Summary
인플루엔자 바이러스는 호스트 세포 염색질과 협회들의 RNA 게놈을 복제. 여기서는 감염된 세포의 염색질에서 그대로 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스를 정화하는 방법을 제시한다. 바이러스 단지 투석을하는 것은 각각 서양 얼룩 및 단백질과 RNA 내용의 프라이머 확장명을 모두에 의해 분석할 수 있습니다.
Abstract
모든 부정적인 - 가닥 RNA 바이러스와 마찬가지로 인플루엔자 바이러스의 게놈은 단일 좌초된 게놈은 핵 단백질 (NP)에 의해 encapsidated, 그리고 구성된 trimeric 효소 복합과 연관된되는 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNP)의 형태로 패키지되어 PA, PB1, 그리고 PB2 subunits의. 그러나 대부분의 RNA 바이러스와는 달리, 인플루엔자 바이러스는 감염된 세포의 핵에 바이러스 RNA 합성을 수행합니다. 흥미롭게도, 바이러스성 mRNA 합성이 primers로 세포 사전 mRNAs를 사용하고,이 과정은 염색질 1 이루어지는 것이 제안되었습니다. 바이러스 중합 효소와 RNA 중합 효소 II 호스트뿐만 아니라, NP 및 호스트 nucleosomes 간의 상호 작용은 또한 1,2를 묘사하고있다.
최근 원 - Strep-태그를 인코딩 재조합 독감 바이러스의 세대 유전자가 바이러스 중합 효소의 PB2 subunit의 C-말단 (rWSN-PB2-Strep 3)로했습니다 융합실내는 설명했다. 이러한 재조합 바이러스가 감염된 세포에서 vRNPs 포함한 PB2 함유 단지,의 정화를 허용합니다. vRNPs 투석을 받기 위해서는, 세포 배양은 감염 및 vRNPs이 세포에서 파생된 lysates에서 정화 친화력 있습니다. 그러나 탁아소를 운영하는 용해 절차는 일반 nuclease의 존재에도 불구하고, 주로 inefficiently 염색질 바인딩된 자료를 추출 한 단계 세제 용해에 기반하고있다.
우리의 예비 작업은 핵 vRNPs의 많은 부분은 전통적인 세포 용해 동안 추출되지 않은 것을 제안, 따라서 친화력 정화 될 수 없었습니다. 이 추출 효율을 향상시키기 위해, 비 염색질 바인딩된 핵 vRNPs에서 염색질 표지인 분리, 우리는 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포 단계 현명한 subcellular 추출 프로토콜을 적응. 간단히,이 절차는 먼저 세포에서 핵을 분리하고 용해 핵 단백질 (여기서 "nucleoplasmic"분수 되나) 추출합니다.남은 불용성 핵 자료는 다음 Benzonase, 두 소금 추출 단계 뒤에 unspecific의 DNA / RNA nuclease로 소화된다 : 먼저 150 MM NaCl (이하 "ch150 '되나)를 사용하여 다음 500 MM NaCl ("ch500 ") (그림 1 ). 이러한 소금 추출 단계 500 밀리미터 NaCl 아직 여전히 친화 행렬에 태그를 vRNPs의 바인딩을 허용 핵 vRNPs의 85 % 이상 solubilize하기에 충분하다고 우리의 관찰을 바탕으로 선정되었습니다.
감염된 세포의 subcellular 분별화 후, 그것은 각각의 분획의 친화력 정화 PB2-태그를 vRNPs하는 것이 가능하고 단백질과 각각 서양 얼룩 및 프라이머 확장자를 사용하여 RNA 구성 요소를 분석합니다. 최근, 우리는 500 MM NaCl (ch500) 3 추출한 염색질 분획에서 감염 후 늦은 점 중 그 vRNP 수출 단지 양식을 발견하는이 방법을 활용.
Protocol
프로토콜의 개략도 순서도는 그림에 표시됩니다. 1과 시약의 테이블이 아래에 제공됩니다.
1. 감염 (16-24 H)
- Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM) - 높은들은 다음날 (약 5 X 10 8 셀) 약 80 %가 confluency 도달할 것이라는 등의 포도당 중간, 5 150mm 플라스틱 세포 배양 접시에 HELA 세포 밖으로 종자. 그것은 세포가 100 % confluency 도달하지 않는 것이 중요합니다.
- 다음 날에는로 Strep-태그가 인플루엔자 바이러스 주식을 희석 인산 버퍼 식염수 (PBS)가 포함된 0.3 % 소 (BSA) 3 감염의 다수에 대한 혈청 알부민.
- 세포 성장 매체를 제거 PBS로 한번 씻어, 10 ML PBS는 세포에 바이러스를 포함하는 추가합니다. 상온에서 1 H 동안 품어.
