Summary
Grip virüsleri konak hücre kromatin ile birlikte kendi RNA genomu çoğaltmak. Burada, enfekte olmuş hücrelerin kromatin gelen sağlam virüs ribonükleoprotein kompleksleri arındırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Viral kompleksleri Arıtılmış sırasıyla, Western blot ve protein ve RNA içerikleri astar uzantısı hem de analiz edilebilir.
Abstract
Tüm negatif dallı RNA virüsleri gibi, influenza virüs genomu tek zincirli genom nükleoprotein (NP) tarafından kapsül içine, ve oluşan trimeric polimeraz kompleksi ile ilişkili olduğu viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNP), formunda paketlenmiş PA, PB1 ve PB2 alt birimlerinin. Bununla birlikte, çoğu RNA virüslerinin aksine, influenza virüs enfekte olmuş hücreler, çekirdeklerinde viral RNA'nın sentezi gerçekleştirmek. İlginçtir, viral mRNA sentezi primer olarak hücresel öncesi mRNA'ların kullanır ve bu süreç kromatin 1 gerçekleşir ileri sürülmektedir. Viral polimeraz ve konak RNA polimeraz II yanı sıra, NP ve ev sahibi arasındaki nükleozom arasındaki etkileşimlerin da 1,2 karakterize edilmiştir.
Yakın zamanda, bir tek Strep-Tag kodlayan rekombinant influenza virüsünün üretimi genetik olarak viral polimeraz PB2 alt biriminin C-terminali (RWSN-PB2-Strep 3) kadar olan kaynaşmıştr nitelendirdi. Bu rekombinant virüsler enfekte olmuş hücreler arası vRNPs dahil olmak üzere PB2-içeren kompleksleri, bir saflaştırma izin verir. VRNPs saflaştırılmış elde etmek için, enfekte hücre kültürleri ve vRNPs bu hücreler elde lizatları arındırılan afinitesi vardır edilir. Ancak, bugüne kadar kullanılan parçalama işlemleri genel bir nükleaz varlığına rağmen, çoğu zaman sadece verimsiz kromatin bağlı materyali çıkarmak, bir adım deterjan lizis dayalı olarak yapılmıştır.
Bizim ön çalışma nükleer vRNPs büyük bir kısmı geleneksel bir hücre parçalanması sırasında elde olmadığını düşündürmüştür ve bu nedenle afinite saflaştırılmış olamazdı. Bu ekstraksiyon verimini artırmak için, ve non-kromatin bağlı nükleer vRNPs gelen kromatin-bağlı ayırmak için, biz grip virüsü ile enfekte olmuş hücrelerde bir adım bilge Subselüler çıkarma protokolü uyarlanmıştır. Kısaca, bu prosedür ilk hücreden çekirdek ayırır ve daha sonra eriyen nükleer proteinler (burada "nucleoplasmic" fraksiyon olarak adlandırılır) ayıklar.Kalan çözünmeyen nükleer malzeme ardından Benzonase, iki tuz çıkarımı adımları takip belirsiz bir DNA / RNA nükleaz ile sindirilir: İlk 150 mM NaCl ("ch150" olarak adlandırılır) kullanılarak, daha sonra 500 mM NaCl ("ch500") (Şekil 1 ). Bu tuz ekstraksiyon adımları 500 mM NaCl henüz hala yakınlık matrisi tagged vRNPs bağlayıcı izin nükleer vRNPs% 85'inden çözünürleştirmek için yeterli olduğu konusunda bizim gözlemlerimize göre seçilmiştir.
Enfekte olmuş hücrelerin hücre içi fraksiyonasyon sonra, her bir fraksiyondan afinite purify PB2-etiketli vRNPs mümkündür ve protein ve sırasıyla, Western blot ve astar uzantısı, RNA kullanılarak analiz bileşenler. Son zamanlarda, 500 mM NaCl (ch500) 3 ile ekstrakte kromatin fraksiyonu üzerine enfeksiyon sonrası geç noktaları sırasında bu vRNP ihracat kompleksleri şeklinde keşfetmek için bu yöntem kullanılmıştır.
