Summary
インフルエンザウイルスは、宿主細胞のクロマチンに関連して、そのRNAゲノムを複製します。ここでは、感染細胞のクロマチンから無傷のウイルスのリボ核タンパク質複合体を精製する手法を提案する。ウイルスの複合体を精製し、それぞれウェスタンブロット、タンパク質およびRNA含量のプライマー伸長の両方で解析することができます。
Abstract
すべてのマイナス鎖RNAウイルスと同様に、インフルエンザウイルスのゲノムは一本鎖ゲノムは核タンパク質（NP）で包まれ、構成される三量体ポリメラーゼ複合体と関連付けされているウイルスのリボ核タンパク質複合体（vRNPを）の形でパッケージ化されていますPA、PB1、PB2サブユニットとの。しかし、ほとんどのRNAウイルスとは対照的に、インフルエンザウイルスは、感染細胞の核内にウイルスのRNA合成を実行します。興味深いことに、ウイルスmRNAの合成は、プライマーとして、携帯プレmRNAを使用しており、それは、このプロセスは、クロマチン1日に行われることが提案されている。ウイルスポリメラーゼ及び宿主RNAポリメラーゼIIと同様に、NPとホストヌクレオソーム間の相互作用はまた、1,2特徴づけられている。
最近では、One-Strepタグをコードする組換えインフルエンザウイルスの発生は遺伝的であるウイルスポリメラーゼのPB2サブユニットのC末端（rWSN-PB2-球菌3）にした融合enは説明します。これらの組換えウイルスは、感染細胞からのvRNPsなど、PB2を含む複合体の精製を可能にします。精製されたvRNPsを取得するために、培養細胞が感染されており、vRNPsは、親和性、これらの細胞から派生したライセートから精製されています。ただし、日付に使用される溶解の手順は、一般的なヌクレアーゼの存在にもかかわらず、しばしば唯一の非効率的にクロマチンに結合した物質を抽出し、ワンステップの洗剤溶解に基づいてされています。
私たちの予備的な作業は、核vRNPsの大部分は伝統的な細胞溶解中に抽出されなかったことを示唆し、したがって、アフィニティー精製することができませんでした。この抽出効率を高めるために、非クロマチン結合型核vRNPsからクロマチンに結合分離するために、我々は、インフルエンザウイルス感染細胞へ段階的に細胞内抽出プロトコルを適応した。簡単に言うと、このプロシージャは、最初のセルから核を分離し、（ここでは "nucleoplasmic"分数と呼ばれる）水溶性核タンパク質を抽出します。残りの不溶性の核物質は、その後ベンゾナーゼ、二つの塩の抽出手順に続いて非特異的なDNA / RNAヌクレアーゼで消化されます：最初の150mM NaClを（ "ch150"と呼ばれる）を使用し、500mMのNaCl（ "ch500"）（ 図1 。）これらの塩抽出の手順はまだ親和性マトリックスへのタグ付けvRNPsの結合を許可500mMのNaCl、まだ核vRNPsの85％以上を可溶化するのに十分であったという我々の観察に基づいて選ばれました。
感染細胞の細胞内分画後、それは、それぞれ個々の画分からPB2-タグvRNPsの親和性を精製し、それらの蛋白質およびウエスタンブロットおよびプライマー伸長を用いてRNA成分を分析することが可能である。最近、我々は3 500mMのNaCl（ch500）で抽出したクロマチン画分で感染した後に遅れてのポイントの間にそのvRNPをエクスポートする複合体の形を発見するためにこのメソッドを使用しました。
Protocol
プロトコルの概略フローチャートを図に示されています。 1と試薬のテーブルは以下に提示されています。
1。感染症（16から24時間）
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）高さは次の日（約5×10 8細胞）の約80％コンフルエントに達するようなグルコース培地、5 150ミリメートルのプラスチック細胞培養ディッシュにHeLa細胞外シード。細胞がコンフルエントに100％に達していないことが重要です。
- 次の日、にStrep-tag IIタグインフルエンザウイルスストックを希釈3の感染多重度にウシ血清アルブミン0.3％（BSA）を含む生理食塩水（PBS）をリン酸緩衝。
- 細胞から増殖培地を除去し、PBSで1回洗浄し、10 mlのPBSで細胞にウイルスを含む追加します。室温で1時間インキュベートする。
- DMEM高グルコースの感染媒体を交換し、37℃でインキュベーションを続ける℃に