- DMEM 높은 포도당으로 감염 매체를 교체, 37에서 부화를 계속 ° C.
2. Subcellular 분별화 (3 H)
- 차가운 PBS로 한 번 세포를 씻어하고 고무 스크레이퍼와 50 ML 원뿔 튜브로 전송 차가운 PBS로 세포를 일시 중지합니다.
- 1,000 rpm으로 5 분 용 테이블 탑 원심 분리기에서 다음 펠렛 세포는 PBS를 기음.
- 10 ML 차가운 자당 버퍼의 Resuspend 세포 펠렛 (10 밀리미터 HEPES의 산도 7.9, 10 MM KCl, 2 밀리미터 MG 아세트산 (MgOAc), 3 MM CaCl 2, 340 밀리미터 자당, 1 ㎜ dithiothreitol (DTT), 1 % 테아제 억제제 믹스) . 정지 후, 세포 대단히 짧은 시간을 일부러 망치려고 10 ML 플라스틱 혈청의 피펫에 부착된 200 μl 피펫 팁을 통해 세포를 전달합니다.
- 얼음에 10 분 알을 품다. 부드럽게 세포를 resuspend하기 위해 주기적으로 바꾸란.
- 15 초위한 고속으로 0.5 %와 와동의 최종 농도로 Nonidet P-40 (NP-40)를 추가합니다. 즉시 테이블 상단 centrifu에서 4 ° C에서 3,500 XG에 10 분 동안 원심 분리기GE.
- 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 세포질 분획이다. 펠렛은 원래 세포 펠렛보다 작고 하얀이 있어야합니다. 모든 분수는 4 ° C.에 최소 4 H 위해 저장할 수 있습니다
- 단계 2.5에서와 같이 5 ML 차가운 자당 버퍼, 다시 원심 분리기에 펠릿 씻고 뜨는 버리고.
- 1.5 ML 차가운 nucleoplasmic 추출 완충액 (50 밀리미터 HEPES 산도 7.9, 150 MM KOAc, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 % NP-40, 1 밀리미터 DTT, 1 % 프로 테아제 억제제 믹스)에 펠렛을 (핵 포함) Resuspend.
- 꽉 끼는 유봉과 냉장, 전체가 유리로 4 ML 다운스 호모 지 나이저 편입 및 20 스트로크로 핵 homogenize.
균질화 동안 거품 마십시오. 저항은 약 10 스트로크 후에 증가한다. 효율적인 균질은 위상 대비 현미경으로 확인할 수 있습니다. - 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 균질 핵 전송과 4에서 회전 바퀴에서 20 분 품어 °C.
- 10 분 4 ° C에서 microcentrifuge에 16,000 X g에서 원심 분리기.
- 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 nucleoplasmic 분수입니다.
- 1.5 ML의 소화 버퍼 (50 밀리미터 HEPES 산도 7.9, 10 MM NaCl, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 1 밀리미터 DTT, 1 % 프로 테아제 억제제 믹스, 100 U / ML Benzonase (RNA 분석을위한, 20 U / ML RNase와 대용품에 Resuspend 펠릿 무료 DNase I)) 37에 미리 예열 ° C, 37시 10 분 품어 ° C.
- 5 M NaCl 42 μl를 (150 MM NaCl의 최종 농도)을 추가, 4시 20 분 추가 품어 ° C.
- 10 분 4 ° C에서 microcentrifuge에 16,000 X g에서 원심 분리기.
- 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 ch150 분수입니다.
- Resuspend 펠렛 1.5 ML 추위 높은 소금 버퍼 (50 밀리미터 HEPES의 산도 7.9, 500 MM NaCl, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 % NP-40, 1 밀리미터 DTT, 1 % 프로 테아제 억제제 믹스)와 얼음 속에서 20 분 알을 품다.
- 16,000에서 X G <을 원심 분리기/ em>는 10 분, 4 ° C에서 microcentrifuge 인치
- 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 ch500 분수입니다.
3. Strep-태그 정화 (2 H)
- 세포질 분획 (150 MM NaCl의 최종 농도의 경우)에 5 M NaCl 300 μl를 추가합니다.
- 15 ML 원뿔 튜브 분율 당 포장 Strep-Tactin 세파 로스 비즈의 나누어지는 100 μl.
- 믹스, 그리고 탁상 1,000 X g에서 5 분 원심 분리기하도록 튜브 반전, 구슬로 Strep 세척 버퍼 10 볼륨 (20 밀리미터 HEPES의 산도 7.9, 150 MM NaCl (ch500 샘플 500 MM NaCl), 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 추가 원심 분리기.
- , 뜨는을 삭제하시겠습니까 두번 단계 3.3 반복하고 Strep 세척 버퍼의 동일한 볼륨에 비드 펠렛을 resuspend.