Protocol
Protokolünün şematik akış şeması Şek. 1 ve reaktifleri bir tablo aşağıda sunulmuştur.
1. Enfeksiyon (16 - 24 saat)
- Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM)-yüksek bunlar ertesi gün (yaklaşık 5 x 10 hücre 8) yaklaşık% 80 konfluent ulaşacak örneğin glikoz, orta, 5 mm 150 plastik hücre kültür tabaklarında HeLa hücreleri tohumu. Bu hücreler% 100 birbirine karışmış ulaşamamaktadır olması önemlidir.
- Ertesi gün, içine Strep-etiketli grip virüsü stoku seyreltik fosfat-tamponlu salin (PBS) içeren% 0.3 bovin (BSA) 3 arasında bir enfeksiyon çokluğu için serum albümini.
- Hücrelerinden büyüme medyumu kaldırmak, bir kez PBS ile yıkanır ve 10 ml PBS hücrelere virüs içeren ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile inkübe edilir.
- DMEM-yüksek glukoz ile enfeksiyon orta değiştirin ve 37 inkübasyon devam ° C
2. Subselüler Fraksiyonu (3 saat)
- Soğuk PBS ile bir defa yıkanır ve ardından hücreler bir lastik sıyırıcı ve 50 ml konik tüpe transferi ile soğuk PBS içerisinde askıya hücreleri.
- 1000 rpm'de 5 dakika boyunca bir masa üstü santrifüj ile ve daha sonra pelet hücreler PBS aspire.
- 10 ml soğuk sükroz tampon içinde Pastör pipetiyle hücre peleti (10 mM Hepes pH 7.9, 10 mM KCI, 2 mM Mg asetat (MgOAc), 3 mM CaCl2, 340 mM sukroz, 1 mM ditiyotreitol (DTT),% 1 proteaz inhibitörü karışımı) . Süspansiyon sonra, hücre kümeleri bozmak için bir 10 ml plastik pipet serum takılı bir 200 ul pipet aracılığıyla hücrelere geçerler.
- Buz üzerinde 10 dk inkübe edin. Yavaşça hücreleri tekrar süspansiyon periyodik ters.
- 15 sn için yüksek hızda% 0.5 ve girdaplı bir son konsantrasyon elde etmek Nonidet P-40 (NP-40) eklenir. Derhal bir masa üstü centrifu içinde 4 ° C'de 3.500 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjge.
- 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu sitoplazmik bölümüdür. Pelet orijinal hücre peleti daha küçük ve daha beyaz olmalıdır. Bütün fraksiyonlar 4 ° C'de en az 4 saat boyunca saklanabilir
- Adım 2,5 gibi 5 ml soğuk sükroz tampon, tekrar santrifüj ile pelet yıkanır ve süpernatant atılır.
- 1.5 ml soğuk nucleoplasmic ekstraksiyon tamponu (50 mM Hepes pH 7.9, 150 mM KOAc, 1,5 mM MgCl2,% 0.1 NP-40, 1 mM DTT,% 1 proteaz inhibitörü karışımı) içinde pelet (çekirdekler içeren) tekrar süspansiyon.
- Bir dar havaneli ile soğutulmuş, tamamen cam 4 ml Dounce Homojenizatör transfer ve 20 vuruş ile çekirdekleri homojenize.
Homojenizasyon sırasında köpük kaçının. Direnci yaklaşık 10 vuruş sonrası artırmalıdır. Verimli homojenleştirme bir faz kontrast mikroskop altında teyit edilebilir. - 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü homojenize çekirdekleri aktarın ve 4 dönen bir tekerlek üzerinde 20 dk inkübe °C.
- 10 dakika süre ile 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içinde 16,000 x g'de santrifüje.
- 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu nucleoplasmic bölümüdür.