2。細胞内分画（3 H）
- 冷PBSで1回細胞を洗浄し、ゴム製のスクレーパー及び50 mlコニカルチューブに移すと冷PBSで細胞を懸濁する。
- ペレットは、1,000 rpmで5分間、卓上遠心機で細胞とその後PBSを吸引除去する。
- 10ミリリットル冷ショ糖バッファー（10 mM HEPES pHは7.9、10mMの塩化カリウム、2mMのMgのアセテート（MgOAc）、3 mMのCaCl 2を 、340 mMスクロース、1 mMジチオスレイトール（DTT）、1％のプロテアーゼ阻害剤ミックス）に再懸濁し、細胞ペレット。サスペンション後、細胞塊を破壊するために10ミリリットルのプラスチック血清ピペットに取り付けられた200μlのピペットチップを介して細胞を渡します。
- 氷上で10分間インキュベートします。穏やかに細胞を再懸濁するために定期的に反転させる。
- 15秒間高速で0.5％と渦の最終濃度にノニデットP-40（NP-40）を追加します。すぐにテーブルトップ遠心で4℃で3500×gで10分間遠心geがあります。
- 4℃で上清とストアを削除℃にこれは、細胞質画分である。ペレットは、元の細胞ペレットよりも小さく、白くなければなりません。すべての画分を4℃で少なくとも4時間保存することができます
- ステップ2.5のように5 mlの冷ショ糖バッファー、再遠心機でペレットを洗浄し、上清を捨てる。
- 1.5ミリリットル冷たいnucleoplasmic抽出緩衝液（50mMのHEPES pHは7.9、150mMのKOAc、1.5mMのMgCl 2、0.1％NP-40、1mMのDTT、1％のプロテアーゼ阻害剤·ミックス）でペレットを（核を含む）を再懸濁します。
- タイトフィット乳棒を用いて冷却した、すべてのガラス4ミリリットルDounceホモジナイザーに移し、20ストロークで核を均質化する。
均質化時に発泡しないようにしてください。抵抗は約10ストロークの後に増やす必要があります。効率的な均質化は、位相差顕微鏡下で確認することができます。 - 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに均質化した核を移し、4℃で回転するホイールの20分間インキュベートしC.
- 10分間、4℃で遠心で16000×gで遠心します。
- 4℃で上清とストアを削除℃にこれはnucleoplasmic画分である。
- 1.5 mlの消化緩衝液（50mMのHEPES pHは7.9、10mMのNaCl、1.5mMのMgCl 2、1mMのDTT、1％のプロテアーゼ阻害剤ミックス、100 U / mlのベンゾナーゼ（RNA解析のために、20 U / mlのRNaseを持つ代替でペレットを再懸濁しフリーのDNase I））事前に温めた37℃、37℃で10分間インキュベート℃、
- 5 MのNaCl（150mMのNaClの最終濃度）を42μlを加え、4時20分さらにインキュベート℃、
- 10分間、4℃で遠心で16000×gで遠心します。
- 4℃で上清とストアを削除℃にこれはch150画分である。
- ペレットを再懸濁し、1.5 mlの冷高塩緩衝液（50mMのHEPES pHは7.9、500mMのNaCl、1.5mMのMgCl 2、0.1％NP-40、1mMのDTT、1％のプロテアーゼ阻害剤ミックス）と氷上で20分間インキュベートする。
- 16000×gで遠心</ em>は、10分間4℃で遠心インチ
- 4℃で上清とストアを削除℃にこれはch500画分である。
3。 Strepタグ精製（2時間）
- 細胞質画分（150mMのNaClの最終濃度のために）の5 M NaClを300μlを追加します。
- 15 mlコニカルチューブに分ごとにパックされたのStrep-Tactinセファロースビーズのアリコートを100μlの。
- 卓上で混合し、1,000×gで5分間遠心するチューブを反転、ビーズに球菌洗浄バッファー（20mMのHEPES pHは7.9、150mMのNaCl（ch500サンプルの500mMのNaCl）、1mMのEDTA）の10冊を追加します。遠心します。
- 、上清を捨て、ステップ3.3回繰り返し、その後、連鎖球菌の洗浄緩衝液を等量にビーズペレットを再懸濁します。
- 各分画するために洗浄のStrep-Tactinビーズスラリー（nuceloplasmicのために1.5 mlのマイクロ遠心チューブ、ch150、ch500と分画と細胞質画分の15 mlコニカルチューブ）200μlを添加します。
