motor con el siguiente sistema de puntuación de 4, punto 2:
4 puntos: normal (sin signos de disfunción motora)
3 puntos: los temblores de las extremidades traseras son evidentes cuando se suspendió por la cola
2 puntos: alteraciones de la marcha están presentes
1 punto: arrastrando de por lo menos una extremidad posterior
0 puntos: simétricaparálisis, incapacidad para derecho propio o pérdida de 20% del peso corporal máximo, en este caso los animales son sacrificados inmediatamente y el experimento se termina
2. Las pruebas de la función motora y la fuerza muscular
Suspensión de la cuerda
Esta prueba se utiliza para evaluar la fuerza muscular 3, 4. Todos los animales de realizar esta prueba por lo menos uno o dos días después de la prueba rotarod. Cada ratón se sitúa sobre una tapa de alambre a la medida, con intervalos de 0,8 cm y con cautela al revés, 60 cm por encima de una cubierta de paja inferior. Después de entrenar durante tres veces consecutivas de al menos 180 s la latencia se mide a caer. Cada ratón se da hasta tres intentos de aferrarse a la tapa invertida por un máximo de 180 s, y el período más largo se registra.
Rotarod prueba
3, 4. Un buen desempeño requiere de un alto grado de coordinación sensoriomotora. La máquina debe ser colocado en un ambiente tranquilo y no molesto a evitar los estímulos de distracción para el animal a prueba. Se compone de un equipo controlado accionado por motor del husillo giratorio y cinco carriles durante cinco ratones. Caídas de los ratones se detectan automáticamente por la presión sobre una placa de plástico en la parte inferior. Después de la formación de tres veces consecutivas de al menos 180 s a una velocidad constante de 15 rpm, el tiempo para que un animal puede permanecer en la varilla giratoria se mide. Cada animal se somete a tres pruebas y el más largo de latencia, sin caer se registra. El tiempo de 180 s es elegido como corte de tiempo porque la mayoría de las diferencias significativas en la coordinación motora se detectan en este período de tiempo.
3. Preparación de la médula espinal
- Los animales se mataron por insuflación de CO 2 de acuerdo con las directrices locales y son inmediatamente perfundidos transcardialmente con solución de PBS seguido por una solución de paraformaldehído al 4%.
- A fin de preparar la médula espinal del ratón sacrificado, el animal se coloca sobre una mesa de operaciones y los cuatro miembros están fijos en el lado con el fin de exponer el lado posterior del ratón.
- Un corto de lavado con una solución de etanol al 70% limpia el sitio de la disección y se aplana la capa de pelo.
- A continuación, la piel se realiza una incisión con un bisturí afilado en la línea media. Con el fin de facilitar el corte de la piel se estira a ambos lados. Si los músculos de las piernas se prepararán, su piel también ha de realizarse una incisión.
- Después de la incisión de la piel se ha completado, se llevó a un lado con un par de pinzas para exponer la fascia subyacente superficial del cuerpo.
- La musculatura del cuello y el ligamento nucal tiene que ser eliminado y son carefully preparado. Tenga cuidado de no incidir en profundidad y la lesión de la médula espinal. Los músculos de los hombros también se puede quitar con el fin de exponer mejor la columna vertebral.
- Entonces los músculos paravertebrales se eliminan de toda la columna vertebral.
- Con el fin de abrir los laminectomías columna vertebral varios tienen que ser realizadas. Uno debe comenzar desde la parte superior de cráneo en el sitio de la articulación atlanto-occipital.
- Es más fácil para eliminar la fijación de la parte superior de dos miembros y estirar el cuello para estar en mejores condiciones para realizar la laminectomía de la primera vértebra. Estos se alejó, sin tocar la médula espinal cervical expuesta.
- Más vértebras se separan por primera transecting los arcos vertebrales en ambos lados con unas tijeras en ángulo y luego tirando de los procesos dorsales. El resto de las partes laterales de las vértebras debe ser eliminado para facilitar el posterior eliminación completa de la médula espinal.
- Un punto de referencia anatómica de la espina lumbarcable l es la intumescencia que también está presente en la médula espinal cervical.
- Una vez terminada la laminectomía de la médula espinal completa, asegúrese de que usted también seccionar todas las raíces ventrales y liberar la médula espinal de la duramadre de las meninges.
- A continuación, la médula espinal cervical se corta cranealmente y empezar a eliminar la médula espinal.
- Finalmente la médula espinal también se corta en la parte distal cauda equina, para ser completamente liberado.
- En última instancia, la médula espinal se coloca en una solución postfixating (por ejemplo paraformaldehído al 4%) durante la noche y se puede procesar más. Por lo general, criosección la médula espinal para prepararlo para el análisis inmunohistoquímico.
