Summary
Amiyotrofik lateral skleroz (ALS) için bir fare modelinde klinik ve davranışsal incelenmiştir. Beraberindeki immünohistolojik analizi için bir önkoşul olarak omurilik hazırlanmasında detaylı bir şekilde anlatılır.
Abstract
Amyotrofik lateral skleroz (ALS) motonöronlar ilerleyici dejenerasyon ile sonuçlanan ölümcül bir nörodejeneratif hastalıktır. Başlangıçlı Tepe sporadik hastalık ve ailesel hastalık için 50 yıl 60 yıl civarındadır. Ilerici seyri nedeniyle, hastaların% 50 semptom başlangıcından itibaren 30 ay içinde ölür. Bu hastalığın tedavisi için yeni bir seçenek değerlendirmek üzere, ALS genetik fare modelleri gibi SOD1 (G93A) mutasyonu olarak SOD geni insan ailevi mutasyonlar, esas oluşturulan edilmiştir. Modelinde değerlendirilmesi gerekir en önemli husus, genel sağkalım, klinik seyir ve motor fonksiyon vardır. Burada, klinik değerlendirme göstermek, iki davranışsal motor testleri ile iletim göstermek ve tüm parametreler için kantitatif skorlama sistemleri sağlamaktadır. ALS fare modelinin kapsamlı bir analizi genellikle spinal kord bir immunohistokimyasal inceleme gerektirdiğinden, biz bunu uygulayarak ayrıntılı olarak hazırlanması göstermekrsal laminektomi yöntemi. Örnek histolojik bulgular gösterilmiştir. ALS fare modeli üzerinde çalışmalar tasvir muayene yöntemlerinin kapsamlı bir uygulama araştırmacının güvenilir sonra insan klinik araştırmalar için bir temel sağlayabilir gelecekteki tedavi seçenekleri test sağlayacaktır.
Protocol
Hayvanlar Jackson Laboratory (# 002.726) 1 den satın alınmıştır. Onlar klinik attı ve motor fonksiyon (rotarod testi) ve kas gücü (tel deneyi asılı) bir teste tabi tutulmaktadır. Tüm bu testleri ve hayvanların daha sonra öldürülmesi omurilik hazırlamak amacıyla hayvan deneyleri bir şekilde yürütülmesi için Yerel yönergelere çok yakın uygun olarak yapılmıştır.
1. Klinik Puan
Apart vücut ağırlığı fareler için değerlendirme aşağıdaki 4 nokta skorlama sistemi 2 ile motor defisit belirtileri açısından incelenir:
4 puan: Normal (motor disfonksiyon bulgusu)
3 puan: kuyruk tarafından askıya zaman arka bacak titreme belirgindir
2 puan: yürüyüş anormallikleri mevcut
1 puan: en az bir arka bacak sürükleyerek
0 puan: simetrikfelç, kendisinin sağ yeteneksizliği ve maksimum vücut ağırlığının% 20 kaybı, bu durumda, hayvanlarda hemen ötenazi ve deney sona erdirilir
2. Motor Fonksiyon Testleri ve Kas Gücü
Tel Hanging
Bu test, kas gücü 3, 4 değerlendirmek için kullanılmıştır. Tüm hayvanlar en az bir veya iki gün rotarod testinden sonra bu testi yapın. Her fare 0.8 cm aralıklarla özel yapılmış tel kapak yerleştirilir ve dikkatli tepetaklak olur, bir saman üstünde 60 cm alt kaplı. En az 180 s art arda üç kez eğitim aldıktan sonra düşmeye gecikme ölçülür. Her fare, 180 s maksimum ve en uzun süre kaydedilir için ters kapak üzerinde tutmak için üç deneme verilir.
Rotarod Testi
3, 4 öğrenme ölçmek için kullanılmıştır. İyi bir performans sensorimotor koordinasyonu yüksek derecede gerektirir. Makine test hayvan için Distraktif uyaranlara önlemek için sakin ve rahatsız edici olmayan bir ortamda yer almalıdır. Bu beş fareler için bir bilgisayar kontrollü motorlu dönen milli ve beş şerit oluşur. Farelerin Falls altındaki bir plastik levha üzerine basınç ile otomatik olarak tespit edilir. 15 rpm bir hayvan dönen çubuk kalabilecekleri süreyi sabit bir hızda en az 180 s art arda üç kez eğitim ölçülür sonra. Her hayvan düşüyor kaydedilir olmadan üç denemeler ve uzun gecikme uğrar. Motor koordinasyonu açısından önemli farklılıklar çoğunluğu bu süre içinde tespit edilir, çünkü 180 s zaman kesme süresi olarak seçilmiştir.