- 각각의 분율 (nuceloplasmic위한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브, ch150, 그리고 ch500 분수와 세포질 분획을위한 15 ML 원뿔 튜브)로 형편없는 Strep-Tactin 비드 슬러리 200 μl를 추가합니다.
- 회전4에 튜브 1 시간 ° 회전 바퀴에서 C #.
- 튜브에게 4에 1000 X g에서 1 분 ° C를 원심 분리기 뜨는 폐기하십시오.
- 각 관 1 ML 추운 Strep 세척 버퍼를 추가합니다. 15 ML 튜브 (세포질 분획)에서 1.5 ML 관에 구슬을 전송합니다. 4 시에 튜브 1 분 ° C 단계 3.7에서와 같이 이후 centrifuging 씻으십시오. 두번 세차 단계를 반복합니다.
- 마지막 세척 단계 후, 플랫 피펫 팁을 사용하여 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다. 100 μl 용출 버퍼 (Strep 세척 버퍼 2.5 MM desthiobiotin를 포함)을 추가하고 가볍게 섞는다.
- 얼음에 15 분 알을 품다. 부드럽게 튜브의 바닥을 도청하여 가끔 구슬을 섞는다.
- 원심 분리기 튜브 4에 1000 X g에서 1 분 ° C microcentrifuge 인치 뜨는 포함된 eluted Strep-태그를 vRNPs를 수집합니다.
4. 대표 결과
분별화의 효율성을 최고의 antib을 사용 fractionated lysates의 서양 얼룩 분석에 의해 규정되는subcellular 마커 (그림 2) 특정 오디. 특히, 성공적인 subnuclear 분별화는 nucleoplasmic에서 거의 없거나 전혀없는 세포 RNA 중합 효소 II (폴 II) 또는 용해 핵 분획 4, 대부분의 150 MM NaCl 5 추출해야 표시해야합니다. 폴 II의 저하도 reproducibly 문학 6 일관성 감염되지 않은 세포에 비해 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포에서 관찰된다.
그림에서 세포질 eluate 위해 그림과 같이 vRNPs의 정화는 최고, 은색 또는 Coomassie 염색법에 의해 판단된다. 3. 우리의 경험에서, 대부분의 Strep-PB2는 완전하게 구성된 vRNP의 일환으로, 즉 약간 용해 효소 포로가되어로 정화된다. 은색 또는 Coomassie의 염색법으로 관찰 PA/PB1/PB2 비율 : 이것은 높은 NP에 반영됩니다. 여러 유비 쿼터스 RNases (예 : RNase 등) dissoci에 같은 방식으로 분열 바이러스성 RNA로 알려져있다으로 낮은 비율은 RNases와 버퍼 오염을 제안합니다NP multimers 7 효소를 먹었어요. 흥미롭게도, 혼자 Benzonase 치료는 바이러스 RNA를 소화하기에 충분하면서 vRNP 단백질 stochiometric 비율에 아무런 영향을 미치지 않습니다 것처럼 보인다. 우리가이 현상을 설명할 수는 없지만, 우리는 그 Benzonase 제안 기타 RNases (데이터가 표시되지 않음)과 소화 후에 vRNPs의 장애가 특정 구조적으로 중요한 RNA 영역을 그대로두고 있습니다 관찰했다. 세포질과 nucleoplasm (nuclease의 소화하지 않고 수행)에서 vRNPs 정화 후, 고분자 중량 8 희미하지만 이산 밴드는 8 인플루엔자 게놈 분야의 예측 분자 무게에 해당하는 실버 염색법, (심판을 참조하십시오. 3 관찰할 수있다 ).
9 H 포스트 감염에서 각 분획에서 정화 vRNPs의 상대적인 양의 그림에 표시됩니다. 4. vRNPs의 분포는 초기 시간 지점에서 ch150 분수의 강한 축적과 함께, 감염의 과정을 통해 다양하고,늦은 시간 지점에서 nucleoplasm 및 세포질에서 증가 축적.
subcellular 분별화의 그림 1. 플로우 차트. 심판에서 적응. 3.
그림 2. 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포에서 subcellular 분수의 서양 얼룩 분석. 10 9 HELA 세포는 subcellular 분별화 이전 9 H에 대한 인플루엔자 바이러스 스트레인 WSN에 감염되었다. 총 단백질 균등 금액이 각 레인에로드하고 표시된 항체를 사용하여 분석되었다. RNA 중합 효소 II는 (폴 II) C-말단 도메인 (hypophosphorylated 밴드가 가장 두드러진입니다) 모든 형태를 인식 클론 8WG16를 사용하여 감지되었습니다. 심판에서 적응. 3.
그림 3.vRNPs 투석의 실버 얼룩 분석. HELA 세포는 rWSN (마이너스 컨트롤) 또는 세포질 분획에서 Strep 정화 이어 9 H 용 rWSN-PB2-Strep, 감염되었다. 별표는 RNase의 소화 후 보이지 않는 밴드를 나타냅니다. 심판에서 적응. 3.