- 1.5 ml sindirim tamponu (50 mM Hepes pH 7.9, 10 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT,% 1 proteaz inhibitörü karışımı, 100 U / ml Benzonase (RNA analizi için, 20 U / ml RNase ile ikame in Pastör pipetiyle pelet içermeyen Dnaz i)) 37 ön ° C'a ısıtılmış ve 37 'de 10 dakika inkübe ° C.
- 5 M NaCl 42 ul (150 mM NaCl nihai konsantrasyon) ekleyin ve 4 de 20 dakika daha inkübe ° C.
- 10 dakika süre ile 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içinde 16,000 x g'de santrifüje.
- 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu ch150 bölümüdür.
- Pastör pipetiyle pelet 1.5 ml soğuk yüksek tuz tamponu (50 mM Hepes pH 7.9, 500 mM NaCI, 1.5 mM MgCl2,% 0.1 NP-40, 1 mM DTT,% 1 proteaz inhibitörü karışımı) ve buz üstünde 20 dakika inkübe edilir.
- 16.000 az x g <santrifüjleyin/ Em> 10 dakika süre ile 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içerisinde.
- 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu ch500 bölümüdür.
3. Strep-etiket Arıtma (2 saat)
- Sitoplazmik fraksiyon (150 mM NaCl nihai konsantrasyon) ile 5 M NaCl 300 ul ekleyin.
- 15 ml konik tüp fraksiyon başına paketlenmiş Strep-Tactin Sepharose boncuk kısım 100 ul.
- Karıştırmak ve bir masa üstü, 1.000 x g hızında 5 dakika santrifüj tüpü, invert boncuklara Strep yıkama tamponu ile 10 hacim (20 mM Hepes pH 7.9, 150 mM NaCl (ch500 numuneler için 500 mM NaCl), 1 mM EDTA) ekleyin santrifüj.
- , Süpernatant atın iki kez adımı 3.3 tekrarlayın ve sonra Strep yıkama tamponu eşit hacmi boncuk pelletini.
- Her bir fraksiyon (nuceloplasmic için 1.5 ml'lik tüplere mikrosantrifüj, ch150 ve ch500 fraksiyonlar ve sitoplazmik fraksiyon için bir 15 ml konik tüpe) ile yıkanmış, Strep-Tactin boncuk bulamacın 200 ul ekleyin.
- Döndürmek4 at tüpleri 1s ° dönen bir tekerlek üzerinde C.
- Tüpler 4 az 1000 x g'de 1 dk ° C'de santrifüje Süpernatant atın.
- Her tüpe 1 ml soğuk Strep yıkama tamponu ekleyin. 15 ml tüp (sitoplazmik fraksiyonu) 1.5 ml tüp boncuk aktarın. 4 de, tüm tüpler 1 dk ° C, adım 3,7 gibi sonra santrifüj yıkanır. Iki kez bu yıkama işlemi tekrarlayın.
- Son yıkama adımdan sonra, düz bir pipet kullanarak yıkama tamponu tüm izlerini silmek. 100 ul yıkama tamponu (Strep yıkama tamponu 2.5 mM desthiobiotin içeren) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- Buz üzerinde 15 dk inkübe edin. Yavaşça tüplerin alt dokunarak bazen boncuk karıştırın.
- Santrifüj tüpünde 4 az 1000 x g'de 1 dk ° C de mikrosantrifüj. Süpernatant içeren Yıkanan Strep-etiketli vRNPs toplayın.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Fraksiyonasyon etkinliğinin en antib kullanılarak parçalandı lizatlarının Western blot analizi ile karar verilirSubselüler belirteçler (Şekil 2) için belirli bir odies. Spesifik olarak, başarılı bir çekirdek içi fraksiyonasyon nucleoplasmic içinde çok az veya hiç hücresel RNA polimeraz II (Pol II), ya da çözünebilen Nükleer fraksiyonu 4, ve en çok 150 mM NaCl 5 ile ekstre edilmelidir göstermelidir. Pol II'nin bir dejenerasyonu da tekrarlanabilir literatürde 6 ile tutarlıdır enfekte olmamış hücrelere, kıyasla influenza virüs ile enfekte olmuş hücrelerin içinde gözlenmiştir.