3. Omurilik Hazırlık
- Hayvanlar Yerel yönergelere uygun olarak CO 2 insuflasyon tarafından öldürüldü ve hemen% 4 paraformaldehit çözümü takip PBS çözeltisi ile transkardiyal perfüze edilir.
- Kurban fare spinal kord hazırlamak için, bir farenin arka tarafı açığa çıkarmak için hayvanın bir işlem tablosu üzerine yerleştirilir ve dört ayaklarının tarafında sabitlenir.
- % 70 etanol çözeltisi ile kısa bir yıkama diseksiyon sitesi temizler ve saç kat düzleştirir.
- Sonra cildin orta hat keskin bir bisturi ile insize edilir. Cilt her iki taraf için gerilir kesme kolaylaştırmak için. Bacak kasları hazırlanacak olursa, onların deri de insize lazım.
- Cilt insizyonu tamamlandıktan sonra, vücudun alttaki fasyaya maruz cımbız ile kenara çekilir.
- Boyun ve ense ligament kas ca kaldırılması gerekir ve vardırrefully hazırlanır. Derin ve lezyon omuriliğe kesilirken dikkat edin. Omuz kaslarının daha iyi omurga ortaya koymak için çıkarılabilir.
- Sonra paravertebral kas tamamını omurga kaldırılır.
- Omurga çok laminektomileri yapılması gerekir açmak üzere. Bir atlanto oksipital eklem yerinde üst kranial kısmından başlamalıdır.
- Bu üst iki ekstremite fiksasyon kaldırmak ve ilk vertebra laminektomi gerçekleştirmek için daha iyi yapabilmek için boyun yayılmacılık en kolay yoldur. Bunlar maruz servikal spinal kord dokunmadan çekti edilir.
- Daha çok omurun açılı ilk makasla her iki tarafında vertebra kemerler transecting ve sonra dorsal işlemleri üzerinde çekme ile kaldırılır. Vertebra Kalan yan kısımlarında omurilik sonra tümüyle kaldırılmasını kolaylaştırmak için çıkarılmalıdır.
- Lomber spina bir anatomik dönüm noktasıl kordonu da spinal kord mevcuttur kabarma olup.
- Tüm omurilik laminektomi bitirdikten sonra, aynı zamanda tüm ventral kökleri transeksiyonu ve menenjlerin duramater gelen spinal kord serbest olduğundan emin olun.
- Daha sonra servikal spinal kord kranialine kesilmiş ve omurilik kaldırmak başlatın.
- Son olarak omuriliğe de tamamen serbest olması distal kauda-equina kesilir.
- Sonuçta, omurilik gecede postfixating çözüm (örneğin% 4 paraformaldehit) yerleştirilir ve daha fazla işlenebilir. Biz genellikle immünohistolojik analiz hazırlamak için omurilik cryosection.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Omurilik hazırlama tekniği bu video makalenin odak temsil eder. Daha sonra doku kesit ve sonuçta spina ile immünohistolojik analizi için gerekli bir ön koşuldurl kablosu bölümler. Bir sonuç bir örnek olarak, bir wild tip bir fare lumbar spinal kord (wt) ön boynuzu bölge ve bir SOD G93A transgen (Tg) ve bir ayırma işlemlerine tabi tutmak immunohistokimyasal fare gösterilmiştir. Motor nöronlar, bir primer, anti-ChAT antikor ve bir ikincil Cy3 antikoru ile sonradan flüoresan etiketleme ile tespit edilebilir. Buna ek olarak, DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) ile bir karşı-Nükleer leke (Şekil 1) yapılmıştır.
Şekil 1. Anti-ChAT antikor (kırmızı) ve wild tip (ağırlık), fare lomber spinal kord ön boynuz (solda) ve bir DAPI (mavi) ile hücresel çekirdekleri karşı leke ile motonöronlar ve İmmuno görselleştirmek Floresan fotomikrografı Bir SOD G93A transgenik (tg) (sağda) 130 gün yaşındayken fare. Ölçek çubuğu: 40 mikron.