- 回転させるチューブを4℃1H°回転ホイール上のC。
- チューブ4で1,000×gで1分間℃を遠心分離上清を捨てる。
- 各チューブに1 mlの冷球菌の洗浄緩衝液を追加します。 1.5 mLのチューブに15 mLの試験管（細胞質画分）からビーズを転送します。 4で全てのチューブ1分°C、ステップ3.7のようにした後、遠心分離を洗う。二回の洗浄ステップを繰り返します。
- 最後の洗浄ステップの後、平らなピペットチップを使用して、洗浄緩衝液の痕跡をすべて削除します。 100μlの溶出バッファー（2.5mMのdesthiobiotinを含む連鎖球菌洗浄バッファー）を加え、穏やかに混ぜる。
- 氷上で15分間インキュベートします。優しくチューブの底をタップすることで時折ビーズを混ぜます。
- 遠心チューブ4で1000×gで1分°Cマイクロインチを含む上清を溶出したStrep-tag IIタグvRNPsを収集します。
4。代表的な結果
分別の効率は最高のantibを使用して分画し、溶解物のウエスタンブロット分析により判断される細胞内マーカー（ 図2）特定のodies。具体的には、成功した核内分別がnucleoplasmic、または可溶性核画分4のほとんど、あるいはまったく細胞のRNAポリメラーゼII（Pol II）を示すべきであり、ほとんどは150mMのNaCl 5で抽出する必要があります。はPol IIの劣化も再現文献6と一致して非感染細胞に比べて、インフルエンザウイルス感染細胞で観察されています。
図細胞質溶出液のために示されるようにvRNPsの精製は、最高の、銀またはクマシー染色により判断される。 3。我々の経験では、ほとんどのStrep-PB2が完全に形成されたvRNPの一環として、すなわち小さな水溶性ポリメラーゼがキャプチャされたで精製されています。銀またはクマシー染色により観察PA/PB1/PB2比：これは、高NPに反映されます。いくつかのユビキタスRNアーゼが（例えば、RNアーゼAなど）dissociのような方法で切断し、ウイルスRNAによく知られているような低い比率は、RNaseのでバッファの混入を示唆しているNP多量7からポリメラーゼを食べました。興味深いことに、単独でベンゾナーゼによる治療は、ウイルスRNAを消化するのに十分ながら、vRNPをタンパク質の化学量論比に影響を及ぼさないように見えます。我々はこの現象を説明することはできませんが、我々はベンゾナーゼは、特定の構造的に重要なRNA領域はそのまま残しておく可能性が示唆された、他のRNase（データは示さず）で消化後vRNPsの破壊を観察した。細胞質と核質（ヌクレアーゼ消化せずに実行）からvRNPsの精製した後、高分子量で8かすかなしかし、離散的なバンドは、8インフルエンザウイルスゲノムセグメントの予測分子量に相当する銀染色法、（リファレンスを参照してください。3で観察することができます。）
9時間の感染後に各画分から精製vRNPsの相対量は、 図に示されています。 4。 vRNPsの分布は、初期の時点でch150分で最強の蓄積と、感染の経過とともに変化し、後半の時点で核質と細胞質内蓄積を増加させた。
細胞内分画の図1のフローチャート。 refから適応した。 3。
図2インフルエンザウイルス感染細胞からの細胞内画分のウェスタンブロット分析。 10 9 HeLa細胞は、細胞内分画の前に9時間のインフルエンザウイルス株のWSNを感染させた。総タンパク質の等しい量は、各レーンにロードされ、示された抗体を用いて分析した。 RNAポリメラーゼII（Pol II）は、C末端ドメイン（hypophosphorylatedバンドが最も顕著である）のすべてのフォームを認識するクローン8WG16を使用して、検出された。 refから適応した。 3。
図3。精製vRNPsの銀染色分析。 HeLa細胞は、細胞質画分から連鎖球菌精製に続いて、9時間rWSN（ネガティブコントロール）またはrWSN-PB2-連鎖球菌に感染させた。アスタリスクはRNase消化後表示されていないバンドを示します。 refから適応した。 3。
図4：異なる細胞分画から精製されたvRNPsの銀染色分析。 10 9 HeLa細胞はHが細胞内分画およびStrep精製に続いて9にrWSN-PB2-連鎖球菌またはrWSNを感染させた。各画分から溶出液の等量がロードされた。 refから適応した。 3。