Şekil bir sitoplazmik eluat için gösterildiği gibi vRNPs saflaştırılması iyi, gümüş veya Coomassie boyama tarafından değerlendirilecektir. 3. Bizim deneyimlerimize göre, en Strep-PB2 tam şekillendirilmiş vRNP bir parçası olarak, yani biraz çözünür polimeraz yakalanır arınmışsa. Gümüş veya Coomassie boyama tarafından gözlemlenen PA/PB1/PB2 oranı: Bu yüksek NP yansır. Birkaç yerde RNases (örneğin, RNaz A gibi) dissosiyatif olarak böyle bir şekilde çatlatma viral RNA'nın bilinmektedir olarak daha düşük bir oran, RNases ile tampon kirlenme anlaşılacağıNP multimerleri 7 polimeraz yedik. İlginçtir, sadece Benzonase tedavisi, viral RNA sindirmek için yeterli iken, vRNP proteinlerin stokiyometrik oranları üzerinde hiçbir etkiye sahip olduğu görülmektedir. Bu fenomeni açıklamak değil de, biz bu Benzonase düşündüren diğer RNases (veriler gösterilmemiştir) ile sindirim sonrası vRNPs bozulması bazı önemli yapısal RNA bölgeleri bozulmadan bırakabilir gözlenmiştir. Sitoplazma ve nükleoplazmanın (nükleaz sindirim yapılmadan) gelen vRNPs saflaştırılması sonra, yüksek molekül ağırlıkları az 8 sönük ama farklı bantlar 8 grip genom segment tahmin molekül ağırlıkları karşılık gümüş boyama, (ref bakın. 3 ile takip edilebilir ).
9 saat, enfeksiyondan sonraki her fraksiyonda arındırılan vRNPs nispi miktarları Şekil 'de gösterilmiştir. 4. VRNPs dağılımı erken zaman noktalarında ch150 fraksiyonunda güçlü birikimi ile, enfeksiyon boyunca değişir veGeç zaman noktalarında nükleoplazmanın ve sitoplazma artmış birikimi.
Subselüler fraksiyonlama Şekil 1. Akış çizelgesi. Ref uyarlanmıştır. 3.
Şekil 2. Influenza virüsü ile enfekte hücrelerden Subselüler fraksiyonları Western blot analizi. 10 9 HeLa hücrelerinde hücre içi fraksiyon önce 9 saat influenza virüs suşu WSN ile enfekte edildi. Toplam protein Eşit miktarlarda her kulvarın yüklenen ve gösterilen antikorlar kullanılarak analiz edildi. RNA polimeraz II (Pol II) C-terminal alanı (hypophosphorylated bandı en önemli olduğu), her türlü tanır klonu 8WG16 kullanılarak tespit edildi. Ref uyarlanmıştır. 3.
Şekil 3.VRNPs saf gümüş leke analizi. HeLa hücreleri RWSN (negatif kontrol olarak) veya sitoplazmik fraksiyondan Strep saflaştırma takiben 9 saat boyunca RWSN-PB2-Strep ile enfekte edilmiştir. Asterisk RNaz sindirim sonra görünmez bantları ifade eder. Ref uyarlanmıştır. 3.
Şekil 4. Farklı hücresel fraksiyonları arınmış vRNPs Gümüş leke analizi. 10 9 HeLa hücrelerinde 9 RWSN PB2-Strep veya RWSN ile enfekte olan h Subselüler fraksiyon ve Strep arıtma izledi. Her fraksiyonu eluat Eşit miktarlarda yüklendi. Ref uyarlanmıştır. 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birçok çalışmada son zamanlarda bireysel protein ya da grip virüsü enfeksiyonu 8 katılan hücresel ağları tespit ederken, bu etkileşimlerin çoğunluğunun fonksiyonel önemi belirsizdir. Grip virüsü RNA sentezi ve çekirdeğinde 9 karmaşık biofiziksel ve biyokimyasal doğaya kromatin bazlı fonksiyonların mutlak bağımlılığı göz önüne alındığında, yeni teknikler bu fonksiyonları aydınlatmak için gerekli olacaktır. VRNPs bir afinite saflaştırma ile birleştiğinde biz burada mevcut çekirdek içi fraksiyon, daha önce ulaşılamayan önemli viral RNA fabrikaların karakterizasyonu sağlar.