4. Los resultados representativos
La técnica de preparación de la médula espinal representa el foco de este artículo de vídeo. Es un requisito previo esencial para la sección de tejido más tarde y en última instancia, para el análisis inmunohistoquímico de la espinal secciones de la médula. Como un ejemplo de un resultado final, un estudio diagnóstico inmunohistoquímico de la región asta anterior de la médula espinal lumbar ratón de un tipo salvaje (wt) y de un SOD G93A transgén (TG) ratón se demuestra. Las neuronas motoras pueden ser identificados con un anticuerpo primario anti-CHAT anticuerpos y su posterior marcado fluorescente con una secundaria Cy3 anticuerpo. Además, un contador nuclear-mancha con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol) se ha realizado (Figura 1).
Figura 1. Fotomicrografías fluorescentes visualizar la inmunodetección de las motoneuronas con anti-CHAT anticuerpos (rojo) y núcleos celulares contra-tinción con DAPI (azul) en el ratón de la médula espinal lumbar de cuerno anterior de un tipo salvaje (wt) (a la izquierda) y de un SOD G93A transgénico (TG) (a la derecha) del ratón a la edad de 130 días. Barra de escala: 40 m.
A medida que el análisis inmunohistoquímico delos ratones SOD G93A no es el ámbito principal de este artículo, consulte la publicación original en el que estos ratones transgénicos han sido caracterizados y otras más recientes que estudian los enfoques terapéuticos para la referencia adicional de 1, 5, 6. Si los efectos terapéuticos se diferencian en el nivel inmunohistoquímico claramente definido algoritmos cuantitativos de evaluación debe ser aplicado con el apoyo de un software estereológicos (por ejemplo, ver 7).
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Discussion
La SOD1 (G93A) modelo de ratón genético es un modelo animal útil para estudiar el curso de la enfermedad de la pérdida de las motoneuronas progresiva comparable a la humana esclerosis lateral amiotrófica 8. Una variedad de diferentes modelos de tratamientos se han evaluado en este modelo y representan una base para después probar en humanos 8-10 estudios clínicos. Con el fin de ser capaz de detectar diferencias significativas en un estudio de tratamiento experimental en estos ratones, es de importancia eminente para incluir por lo menos 24 camada-emparejado con equilibrio de género ratones de los antecedentes genéticos mismo y seguir un diseño doble ciego 8. Comparable a los estudios clínicos en humanos, un criterio único criterio de valoración uniforme, debe ser elegido. Aquí, el más comúnmente utilizado es la incapacidad del animal a la derecha en sí en 30 segundos después de ser colocado en su lado. Si este criterio se alcanza el animal es sacrificado y su tiempo de vida se registra como el tiempo de supervivencia.
TratLos estudios nt se puede iniciar en un estado presintomático clínica (por ejemplo, en el día de la vida (DOL) 50 o incluso el Departamento de Trabajo 30), cuando los animales aún no presentan ningún signo de disfunción motora y se anotó con 4 puntos en nuestro sistema de puntuación clínica . Otra posibilidad consiste en un enfoque de tratamiento sintomático, que debe comenzar cuando el síntoma clínico aparece por primera vez y los temblores de las extremidades traseras son evidentes cuando el animal está suspendido por la cola. Esta se define como aparición de la enfermedad y esta etapa inicial de la enfermedad se califica con la puntuación clínica 3. Alteraciones significativas en las pruebas de la función motora y de la fuerza muscular en su mayoría se producen sólo más de dos a cuatro semanas más tarde. Al igual que en la media de los animales alcanzan la primera etapa de la enfermedad clínica en torno DOL 80, algunos investigadores comienzan su tratamiento sintomático para todos los animales en este punto del tiempo en un enfoque simplificado. En ambos escenarios es obligatorio controlar la progresión de la enfermedad. Esto se debe comenzar en el momento de iniciar el tratamiento de presymptomáticamente los animales tratados (DOL 50 o DOL 30, respectivamente) o en DOL 70 para los animales tratados sintomáticamente. Seguimiento de progresión de la enfermedad incluye la determinación dos veces por semana de peso corporal, la puntuación neurológica clínica y las pruebas de la función motora y la fuerza muscular. Si los animales alcanzan la puntuación clínica 1 (arrastre de por lo menos un miembro posterior) se recomienda realizar la determinación diaria del peso corporal y la vigilancia clínica a fin de no perder la puntuación clínica 0 puntos (parálisis simétrica, la incapacidad de derecho en sí mismo o la pérdida de 20 % del peso corporal como máximo), cuando los animales tienen que ser sacrificados de inmediato y el experimento se termina. Se recomienda que un examinador por primera vez se guía por un investigador experimentado que ayuda a los animales para detectar también sutiles signos clínicos de la progresión. La clínica de 4 puntos de calificación del sistema después de Weydt et al 2, está bien establecida en el campo y es un sistema confiable con criterios que pueden ser claramente diferenciados. Adiferenciación más sutil de los síntomas clínicos sería menos clara y muy dependiente de examinador.