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Discussion
多くの研究が最近、個々のタンパク質やインフルエンザウイルス感染8に関与する細胞のネットワークを識別しているが、これらの相互作用の大部分の機能的意義は不明である。インフルエンザウイルスRNA合成と核9の複雑な生物物理学的および生化学的性質のためにクロマチンベースの関数の絶対的な依存性を考えると、新技術は、これらの機能を解明する必要があります。 vRNPsのアフィニティー精製と相まって我々はここで紹介する核内分画は、以前にアクセスできなかった重要なウイルスRNA工場の特性評価を可能にします。
多くの細胞内分画のプロトコルは、以前に文献に記載されている。我々は、これら従来の方法のほとんどは核も、ポルII 10で説明した現象からvRNPsの早期漏洩につながることを観察した。低Cでプリ膨らんだ細胞の短いインキュベーションを用いて重要な核漏れせずに発生した弱い洗剤、NP-40、効率的な細胞膜溶解のoncentration。興味深いことに、A549およびHEK293T細胞よりもむしろ細胞株の両方でvRNPsの強い核の漏れにつながったHeLa細胞を用いて私たちの細胞下分画を行う。約0.2％NP-40濃度を下げると、この問題を減少させますが、これらの細胞のいくつかの変動により、最適な条件は、経験的に決定する必要があります。別の可能性altermativeは、MDCKやVero細胞などの非ヒトインフルエンザウイルス感受性細胞株の使用です。
私たちの塩抽出プロトコルはしばしば低塩濃度および/または高濃度のEDTAを使用する従来のクロマチン抽出手順とは異なります。我々のプロトコルは、2つの特定の画分、ポル·II-high/histone-low分画と、その逆数にクロマチンを分離しています。しかし、他のクロマチン抽出方法はまた、VRNのアフィニティー精製と互換性があるかもしれpsの。タンパク質間相互作用に比べて、ほとんどのクロマチン抽出手順は、DNA-タンパク質相互作用に焦点を当てているので、新しい技術は密接にクロマチンに結合した多タンパク質複合体11を抽出する必要があります。
一般に、感染の長さは、ウイルス株および細胞株の間で変動による経験的に決定されるべきである。 MOI 3の時rWSN-PB2-球菌株を使用して、我々は3〜10時間の感染後に様々な時点で細胞内分画を行った。強力な細胞変性効果と分数の後続の混合で3時間の結果よりも感染症は長い間我々の経験では、感染未満の3時間は、有用なウェスタンブロット解析のための数が少なすぎる精製vRNPsをもたらします。
そのまま、しっかりとクロマチンに結合したウイルスの複合体を分離する能力は、いくつかの可能性を開きます。我々は、Strep-tag IIタグPB2、他のアフィニティタグを発現する組換えウイルスも同様にトラッドなど、使用することができる利用しながらitional免疫沈降は、他のウイルスタンパク質を標的と。 vRNPsの我々の分析は、それらの蛋白質とRNA成分の特性に限定されていながら、さらに、精製された複合体はまた、in vitro合成アッセイで機能を実行するために使用することができる。最後に、核内分別を通して粗い機能の種にvRNPsの分離がさらに効率的なウイルスRNA合成12,13に必要なウイルスタンパク質のいくつかの最近記載された翻訳後修飾の緊密な研究を可能にすることができる。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、rWSN-PB2-球菌ウイルスの灘Naffakhとマリー·アンRameix-Welti（パスツール研究所）に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | SERVA Electrophoresis | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | Thermo Fisher Scientific, Inc. | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type "B" pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
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