Ve immünohistokimyasal analiziSOD G93A farelerin bu makalenin ana kapsamında değildir bu transgenik fareler karakterize edildiği orijinal yayın ve diğer referans 1, 5, 6 yönelik tedavi yaklaşımları incelemek daha yeni olanlarla danışın. Tedavi edici etkileri açıkça tanımlanmış immünohistolojik düzeyde ayırt edilir ise kantitatif değerlendirme algoritmaları stereolojik bir yazılım (örneğin 7) tarafından desteklenen uygulanan edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SOD1 (G93A) genetik fare modelinde insan Amyotrofik lateral skleroz 8 karşılaştırılabilir ilerleyici motor nöron kaybı, hastalığın klinik seyrini incelemek için değerli bir hayvan modelidir. Farklı tedavi paradigmalarının çeşitli bu modelin içinde değerlendirilerek daha sonra insan klinik çalışmalarda 8-10 test için bir temel temsil edilmiştir. Bu farelerde deneysel bir tedavi çalışmasında önemli farklılıklar tespit edebilmek için, en az 24 çöp eşleştirilmiş cinsiyet dengeli aynı genetik kökenli fare içerir ve bir çift-kör tasarım 8 izlemek için seçkin bir öneme sahiptir. Insan klinik çalışmalarda karşılaştırılabilir, tek bir nokta üniform kriterine seçilmelidir. İşte, en sık kullanılan bir yan konuyor 30 saniye sonra kendini sağa hayvan zaaftır. Bu kriter dolarsa hayvan kurban edilir ve ömür boyu hayatta kalma süresi olarak kaydedilir.
Treatment çalışmalar presemptomatik klinik durumuna başlamış olabilir (yaşam gün (DOL) örn. DOL 30, 50 veya hatta) hayvanlar henüz motor disfonksiyon belirtisi göstermezler ve klinik skorlama sistemi 4 puan ile atılır olurdu . Bir başka olasılık ilk klinik belirti görünür ve hayvan kuyruk tarafından askıya alındığında arka bacak titreme belirgindir zaman başlamalıdır bir semptomatik tedavi yaklaşımı oluşur. Bu hastalık başlangıcı olarak tanımlanır ve bu ilk evre hastalık klinik skor 3 puan verilmektedir. Motor fonksiyon ve kas gücü testleri belirgin bozukluklar çoğunlukla sadece daha 4-2 haftadan sonra ortaya çıkar. Hayvanlar DOL 80 ilk klinik hastalığın evresi ulaşmak ortalama olarak, bazı araştırmacılar, basit bir yaklaşım bu kez noktasında tüm hayvanlar için semptomatik tedavi başlar. Her iki ayar yılında hastalığın ilerlemesini izlemek için zorunludur. Bu presymp tedavi inisiyasyon zamanda başlanmalıdırtomatically semptomatik tedavi hayvanlar için hayvan (DOL 50 veya sırasıyla DOL 30) veya DOL 70 tedavi. Hastalığın ilerlemesi İzleme vücut ağırlığı, nörolojik klinik skorlama ve motor fonksiyon testleri ve kas kuvveti bir haftada iki kez tespitini kapsar. Hayvanların klinik skor 1 (en az bir arka bacak sürükleyerek) ulaşırsanız, 20 kendisini sağ veya kaybı klinik skor 0 noktası (simetrik felç, yetersizlik kaçırmamak için vücut ağırlığı ve klinik izleme günlük tespiti yapılmasını önermekteyiz Maksimum vücut ağırlığının%) hayvanlarda hemen ötenazi edilmesi ve deney sona erdirilir sahiptir. Bu ilk kez sınav da ilerleme ince klinik bulguları tespit etmek için yardımcı deneyimli bir hayvan araştırmacı tarafından yönlendirilir önerilir. Weydt ark 2'den sonra klinik 4 nokta skorlama sistemi de alanda kurulmuş ve açıkça ayırt edilebilir kriterleri kullanarak güvenilir bir sistemdir edilir. Aklinik semptomlar daha ince farklılaşma daha az net ve yüksek sınav bağımlı olacaktır.
Davranış problemleri tespit etmek için test paradigmalar çeşitli mevcuttur. Çoğu yazar dönen bir silindir 4, 11 çalıştırmak için hayvanın yeteneğini değerlendirir rotarod testi lehine. SOD1 G93A fare modelinde davranış testleri önemini değerlendiren bir çalışmada rotarod test olarak erken yaşta 16. hafta itibariyle 11 wild tip ve transgenik fareler arasında önemli farklılıklar tespit edilmesinde çok hassas olduğunu kanıtladı. Olası değişiklikler sabit bir hızda veya hızlandırılmış bir sürat çalışan bulunmaktadır. Her durumda, hayvanların bazı motor koordinasyon temel seviyede elde etmek için diğerlerine göre daha fazla eğitim gerekebilir çünkü ilk geçerli test etmeden önce eğitim almak zorunda. Bir sınırlama Bu görevi gerçekleştirmek için farklı motive hayvanlar tarafından temsil edilmektedir. Ancak, bu en az th tekrarlanan testler telafi edilebilirmuayene günlük ree kez. Erken motor defisit saptamada çok duyarlı bir diğer motorun davranış testi ayak izi analizi 11'dir. Hayvanların ayaklarının boya bir rezervuar içine daldırılır yaptıktan sonra bir iskele üzerinde çalıştırmak için motive edilmelidir çünkü Ancak, oldukça zahmetli bir iştir. Izi kalitesini büyük ölçüde değişebilir ve bir yazılım destekli analiz zordur. Bu nedenle, motor koordinasyon değerlendirilmesi için rotarod testi tercih ederler.