그림 4. 다른 세포 분수에서 정화 vRNPs의 실버 얼룩 분석. 10 9 HELA 세포가 9 rWSN-PB2-Strep 또는 rWSN 감염된 H는 subcellular 분별화 및 Strep 정화로 따라갔다. 각 분획에서 eluate의 균등 금액이로드되었습니다. 심판에서 적응. 3.
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Discussion
많은 연구가 최근에 각각의 단백질이나 인플루엔자 바이러스 감염 8 개입 셀룰러 네트워크를 확인하고 있지만, 이러한 상호 작용의 대부분의 기능 의미는 불분명 남아 있습니다. 독감 바이러스는 RNA 합성과 핵 9 복잡 biophysical 및 생화 학적 자연을위한 염색질 기반 기능의 절대적인 의존성을 감안할 때, 새로운 기술은 이러한 기능을 명료하게하다하셔야합니다. vRNPs의 친화력 정화와 결합 우리가 여기서 제시 subnuclear 분별화은, 이전에 액세스할 수있었습니다 중요한 바이러스성 RNA 공장의 특성화 수 있습니다.
많은 subcellular 분획화 프로토콜은 이전 문헌에 설명되어있다. 우리는 이러한 전통적인 방법의 대부분은 핵에서 vRNPs의 조기 유출로 이어질 것을 관찰, 현상은 또한 폴 II 10에 대해 설명했다. 낮은 C와 함께 사전에 치명적 전지의 짧은 부화를 사용함으로써약한 세제, NP-40의 oncentration은 효율적인 플라즈마 막 용해은 상당한 핵 유출없이 발생했습니다. 흥미롭게도, A549 및 HEK293T 세포보다는 세포 라인 모두에서 vRNPs의 강력한 핵 유출로 이끌었 HELA 세포를 사용하여 우리의 subcellular 분별화을 수행. 약 0.2 %로 NP-40 농도를 낮추면이 문제를 줄일 수 있지만, 이들 세포 라인의 일부 다양성으로 인해, 최적의 조건을 경험적으로 결정되어야합니다. 또 다른 가능한 altermative는 MDCK 또는 Vero 세포와 같은 비 인간, 인플루엔자 바이러스 감염될 세포 라인의 사용이다.
우리 소금 추출 프로토콜들은 종종 낮은 소금 농도 및 / 또는 높은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 농도를 사용하는 전통적인 염색질 추출 절차를 다릅니다. 우리의 프로토콜은 두 특정 분수, 폴포트 II-high/histone-low 분율과 그 상호로 염색질을 분리시킵니다. 그러나 다른 염색질 추출 방법도 vRN의 친화력 정화와 호환이 될 수 있습니다PS. 단백질 - 단백질 상호 작용에 비해 대부분의 염색질 추출 절차는 DNA-단백질 상호 작용에 초점을했기 때문에 새로운 기술이 밀접하게 염색질 바인딩된 다중 단백질 단지 11 추출해야합니다.
일반적으로 감염의 길이 바이러스 변종과 셀 라인 간의 차이로 인해 경험적으로 결정되어야합니다. 입니다만 3시 rWSN-PB2-Strep 변형 사용, 우리는 3에서 10 H 포스트 감염에 다양한 시간 지점에서 subcellular 분별화을 수행했습니다. 우리의 경험에 감염 미만 3 시에 유용 서양 얼룩 분석도 몇 정화 vRNPs를 얻을, 감염 강한 cytopathic 유효한 3 시에 결과 이상과 분수의 후속 혼합 잠시.
그대로, 단단히 염색질 바인딩된 바이러스 단지를 분리하는 기능은 몇 가지 가능성을 엽니다. 우리는 Strep는 태그가 추가된 PB2, 기타 친화 태그도 사용뿐만 아니라, 수 트라드을 표현 재조합 바이러스를 이용하는 동안itional immunoprecipitation은 다른 바이러스성 단백질을 대상으로. vRNPs 우리의 분석은 그들의 단백질과 RNA 구성 요소의 특성으로 제한하는 동안뿐만 아니라, 정제 단지도 체외 합성 assays에서 기능을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, subnuclear 분별화 통해 거친 기능성 종이로 vRNPs의 분리는 또한 효율적인 바이러스성 RNA 합성 12,13에 필요한 바이러스 단백질의 몇몇 최근에 설명된 사후 translational 수정의 가까이 연구를 허용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자 rWSN-PB2-Strep 바이러스 나다 Naffakh과 마리 앤 Rameix-Welti (Institut 파스퇴르)을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | SERVA Electrophoresis | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | Thermo Fisher Scientific, Inc. | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type "B" pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
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