Birçok protokol daha önce hücre içi fraksiyonasyon literatürde tarif edilmiştir. Biz bu geleneksel yöntemlerin en çekirdekten vRNPs erken kaçak neden olduğu görülmektedir, bir fenomen de Pol II 10 nitelendirdi. Düşük c ile ön-kabarmış hücrelerinin kısa bir inkübasyon kullanılarakzayıf deterjan, NP-40 oncentration, verimli plazma zarı lizis önemli nükleer sızıntı olmadan oluştu. İlginçtir, A549 ve HEK293T hücrelerin yerine hücre hatları hem de vRNPs güçlü nükleer sızıntı yol HeLa hücreleri kullanarak bizim Subselüler fraksiyon yerine. Yaklaşık% 0.2 NP-40 konsantrasyonu düşürücü bu konuda azaltılır, fakat bu hücre hatları, bazı değişkenliği nedeniyle, uygun koşullar ampirik olarak tespit edilir. Başka bir olası altermative gibi MDCK ya Vero hücreleri gibi insan olmayan, grip virüsü duyarlı hücre hatlarının kullanımıdır.
Bizim tuz çıkarımı protokolü genellikle düşük tuz konsantrasyonu ve / veya yüksek konsantrasyonlarda EDTA kullanan geleneksel kromatin ekstraksiyon işlemleri farklıdır. Bizim protokolü iki özel kesirler, bir Pol II-high/histone-low fraksiyonu ve karşılıklı içine kromatin ayırır. Bununla birlikte, diğer yöntemler de kromatin ekstraksiyon VRN bir afinite saflaştırma ile uyumlu olabilirPs. Protein-protein etkileşimleri ile karşılaştırıldığında en kromatin çıkarılması işlemlerinin DNA-protein etkileşimleri üzerine odaklanmıştır yana, yeni teknikler sıkı kromatin bağlı multi-protein komplekslerinin 11 ayıklamak için gereklidir.
Genel olarak, enfeksiyon virüsünün uzunluğu suşlara ve hücre çizgileri arasındaki farklılıklar bağlı deneysel olarak tespit edilir. Bir İçişleri Bakanlığı 3 at RWSN PB2-Strep suşu kullanarak, 3 ila 10 saat sonrası enfeksiyon değişen zaman noktalarında Subselüler fraksiyon gerçekleştirdik. Bizim deneyimlerimize göre, enfeksiyon az 3 saat yararlı Western blot analizi için çok az saflaştırılmış vRNPs verir, enfeksiyon güçlü sitopatik etkisi 3 saat sonuçları daha uzun ve kesirler bir sonraki miks yaparken.
Sağlam, sıkı kromatin bağlı viral kompleksleri izole yeteneği birçok olanaklar açılır. Bir Strep-etiketli PB2, diğer afinite etiket de kullanılabilir ve aynı zamanda yapılabilir trad ifade eden bir rekombinant virüs kullanılmıştır ikenitional immünopresipitasyon diğer viral proteinleri hedef. VRNPs bizim analizi, protein ve RNA bileşenlerinin özelliklerinin sınırlı iken Dahası, saflaştırılmış kompleksleri de in vitro deneyleri sentezi fonksiyonel gerçekleştirmek için kullanılabilir. Son olarak, çekirdek içi bölme ile kaba işlevsel tür halinde vRNPs ayrılması da verimli bir viral RNA'nın sentezi için gerekli olan 12,13 viral proteinlerin birkaç yakın-post-translasyon tarif modifikasyonların yakın çalışması izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar RWSN PB2-Strep virüs için Nada Naffakh ve Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | SERVA Electrophoresis | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | Thermo Fisher Scientific, Inc. | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type "B" pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).