Askı teli testi bacaklarda kas gücü değerlendirildi. En iyisi bir kaç hafta hastalığı 4 başlandıktan sonra erken kas açıklarını tespit eden oldukça kaba bir testtir. Bununla birlikte, bu gerçekleştirmek için oldukça kolaydır ve tüm test cihazı kolayca oluşturulabilir. Kas gücünün için daha ayrıntılı testi bir kuvvet transdüktör 12 kullanılmasıdır. Burada, fare, arka ya da ön plana da bir kuvvet dönüştürücü bağlı bir bar kapmak için istenirpatilerini. Dikkate alınması gereken diğer fonksiyonel testler çalışan tekerlek mesafe ölçümü, hatta açık alanda aktivite 3 değerlendirilmesi, 13 içerir. Ancak bizim deneyim rotarod ve asılı tel test kombinasyonu, en hassas kolay uygulanabilir ve zaman SOD1 G93A farelerin değerlendirilmesi için etkin olduğu kanıtlanmıştır. Genel olarak, hayvanlarda bir preklinik çalışmada çok dikkatli bir şekilde tasarlanmış olmalıdır ve CONSORT kurallar (anlatıldığı gibi bir insan klinik çalışmaların temel ilkelere uygun olmalıdır www.consort-statement.org ) 14. Ancak o, preklinik araştırma için hayvanların kullanılması haklı görülebilir ve sonuçları sonuçta bir insan klinik uygulama başarılı bir çeviri yol açabilir.
Bu klinik ve davranışsal bulgular her zaman omurilik motor dahil olmak üzere nöromüsküler biriminin patolojinin bir analiz ile korele edilmelidirnöron, akson ve nöromusküler 14. Burada, MSS omurilik patoloji yüksek kaliteli bir analiz hayatta kalma ya da hastalık seyrinde etkilerinin yorumlanması için bir ön koşuldur. Ayrıntılı doku fiksasyon önemli olduğundan, PBS-çözeltisi içeren bir% 4 paraformaldehit hayvanların perfüzyon iyi standardize edilmelidir. Dikkatli omurilik kaldırmak mümkün olabilmesi için bir diseksiyon tablo sabit bir operasyon mikroskobu ile birlikte yüklenir ve ince cerrahi aletler kullanılabilir olması (aşağıda cerrahi aletlerin listesine bakın) olmalıdır. Tüm spinal kord çıkarıldıktan sonra, bunun uygun kesit tekniği (örn. vibratome ya cryotome) ile işlenebilir ve nihayet immünohistolojik analizine tabi tutulabilir. Burada, temel değerlendirme parametreleri omurilik motonöronlar ve aktif veya infiltre glial hücreleri 10, 15 numaraları vardır. Ek immünohistokimyasal m, özgün araştırma sorusu bağlıSOD toplamları veya MSS endotel bütünlüğü gibi arkers değerlendirilebilir. Ayrıca, periferik sinir sistemi hastalığı patolojisi periferik sinir akson ve kas kavşağı incelenmesi ile değerlendirilebilir. CNS ve PNS klinik ve immünohistokimyasal hem analizler Sadece kombinasyonu klinik bulgular ile korele edilmelidir genel ALS patoloji kapsamlı bir görünümünü sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
LT Üniversitesi Tıp Göttingen Forschungsförderungsprogramm gelen hibe desteği almıştır. PL ve MB Beyin (CMPB), Göttingen Moleküler Fizyoloji için DFG Araştırma Merkezi tarafından desteklendi. Yazarlar, ses ve video düzenleme ile yardım videografisi ve Birgit Liebau yardım için Dr Lars Tatenhorst teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
- Gurney, M. E. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Weydt, P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Miana-Mena, F. J. Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS. Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).
- Zhong, Z. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).
- Pitzer, C. Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).
- Gowing, G. Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase. J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).
- Scott, S. interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
- Corse, A. M. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).
- Knippenberg, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).
- Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Neuromuscular disease models and analysis. Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).
- Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model. Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).
- Ludolph, A. C. Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting. Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).
- Boillee, S. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).