Con el fin de detectar déficits de comportamiento de una variedad de paradigmas de prueba está disponible. La mayoría de los autores favorecen la prueba rotarod que evalúa la capacidad del animal para funcionar en un cilindro giratorio 4, 11. En un estudio que evalúa la importancia de las pruebas de comportamiento en el modelo de ratón SOD1 G93A la prueba rotarod demostrado ser muy sensible para detectar diferencias significativas entre ratones WT y transgénicos tan pronto como desde la semana 16 de edad el 11. Posibles modificaciones incluyen funcionando a una velocidad constante o una carrera de velocidad acelerada. En cualquier caso, los animales tienen que ser entrenados antes de la prueba válida en primer lugar porque algunos pueden necesitar más entrenamiento que los demás para obtener un nivel básico de la coordinación motora. Una limitación es representado por los animales de manera diferente motivación para realizar esta tarea. Esto, sin embargo, puede ser compensada por medio de pruebas repetidas de al menos ªree veces por día del examen. Otra prueba de comportamiento del motor que es muy sensible en la detección de déficits iniciales de motor es el análisis de la huella 11. Sin embargo, es muy laborioso porque los animales tienen que estar motivado para funcionar sobre una pasarela después de tener sus pies sumerge en un depósito de pintura. La calidad de la huella puede variar en gran medida y un software de análisis asistido por ordenador es difícil. Por lo tanto, se prefiere que el ensayo rotarod para la evaluación de la coordinación motora.
La prueba de hilo colgando evaluó la fuerza muscular de las extremidades. Es una prueba bastante crudo que mejor detecta déficits musculares principios de un par de semanas después del inicio de la enfermedad 4. Sin embargo, es muy fácil de realizar y el aparato de ensayo completo se puede construir fácilmente. Una prueba más elaborado para la fuerza muscular es el uso de un transductor de fuerza 12. En este caso, el ratón se le pide que tome una barra conectada a un transductor de fuerza, ya sea con la trasera o su planopatas. Otras pruebas funcionales que tienen que ser considerados incluyen la medición de la distancia rueda de funcionamiento o incluso la evaluación de campo abierto actividad 3, 13. Sin embargo, en nuestra experiencia, la combinación de la rotarod y la prueba de hilo colgando demostrado ser más sensible, fácilmente practicable y eficiente del tiempo para la evaluación de los ratones SOD1 G93A. En general, un estudio preclínico en animales deben ser diseñados con mucho cuidado y debe seguir los principios básicos de los estudios clínicos humanos como se describe en las guías CONSORT ( www.consort-statement.org ) 14. Sólo entonces, el uso de animales para la investigación preclínica se puede justificar y los resultados en última instancia, puede conducir a una traducción exitosa en una aplicación clínica en humanos.
Estos hallazgos clínicos y de comportamiento siempre debe estar correlacionada con un análisis de la patología de la unidad neuromuscular incluyendo la médula espinal motolas neuronas, axones y unión neuromuscular 14. Aquí, un análisis de alta calidad de los sistemas CNS patología de la médula espinal es un requisito previo para la interpretación de los efectos en la supervivencia o la progresión de la enfermedad. Debido a la fijación del tejido profundo es crítico, la perfusión de los animales con una paraformaldehído 4% que contenía PBS-solución debe ser normalizado bien. Con el fin de ser capaz de eliminar cuidadosamente la médula espinal una mesa de disección debe ser instalado junto con un microscopio operación fija y finos instrumentos quirúrgicos tienen que estar disponibles (véase la lista de los instrumentos quirúrgicos a continuación). Después de la médula espinal entera se ha eliminado, puede ser procesada para la técnica de seccionamiento adecuado (por ejemplo vibrátomo o cryotome) y, finalmente, puede ser sometido a análisis inmunohistoquímico. Aquí, los parámetros básicos de evaluación son los números de las motoneuronas de la médula espinal y activan o infiltrarse en las células gliales 10, 15. Dependiendo de la pregunta de investigación original, m inmunohistoquímico adicionalarkers como agregados de SOD o la integridad del endotelio del SNC pueden ser evaluados. Además, el sistema nervioso periférico patología de la enfermedad puede ser evaluada mediante el examen de los axones de nervios periféricos y de las uniones neuromusculares. Sólo la combinación de los análisis clínicos y de inmunohistoquímica de SNC y SNP proporcionan una visión completa de la patología general de ELA que tiene que estar correlacionada con los hallazgos clínicos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
LT ha recibido apoyo económico del Forschungsförderungsprogramm de la Medicina de la Universidad de Gotinga. PL y MB fueron apoyados por el Centro de Investigación DFG para la Fisiología Molecular del Cerebro (CMPB), Göttingen. Los autores agradecen al Dr. Lars Tatenhorst para obtener ayuda con la videografía y Liebau Birgit ayuda para edición de audio y vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
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